一种基于磷钼掺杂介孔锆-卟啉MOFs纳米酶结合适配体快速检测食品中致病菌的方法与流程

一种基于磷钼掺杂介孔锆-卟啉mofs纳米酶结合适配体快速检测食品中致病菌的方法
技术领域
1.本发明涉及化学分析检测技术领域，具体为一种基于磷钼掺杂介孔锆-卟啉mofs纳米酶结合适配体快速检测食品中致病菌的方法。


背景技术：

2.食源性疾病每年导致50万人死亡，需要对食品进行有效的监测。世界卫生组织将控制食源性疾病作为工作目标和优先战略。大肠杆菌及沙门氏菌是最常见的食源性致病菌，可引起严重的疾病，包括感染、出血性结肠炎和溶血性尿毒综合征。它甚至可以导致死亡，特别是在年轻人、老年人和免疫功能低下的个体中。由大肠杆菌及沙门氏菌引起的食源性疾病暴发往往与被污染的食品和水有关。因此，除了有效的治疗外，快速、可靠地检测食源性致病菌对于解决公众健康和安全问题势在必行。其中用于各种各样基于适配体的生物传感器的研究已有相关报道；金属有机骨架材料（mofs）由于具有高孔隙率、大比表面积和多功能性的晶体结构而表现出优异的性能；同时，mofs的有机和无机杂化组分还可以赋予生物酶特殊的亲和性，从而在增强酶活性方面带来协同效应；作为一类高度稳定的mofs，zr基mofs对生物分子中的磷酸基团以及dsdna和ssdna具有高亲和力。与单离子mofs相比，双金属mofs通常具有较高的骨架水稳定性；适配体是dna或rna的单链寡核苷酸序列，对其靶标（全细胞、小分子和蛋白质）具有高度特异性和亲和力；此外，它们是通过指数富集的配体系统进化（selex）获得的；现已经有相关mofs基纳米酶结合适配体进行大肠杆菌及沙门氏菌检测的报道，但也存在检出限高，稳定性差的难题；本发明以苯甲酸为调节剂，四(4
ꢀ‑
羧基苯基)卟啉（tcpp）、四氯化锆（zrcl4）和磷钼杂多酸为原料制备通过一步溶剂热法制备磷钼掺杂介孔锆-卟啉mofs（pcn-pmos）材料，pcn-pmos具有过氧化物模拟酶活性，在h2o2存在下，氧化3,3
′
,5,5
′‑
四甲基联苯胺（tmb）产生蓝色ox-tmb，适配体与pcn-pmos表面的相互作用导致纳米酶的催化活性增加，加入大肠杆菌及沙门氏菌吸光度分别呈增加趋势，同时，通过加入nacl及mgcl2促进了 rna折叠并且稳定形成三级结构，致病菌浓度与氧化tmb吸光度增加呈稳定线性关系，一种高灵敏、选择性强致病菌快速检测新方法被建立，检出限均为 1 cfu/ml。将本方法应用于食品中致病菌检测分析，结果与食品安全国家标准食品微生物学检验测定方法相符。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种基于磷钼掺杂介孔锆-卟啉mofs纳米酶结合适配体快速检测食品中致病菌的方法，利用致病菌适配体复合物增强tmb氧化的效果，建立致病菌检测新方法。
4.一种基于磷钼掺杂介孔锆-卟啉mofs纳米酶结合适配体快速检测食品中致病菌的方法，包括以下步骤：
（1）分别将致病菌适配体与磷钼掺杂介孔锆-卟啉mofs纳米酶（pcn-pmos）在37℃恒温箱中孵育0.5-1h，制得纳米酶与适配体复合物；（2）分别在不同梯度浓度的致病菌中加入pcn-pmos的适配体复合物溶液以及na
+
和mg
2+
的混合溶液，在37℃恒温箱中孵育15-30 min，用tris-hcl缓冲（ph=7.4）定容至1.2 ml，然后加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺（tmb）溶液及h2o2，生成蓝色oxtmb，摇匀，静置5-10 min，在654 nm波长处测定吸光度，确定致病菌浓度与吸光度a之间的线性关系；（3）取含致病菌的待测样品液与纳米酶的适配体复合物溶液，加入nacl和mgcl2的混合溶液中混匀后，在37℃恒温箱中孵育15-30 min，用tris-hcl缓冲（ph=7.4）定容至1.2 ml，然后加入tmb溶液及h2o2，摇匀，静置5-10 min，在654 nm波长处测定吸光度，根据吸光度计算待测样品液中致病菌浓度；2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，pcn-pmos的制备如下：准确称取50-70 mg 四氯化锆（zrcl4），1.5-2.0 g 苯甲酸和80-100 mg磷钼酸溶于3-4 ml去离子水中，再加入15-20 ml dmf，超声处理15-20 min，接着将50-70 mg 四(4
