贝壳杉提取物在制备抗腹主动脉瘤的产品中的应用

elastase，ppe)诱导的腹主动脉瘤。
10.本发明还提供了贝壳杉提取物在下述至少一项中的应用：
11.1)在制备抑制腹主动脉弹力板破裂的产品中的应用；
12.2)在制备抑制腹主动脉血管壁炎症细胞浸润的产品中的应用；
13.具体的，所述炎症细胞可为巨噬细胞和/或白细胞；
14.3)在制备抑制腹主动脉血管壁中炎症因子表达的产品中的应用；
15.具体的，所述炎症因子可为白细胞介素6(interleukin-6，il-6)、单核细胞趋化因子-1(monocyte chemotactic protein 1，mcp-1)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα，tnf-α)、il-1β和il-18；
16.4)在制备抑制腹主动脉血管壁基质金属蛋白酶表达的产品中的应用；
17.具体的，所述基质金属蛋白酶可为基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，mmp9)；
18.5)在制备抑制腹主动脉血管壁炎症通路激活的产品中的应用；
19.具体的，所述炎症通路可为核因子κb(nuclear factorκb，nf-κb)和nod样受体热蛋白结构域相关蛋白3(nod-like receptor thermal protein domain associated protein 3，nlrp3)炎症小体通路；
20.6)在制备抑制血管平滑肌细胞基质金属蛋白酶表达的产品中的应用；
21.具体的，所述基质金属蛋白酶可为mmp9；
22.7)在制备抑制血管平滑肌细胞炎症因子表达的产品中的应用；
23.具体的，所述炎症因子可为il-6、mcp-1、il-1β和il-18；
24.8)在制备抑制血管平滑肌细胞炎症通路激活的产品中的应用；
25.具体的，所述炎症通路可为nf-κb和nlrp3炎症小体通路。
26.上述的应用中，所述贝壳杉提取物的活性成分包括南洋杉酮(araucarone，ao)，其结构式为如下所示：
[0027][0028]
上述的应用中，所述贝壳杉提取物为贝壳杉的乙醇水溶液提取物。
[0029]
具体的，所述乙醇水溶液中乙醇的体积分数为60％～100％；具体可为95％。
[0030]
本发明中所述贝壳杉提取物可按照现有公开的方法进行制备。
[0031]
如可参考下述方法进行制备：将贝壳杉根茎干燥、粉碎后，用乙醇水溶液浸泡，加热至微沸状态，进行回流提取，收集提取液，浓缩、干燥，得到所述贝壳杉提取物。
[0032]
所述浸泡的时间可为1h；所述回流提取至少进行1次，优选进行3次；每次回流提取的时间为1～2h。
[0033]
上述的应用中，所述产品为药物或药物制剂。
[0034]
所述药物可通过注射、口服、喷射、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。
[0035]
需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体制成药物制剂。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。
[0036]
所述药物可以制成注射液、悬浮剂、粉剂、片剂、颗粒剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
[0037]
本发明采用与临床相关的aaa模型：猪胰腺弹力蛋白酶诱导的小鼠aaa。实验证明，将贝壳杉提取物灌胃或腹腔注射，能明显抑制弹力蛋白酶诱导的小鼠aaa的发生发展。
[0038]
本发明提供的抗aaa的药品安全、低毒，药理作用较强；其原料来源丰富，可从贝壳杉植物中提取得到；本发明为预防、诊断、检测、保护、治疗和研究腹主动脉瘤提供了一种新的药物来源，且容易推广应用，能够在较短的时间内产生巨大的社会效益和经济效益。
附图说明
[0039]
图1为贝壳杉提取物(ad)抑制tnf-α诱导的血管平滑肌细胞中炎症因子表达和mmp9的激活。
[0040]
图2为ad 100mg/kg/day灌胃抑制猪胰腺弹力蛋白酶(ppe)诱导的小鼠腹主动脉瘤。
[0041]
图3南洋杉酮(ao)抑制tnf-α诱导的血管平滑肌细胞中炎症因子表达和mmp9的激活。
[0042]
图4为ao 100mg/kg/day灌胃抑制ppe诱导的小鼠腹主动脉瘤。
[0043]
图5为ad/ao 50mg/kg/day腹腔注射抑制ppe诱导的小鼠腹主动脉瘤。
[0044]
图6为ad/ao 100mg/kg/day灌胃抑制ppe诱导的小鼠腹主动脉血管早期炎症期炎症因子和mmp9的上调。
[0045]
图7为ad/ao抑制tnf-α诱导的平滑肌细胞和ppe诱导的腹主动脉血管组织中nf-κb/nlrp3炎症通路的激活。
具体实施方式
[0046]
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0047]
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0048]
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0049]
下述实施例中所述百分数均为质量百分数，另有说明的除外。
[0050]
下述实施例所用猪胰腺弹力蛋白酶购自sigma-aldrich，货号为e1250。
[0051]
下述实施例中，ad或ao的溶剂为0.5％(m/v)的羧甲基纤维素钠，羧甲基纤维素钠的溶剂为0.9％生理盐水。
[0052]
下述实施例中的定量试验，均设置3-6次重复实验，结果取平均值。
[0053]
实施例1、贝壳杉提取物(ad)及其单体的制备
[0054]
1、贝壳杉提取物的制备
[0055]
干燥、粉碎的贝壳杉根粉末(367g)，放入3.0l的圆底烧瓶中，加入95％(v/v)乙醇2.5l浸泡1h后，加热至微沸状态，加热回流提取2h，提取液趁热过滤。药渣再用95％(v/v)乙醇2.0l加热回流提取2次，每次1.5h。合并滤液，旋转蒸发仪浓缩、真空干燥、称重，得到贝壳杉提取物105.3g(提取率：28.7％)。
[0056]
2、单体的制备
[0057]
取上述制备的贝壳杉提取物(100.0g)，加1.0l的水混悬，用二氯甲烷进行萃取，每次萃取剂用量1.0l，萃取3次，合并萃取液，得到二氯甲烷层萃取物34.0g。
[0058]
二氯甲烷层萃取物(34g)按1：2的质量比用硅胶(青岛海洋化工，300～400目柱层析硅胶；货号：2.003447f6)拌样，上到柱体积为3.3l的硅胶柱层析进行纯化，依次用二氯甲烷、二氯甲烷/甲醇进行梯度洗脱，洗脱梯度为纯二氯甲烷、二氯甲烷/甲醇50：1、20：1、10：1、5：1、2：1、1：1，纯甲醇(v/v)，每个梯度6l。随后依据薄层层析结果，合并相同组分，共得到22个流份。将1号流份(4.4g)拌入7.0g硅胶中，上样至硅胶柱(柱体积261ml)，分别用石油醚、石油醚/乙酸乙酯洗脱，洗脱梯度为石油醚(600ml)、石油醚/乙酸乙酯(v/v)30：1、20：1、10：1、5：1、4：1、3：1、2：1、1：1(每个梯度各400ml)。用薄层色谱法合并相同流份，得到9个子流份(a～i)。子流份h于室温重结晶得到单体化合物。
[0059]
采用hplc法检测单体的纯度，其纯度＞95％。检测条件如下：
[0060]
流动相：乙腈100％；流速：1ml/min；色谱柱：welch ultimate xb-c18(250mm
×
4.6mm i.d.，5μm)；柱温：40℃；检测波长：254nm，210nm。
[0061]
利用质谱、核磁共振谱对该化合物的结构进行鉴定。
[0062]
化合物1，esi-ms m/z 301[m+h]+，1h-nmr(cdcl3,600mhz)δh:5.50
[0063]
(1h,m),4.40(2h,s),3.26(1h,br.s),2.70(1h,td,j＝14.6,5.3hz),2.29(1h,br.d,j＝11.5hz),2.27(1h,dt,j＝14.7,3.8hz),2.14(1h,m),2.12(1h,m),2.10(1h,m),1.94(1h,m),1.75(1h,br.dd,j＝6.2,3.1hz),1.73(1h,m),1.68(1h,m),1.63(1h,td,j＝12.8,3.7hz),1.56(1h,dd,j＝12.2,4.1hz),1.50(1h,td,j＝13.9,4.0hz),1.45(1h,qd,j＝12.5,4.2hz),1.14(3h,s),1.10(6h,s),1.07(3h,s)；