ꢀ‑
羧基苯基)卟啉（tcpp）加入该溶液中，在室温下继续超声处理10
ꢀ‑
15 min，将该均相溶液转移至聚四氟乙烯高压反应釜中，加热至130-150℃反应24 h；反应完成后自然冷却至室温，产物在8000-10000 rpm下离心5-10 min，固体通过乙醇和dmf多次交替洗涤，真空干燥，得到pcn-pmos；所述致病菌包括大肠杆菌（e.coli，atcc 8099），沙门氏菌（salmonella，atcc 14028）和金黄色葡萄球菌（s.aureus，atcc 6538）；e.coli适配体序列为：ccggacgcttatgccttgccatctacagagcaggtgtgacgg，salmonella适配体序列为：ctgatgtgtgggtaggtgtcgttgatttcttctggtgggg，s.aureus适配体序列为：aacgaggcgcagggggagggggtggtacagataagatgggg。
5.所述的致病菌溶液的浓度为101–
10
5 cfu/ml；pcn-pmos与适配体溶液的体积比为5-8：1；pcn-pmos溶液浓度为2.0 mg/ml；适配体浓度为5.0-6.0 μmol/l；nacl浓度为50 mmol/l，mgcl2的浓度为10 mmol/l，nacl与mgcl2的混合溶液体积为30-50 μl；tmb浓度为10 mmol/l，体积20-50 μl；h2o
2 浓度为20 mmol/l，体积为20-50 μl；本发明的优点在于：1.本发明利用致病菌适配体复合物增强壳磷钼掺杂介孔锆-卟啉mofs（pcn-pmos）纳米酶的拟过氧化酶活性，pcn-pmos氧化tmb+ h2o2时，吸光度呈线性增加，由此建立了e.coli、salmonella及s.aureus快速、灵敏、选择性强检测新方法，方法具有灵敏度高、操作简便、特异性强特点；2、本发明制备的pcn-pmos纳米酶由于p、mo的引入，造成了材料的氧空位，导致模拟过氧化物酶活性增加，nacl及mgcl2的加入促进了dna折叠并且稳定形成三级结构，体系稳定性及检测重现性增强；3、适配体与致病菌特异结合，加强了检测的特异性，经在实际样品检测中结果表明，加标回收率达96%-101%，同时两种致病菌的检测限都为1 cfu/ml。
附图说明
6.图1为实施例1中pcn-pmos纳米酶的扫描电镜（sem）图；图2为实施例1中pcn-pmos纳米酶氧空位捕获效果图；
图3为实施例1中e.coli+适配体对pcn-pmos的拟过氧化酶增强氧化tmb的紫外-可见吸收光谱（a）及e.coli含量与吸光度之间的线性关系图（b）；图4为实施例1中salmonella+适配体对pcn-pmos的拟过氧化酶增强氧化tmb紫外-可见吸收光谱（a）及salmonella含量与吸光度之间的线性关系图（b）；图5为实施例1中s.aureus+适配体对pcn-pmos的拟过氧化酶增强氧化tmb紫外-可见吸收光谱（a）及s.aureus含量与吸光度之间的线性关系图（b）；图6为8种常见病原菌：李斯特菌（listeria），副溶血性弧菌（v. parahaemolyticus）、沙门氏菌（salmonella）、金黄色葡萄球菌（s. aureus）、铜绿假单胞菌（p. aeruginosa）、弗氏枸橼酸杆菌（c. freundii）、痢疾志贺菌（s. dysenteriae）和空肠弯曲菌（c. jejuni）对检测e.coli的影响结果；图7为8种常见病原菌：大肠杆菌（e.coli），李斯特菌（listeria），副溶血性弧菌（v. parahaemolyticus）、金黄色葡萄球菌（s. aureus）、铜绿假单胞菌（p. aeruginosa）、弗氏枸橼酸杆菌（c. freundii）、痢疾志贺菌（s. dysenteriae）和空肠弯曲菌（c. jejuni）对检测salmonella的影响结果；图8为8种常见病原菌：大肠杆菌（e.coli），沙门氏菌（salmonella）、李斯特菌（listeria），副溶血性弧菌（v. parahaemolyticus）、铜绿假单胞菌（p. aeruginosa）、弗氏枸橼酸杆菌（c. freundii）、痢疾志贺菌（s. dysenteriae）和空肠弯曲菌（c. jejuni）对检测s. aureus的影响结果。