[0064]
13c-nmr(cdcl3,151mhz)δc:216.5,214.9,133.3,123.3,64.1,51.5,50.7,47.4,45.9,41.7,38.0,35.3,34.6,32.5,25.6,23.9,22.6,19.5,18.9,14.8。
[0065]
将该化合物命名为南洋杉酮(araucarone，ao)，其结构式如下：
[0066][0067]
实施例2、贝壳杉提取物及单体南洋杉酮的药效学试验
[0068]
1.实验材料
[0069]
1.1实验动物
[0070]
实验所用小鼠为平均体重20～25g的雄性c57bl/6j小鼠，购自北京大学医学部实验动物中心，遵循实验室动物护理原则(nih出版号85-23，修订版1996)，并且实验方案得到北京大学医学部动物伦理委员会的批准(批准号：la2021045)：所有小鼠在12小时光照/12小时黑暗循环下饲养，自由获取食物和水。
[0071]
1.2动物饲料
[0072]
动物繁殖饲料为商品化供应的啮齿类动物用普通饲料。
[0073]
2.体内实验方法
[0074]
2.1猪胰腺弹力蛋白酶诱导小鼠肾下段腹主动脉瘤模型
[0075]
采用8周龄的雄性c57bl/6j小鼠，腹腔注射4％水合氯醛(m/v，按照体重注射，8μl/g)麻醉。分离小鼠肾动脉至髂动脉间的腹主动脉段。将用猪胰腺弹力蛋白酶(ppe)原液滴加40μl润湿的纱布包裹住血管，孵育1h后，取下纱布，用pbs冲洗掉多余的猪胰腺弹力蛋白酶。用0.9％生理盐水润湿的纱布包裹血管1h后，取下纱布，用pbs冲洗，作为nacl孵育对照组。
[0076]
2.2贝壳杉提取物抗腹主动脉瘤的药效作用(灌胃给药)
[0077]
将雄性c57bl/6j小鼠随机均分为对照组(6只)、对照药物处理组(100mg/kg/day ad，6只)、弹力蛋白酶造模组(6只)、弹力蛋白酶造模同时贝壳杉提取物(100mg/kg/day ad，6只)灌胃给药组。预给药2天，对照组和弹力蛋白酶造模组每天灌胃相同体积的0.5％羧甲基纤维素钠，对照药物处理组和弹力蛋白酶造模同时药物处理组每天灌胃100mg/kg ad(ad配成浓度为12.5mg/ml的混悬液给药，溶剂为0.5％的羧甲基纤维素钠)。在第3天给药后进行手术。手术后每天灌胃给药一次，造模14天后，处死动物取材。
[0078]
2.3南洋杉酮(ao)抗腹主动脉瘤的药效作用(灌胃给药)
[0079]
将雄性c57bl/6j小鼠随机均分为对照组(6只)、弹力蛋白酶造模组(6只)、弹力蛋白酶造模同时南洋杉酮(100mg/kg/day ao，6只)灌胃给药组。预给药2天，对照组和弹力蛋白酶造模组每天灌胃相同体积的0.5％羧甲基纤维素钠，弹力蛋白酶造模同时南洋杉酮灌胃给药组每天灌胃100mg/kg ao(ao配成浓度为12.5mg/ml的混悬液给药，溶剂为0.5％的羧甲基纤维素钠)。在第3天给药后进行手术。手术后每天灌胃给药一次，造模14天后，处死动物取材。
[0080]
2.4贝壳杉提取物(ad)及南洋杉酮(ao)抗腹主动脉瘤的药效作用(腹腔注射)
[0081]
将雄性c57bl/6j小鼠随机均分为：对照组(6只)、弹力蛋白酶造模组(6只)、弹力蛋白酶造模同时南洋杉酮(50mg/kg/day ao，6只)腹腔注射给药组和弹力蛋白酶造模同时贝壳杉提取物(50mg/kg/day ad，6只)腹腔注射给药组。预给药2天，对照组和弹力蛋白酶造模组每天注射相同体积的0.5％羧甲基纤维素钠，弹力蛋白酶造模同时南洋杉酮腹腔注射给药组和弹力蛋白酶造模同时贝壳杉提取物腹腔注射给药组每天腹腔注射50mg/kg ao或贝壳杉提取物ad(ao或ad配成浓度均为6.25mg/ml的混悬液给药，溶剂为0.5％的羧甲基纤维素钠)。在第3天给药后进行手术。手术后每天给药一次，造模14天后，处死动物取材。
[0082]
2.5贝壳杉提取物(ad)及南洋杉酮(ao)抑制血管炎症的作用
[0083]
将雄性c57bl/6j小鼠随机均分为对照组、弹力蛋白酶造模组、弹力蛋白酶造模同时南洋杉酮(100mg/kg/day ao)灌胃给药组和弹力蛋白酶造模同时贝壳杉提取物(100mg/kg/day ad)灌胃给药组。预给药2天，对照组和弹力蛋白酶造模组每天灌胃相同体积的
0.5％羧甲基纤维素钠，弹力蛋白酶造模同时南洋杉酮灌胃给药组每天灌胃100mg/kg ao，弹力蛋白酶造模同时贝壳杉提取物灌胃给药组每天灌胃100mg/kg ad(ao或ad配成浓度均为12.5mg/ml的混悬液给药，溶剂为0.5％的羧甲基纤维素钠)。在第3天给药后进行手术。手术后每天灌胃给药一次，造模3天后，处死动物取材。
[0084]
2.6动物操作
[0085]
2.6.1采集小鼠血清
[0086]
小鼠麻醉后取血约600μl，37℃孵育30min，用离心机4000rpm室温离心30min，取上层血清，冻存于-30℃冰箱备用。
[0087]
2.6.2小鼠取材
[0088]
称取小鼠体重，记录体重值。过量麻醉处死后，大头针固定于解剖盘(塑料泡沫盒)中。切开小鼠皮肤及皮下薄膜，暴露出内脏各器官，心脏取血。经心脏磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution，pbs)灌流后，用剪刀和镊子分离小鼠从心脏至髂动脉处的完整主动脉，留取形态学观察的血管组织使用4％多聚甲醛(m/v，溶剂为pbs)固定过夜，之后转入20％蔗糖。血管经精细分离外周结缔组织后，脱水、固定、包埋后制备冰冻切片，用于he以及evg染色，判断血管损伤以及弹力板断裂程度。留取提rna或蛋白的主动脉则不经固定，pbs灌流后直接在解剖显微镜下分离出腹主动脉肾下段，取下后冻存于-80℃冰箱备用。
[0089]
3.体外实验方法
[0090]
3.1原代大鼠血管平滑肌细胞的培养与体外细胞炎症模型的建立。
[0091]
3.1.1原代大鼠血管平滑肌细胞的提取
[0092]
准备3只150g左右的雄性sprague-dawley大鼠，麻醉处死大鼠后，迅速打开胸腔，分离大鼠主动脉弓至膈肌部位的胸主动脉血管。用预冷的pbs洗去残留的血液，用镊子轻轻刮去血管外的脂肪及结缔组织。剪开血管，轻轻刮去内膜，再撕下血管中膜层。将血管中膜剪碎后，放入3ml含1mg/ml的ⅱ型胶原酶(购自gibco，货号为17101015)的达尔伯克(氏)改良伊格尔(氏)培养基(dulbecco's modified eagle medium，dmem)中，在37℃、5％co2(v/v)的孵箱中消化3h。1500g离心15分钟，含10％胎牛血清的dmem(v/v)，又称为完全培养基，重悬后，将细胞接种于培养皿中，静置培养3天后，换液。将第4～6代的细胞用于实验。
[0093]
3.1.2体外血管平滑肌细胞炎症模型的建立
[0094]
(1)原代大鼠血管平滑肌细胞40万细胞每孔(vascular smooth muscle cell，vsmc)接种于6孔板，加入1ml dmem完全培养基，培养至细胞贴壁。
[0095]
(2)然后将dmem完全培养基换成1ml无血清dmem培养基饥饿24h后，再替换为1ml含100ng/ml tnf-α的dmem完全培养基(tnf-α用无菌水稀释，母液浓度为10μg/ml)刺激24h(用于提取rna)或48h(用于提取蛋白质)；对照组及模型组培养基中同时给予相同体积的二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide，dmso)，实验组同时给予ad或ao，ad或ao用dmso配成母液浓度分别为25mg/ml和25mmol/l溶液给药，使用时将母液1μl加入1ml dmem完全培养基中充分混匀；培养条件均是在37℃、相对湿度90％、co2浓度5％(v/v)的孵箱内孵育。
[0096]
(3)细胞去除培养基，pbs洗涤细胞3次，每孔加入1ml rna提取试剂(trizol)用于提取rna或加入50μl蛋白裂解液用于蛋白提取及western blot。
[0097]
3.2mtt实验
[0098]
(1)收集对数生长期的血管平滑肌细胞。
[0099]
(2)调整细胞悬浮液的浓度：在超净台里，用酒精将细胞计数板和盖玻片擦洗干净，取细胞悬浮液20μl，用枪头抵住盖玻片一侧的中间部位打入计数板中。在低倍镜视野下，数位于四个方角的4个大方格内的细胞，求平均值。悬浮液中的细胞浓度即为：平均值
×
104(个/ml)。96孔板每个孔接种的细胞数目为1
×
104个(每个孔加100μl)，用dmem完全培养基来调整细胞悬浮液的浓度。