实施方式
7.下面将结合具体的实施例对本发明的技术方案作进一步详细地描述说明，但本发明的保护范围并不仅限于此；实施例1：牛奶样品中e.coli及salmonella的测定1、pcn-pmos的制备：准确称取60 mg 四氯化锆（zrcl4），2.0 g 苯甲酸和100 mg磷钼酸溶于4 ml去离子水中，再加入20 ml dmf，超声处理20 min，接着将60 mg 四(4
ꢀ‑
羧基苯基)卟啉（tcpp）加入该溶液中，在室温下继续超声处理10-15 min，将该均相溶液转移至聚四氟乙烯高压反应釜中，加热至140℃反应24 h；反应完成后自然冷却至室温，产物在10000 rpm下离心8 min，固体通过乙醇和dmf多次交替洗涤，60℃真空干燥24h，得到pcn-pmos。pcn-pmos形貌（sem）如图1，从sem图中可以看出，合成材料有均匀立方体形状；2、edta为氧空位捕获剂，在0.5、1.0、1.5 μg/ml的edta加入100
ꢀµ
g/ml pcn-pmos 100 μl、10 mmol/l tmb 50
µ
l、50 mmol/l h2o
2 100
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l，4000 r/min离心处理15 min，取上层清液用紫外-可见分光光度计在654 nm处测量吸光度，结果见图2，随着edta浓度的增加，吸光度随之下降，表明pcn-pmos存在氧空位，氧空位的存在可提高表面氧气的吸附与活化，进而对底物的氧化有促进作用；3、适配体-pcn-pmos的制备：200 μl浓度为2.0 mg/ml的 pcn-pmos加入到25 μl的5.5 μmol/l e.coli nh
2-适配体（ph 7.0 tris-hcl缓冲溶液），salmonella-适配体或s.aureus-适配体中，在37℃恒温箱中孵育40 min，得到aptamer-fe3o4/pb@cs-cds；其中e.coli适配体序列为：ccggacgcttatgccttgccatctacagagcaggtgtgacgg，salmonella适配体序列为：ctgatgtgtgggtaggtgtcgttgatttcttctggtgggg，s.aureus适配体序列为：aacga
ggcgcagggggagggggtggtacagataagatgggg。
8.4、e.coli 、salmonella及s.aureus的工作曲线制作（1）e.coli 、salmonella及s.aureus培养：分别将e.coli 、salmonella及s.aureus菌株均在lb培养基中37℃培养12 h，3000 rpm离心5 min，用磷酸盐缓冲液（pbs, 10 mm, ph 7.4）洗涤菌体两次，获得对数生长期；（2）e.coli 、salmonella及s.aureus工作曲线制作：在5 ml具塞比色管中加入50
ꢀµ
l 适配体-pcn-pmos，不同浓度的e.coli 、salmonella及s.aureus菌悬液100 μl，加入30 μl 50 mmol/l nacl和10 mmol/l mgcl2的混合溶液，在37℃恒温箱中孵育15-30 min，用tris-hcl缓冲（ph=7.4）定容至1.2 ml，然后加入10 mmol/l tmb 50 μl，20 mmol/l的 h2o
2 20 μl，用ph 7.0 tris-hcl缓冲溶液定容至5 ml，摇匀，静置5-10 min，在654 nm波长处测定吸光度a，以e.coli 、salmonella及s.aureus浓度为横坐标，a为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程；见图3-5，得到回归方程、相关系数、相对标准偏差、线性范围等见表1；5、方法特异性考察：图6为8种常见病原菌（李斯特菌（listeria），副溶血性弧菌（v. parahaemolyticus）、沙门氏菌（salmonella）、金黄色葡萄球菌（s. aureus）、铜绿假单胞菌（p. aeruginosa）、弗氏枸橼酸杆菌（c. freundii）、痢疾志贺菌（s. dysenteriae）和空肠弯曲菌（c. jejuni））对e.coli检测体系的影响结果，e.coli浓度为10
2 cfu/ml，以上干扰物质浓度为10
3 cfu/ml，结果表明，仅有e.coli有明显的增强作用，其它病原菌几乎没有变化，方法具有好的选择特异性；图7为8种常见病原菌（大肠杆菌（e.coli），李斯特菌（listeria），副溶血性弧菌（v. parahaemolyticus）、金黄色葡萄球菌（s. aureus）、铜绿假单胞菌（p. aeruginosa）、弗氏枸橼酸杆菌（c. freundii）、痢疾志贺菌（s. dysenteriae）和空肠弯曲菌（c. jejuni）））对salmonella检测体系的影响结果，salmonella浓度为10
2 cfu/ml，以上干扰物质浓度为10
3 cfu/ml，结果表明，仅有salmonella有明显的增强作用，其它病原菌几乎没有变化，方法具有好的选择特异性；图8为8种常见病原菌（大肠杆菌（e.coli），李斯特菌（listeria），副溶血性弧菌（v. parahaemolyticus）、沙门氏菌（salmonella）、铜绿假单胞菌（p. aeruginosa）、弗氏枸橼酸杆菌（c. freundii）、痢疾志贺菌（s. dysenteriae）和空肠弯曲菌（c. jejuni））对s. aureus检测体系的影响结果，s. aureus浓度为10
2 cfu/ml，以上干扰物质浓度为10
3 cfu/ml，结果表明，仅有s. aureus有明显的增强作用，其它病原菌几乎没有变化，方法具有好的选择特异性；6、牛奶样品中e.coli 、salmonella及s.aureus的测定（1）样品处理：取5 ml牛奶样品于10℃、7000
×
g离心10 min，去除上层奶油，将牛奶样品用蒸馏水按1∶20比例稀释，过0.45 μm滤膜；（2）样品测定：在5 ml具塞比色管中加入50
ꢀµ
l适配体-pcn-pmos，加入100
ꢀµ
l上述处理过的牛奶样品，加入30 μl 50 mmol/l nacl和10 mmol/l mgcl2的混合溶液，在37℃恒温箱中孵育15-30 min，用tris-hcl缓冲（ph=7.4）定容至1.2 ml，然后加入10 mmol/l tmb 50 μl，20 mmol/l的 h2o
2 50 μl，用ph 7.0 tris-hcl缓冲溶液定容至5 ml，摇匀，静置5-10 min，在654 nm波长处，测定吸光度a，代入步骤4回归方程，样品中e.coli 、salmonella及s.aureus未检出；（3）回收率与精密度实验：通过对牛奶样品中e.coli 、salmonella及s.aureus的加标定量，验证所构建生物传感器的可行性。分别在牛奶样品中加入3个不同浓度的e.coli
及salmonella，除用缓冲液稀释外，不经任何预处理直接测定，同时通过标准平板计数法进行测定，结果见表2；测得e.coli 、salmonella及s.aureus的加标回收率在96.1％～103.2％，rsd在1.1％～4.5％，本方法有好的的准确性和精密度，与金标法相差无几；表1线性方程、相关系数、相对标准偏差、线性范围
目标物工作曲线相关系数（r2）线性范围cfu/mlrsd%(n=3)lodcfu/mle.coliy=9.062
×
10-6
x+0.0330.99910~1052.21salmonellay=7.022
×
10-6
x+0.2550.99410~1051.61s.aureusy=8.885
×
10-6
x+0.2320.99010~1053.41
表2 样品加标回收率及rsd（n = 3）注：回收率及rsd，本法测定/平板计数测定。

技术特征：
1.一种基于磷钼掺杂介孔锆-卟啉mofs纳米酶结合适配体快速检测食品中致病菌的方法，包括以下步骤：（1）分别将致病菌适配体与磷钼掺杂介孔锆-卟啉mofs纳米酶（pcn-pmos）在37℃恒温箱中孵育0.5-1h，制得纳米酶与适配体复合物；（2）分别在不同梯度浓度的致病菌中加入pcn-pmos的适配体复合物溶液以及na
+
和mg
2+
的混合溶液，在37℃恒温箱中孵育15-30 min，用tris-hcl缓冲（ph=7.4）定容至1.2 ml，然后加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺（tmb）溶液及h2o2，生成蓝色oxtmb，摇匀，静置5-10 min，在654 nm波长处测定吸光度，确定致病菌浓度与吸光度之间的线性关系；（3）取含致病菌的待测样品液与纳米酶的适配体复合物溶液，加入nacl和mgcl2的混合溶液中混匀，在37℃恒温箱中孵育15-30 min，用tris-hcl缓冲（ph=7.4）定容至1.2 ml，然后加入tmb溶液及h2o2，摇匀，静置5-10 min，在654 nm波长处测定吸光度，根据吸光度计算待测样品液中致病菌浓度。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，pcn-pmos的制备如下：准确称取50-70 mg 四氯化锆（zrcl4），1.5-2.0 g 苯甲酸和80-100 mg磷钼酸溶于3-4 ml去离子水中，再加入15-20 ml dmf，超声处理15-20 min，接着将50-70 mg 四(4
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羧基苯基)卟啉（tcpp）加入该溶液中，在室温下继续超声处理10-15 min，将该均相溶液转移至聚四氟乙烯高压反应釜中，加热至130-150℃反应24 h。反应完成后自然冷却至室温，产物在8000-10000 rpm下离心5-10 min，固体通过乙醇和dmf多次交替洗涤，真空干燥，得到pcn-pmos。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述致病菌包括大肠杆菌（e.coli，atcc 8099），沙门氏菌（salmonella，atcc 14028）和金黄色葡萄球菌（s.aureus，atcc 6538）；e.coli适配体序列为：ccggacgcttatgccttgccatctacagagcaggtgtgacgg，salmonella适配体序列为：ctgatgtgtgggtaggtgtcgttgatttcttctggtgggg，s.aureus适配体序列为：aacgaggcgcagggggagggggtggtacagataagatgggg。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的致病菌溶液的浓度为101–
10
5 cfu/ml；pcn-pmos与适配体溶液的体积比为5-8：1；pcn-pmos溶液浓度为2.0 mg/ml；适配体浓度为5.0-6.0 μmol/l；nacl浓度为50 mmol/l，mgcl2的浓度为10 mmol/l，体积30-50 μl；tmb浓度为10 mmol/l，体积20-50 μl；h2o
2 浓度为20 mmol/l，体积为20-50 μl。

技术总结
本发明涉及化学分析检测技术领域，具体为一种基于磷钼掺杂介孔锆-卟啉MOFs纳米酶结合适配体快速检测食品中致病菌的方法。本发明以苯甲酸为调节剂，四(4-羧基苯基)卟啉（TCPP）、四氯化锆（ZrCl4）和磷钼杂多酸为原料制备通过一步溶剂热法制备磷钼掺杂介孔锆-卟啉MOFs（PCN-PMos）材料，PCN-PMos具有过氧化物模拟酶活性，在H2O2存在下，氧化3,3


技术研发人员：杨亚玲 李秋兰 杨德志
受保护的技术使用者：云南伦扬科技有限公司
技术研发日：2023.05.25
技术公布日：2023/7/22