[0100]
(3)按实验需求分组：调零组(不含细胞)、对照组、给药组(设6个平行孔)。
[0101]
(4)将96孔板在37℃孵箱内(相对湿度90％，co2浓度5％，v/v)孵育，至细胞完全贴壁，用空白dmem培养基(不含fbs)饥饿24h之后，换成含有不同浓度药物的完全dmem(含有10％ fbs，v/v)，继续孵育48h。ad或ao用dmso配成不同浓度的溶液处理细胞。
[0102]
(5)终止培养，吸弃培养液，每孔加入5.0g/l的四甲基偶氮唑盐(3-2,5-diphenyl-2-h-tetrazolium bromide，mtt)溶液20μl，于37℃细胞培养箱中再培养4h。
[0103]
(6)4h后吸去上清(注意不要吸走孔底的紫色结晶)。每孔加入150μl的dmso，并放入酶标仪，振板10min，使蓝色结晶甲臜完全溶解，然后在540nm波长处测吸光值，按以下公式计算出细胞存活率：
[0104]
细胞存活率＝(给药组-调零组)/(对照组-调零组)
[0105]
3.3贝壳杉提取物抑制vsmc细胞炎症的药效作用
[0106]
vsmc接种于六孔板，密度调整为2
×
105个/ml，用1ml每孔的含10％(v/v)fbs的dmem培养至贴壁，再用1ml每孔的无血清的dmem饥饿细胞24h。用1ml每孔含有100ng/ml tnf-α(tnf-α用无菌水稀释，母液浓度为10μg/ml)的完全dmem(含有10％ fbs，v/v)培养vsmc，给药组在tnf-α刺激的同时给予25μg/ml贝壳杉提取物(ad)或25μmol/l南洋杉酮(ao)在培养箱中孵育(37℃，相对湿度90％，co2浓度5％(v/v))。培养24h(用于提取rna)或48h(用于提取蛋白质)后收集细胞，用于检测炎症因子表达、mmp9表达和nf-κb、nlrp3通路激活。ad或ao用dmso配成浓度分别为25mg/ml和25mmol/l的母液后再加入细胞培养液中。
[0107]
4.实验结果：
[0108]
1.贝壳杉提取物(ad)抑制tnf-α诱导的血管平滑肌细胞炎症因子表达和mmp9活化
[0109]
图1中的a为不同浓度ad处理血管平滑肌细胞48h的细胞存活率试验；由此可知，在100μg/ml的浓度范围内，ad的细胞安全性较好。
[0110]
图1中的b-e分别为100ng/ml tnf-α处理24h，同时用25μg/ml ad处理，细胞中il-6、mcp-1、il-1β和il-18的相对基因表达水平。由此可知，ad可显著抑制tnf-α诱导的血管平滑肌细胞的炎症反应，从而减轻平滑肌细胞炎症损伤。
[0111]
图1中f为100ng/ml tnf-α处理24h，同时用25μg/ml ad处理，细胞中mmp9的相对基因表达水平。由此可知，ad可显著抑制tnf-α诱导的血管平滑肌细胞中mmp9的mrna表达水平的上调，从而抑制细胞外基质成分降解。
[0112]
图1中的g和h分别为100ng/ml tnf-α处理48h，同时用25μg/ml ad处理，细胞中mmp9的蛋白表达的代表性条带和定量结果。由此可知，ad可显著抑制tnf-α诱导的血管平滑肌细胞中mmp9的蛋白表达上调，从而抑制细胞外基质成分降解。
[0113]
图1中的i和j分别为100ng/ml tnf-α处理24h，同时用25μg/ml ad处理，细胞中timp1和timp2的相对基因表达水平。由此可知，ad可显著上调tnf-α诱导的血管平滑肌细胞
中timp1/2的表达，进而抑制细胞外基质降解。
[0114]
图1中的k和l分别为100ng/ml tnf-α处理48h，同时用25μg/ml ad处理，明胶酶谱检测细胞培养基上清中mmp9活性的代表性条带和定量结果。由此可知，ad可显著抑制tnf-α诱导的血管平滑肌细胞中mmp9酶活性的上调，从而抑制细胞外基质成分降解。
[0115]
2.贝壳杉提取物(ad)灌胃给药抑制ppe诱导的小鼠腹主动脉瘤
[0116]
图2中的a为动物实验流程图。100mg/kg/day ad预灌胃2天后，第3天灌胃后进行aaa造模手术。术后每天继续灌胃给药，14天后进行取材。
[0117]
图2中的b和c分别为小鼠腹主动脉大体照片和腹主动脉肾下段最大直径统计，结果表明ad灌胃给药可显著抑制ppe诱导的小鼠腹主动脉扩张。
[0118]
图2中的d为小鼠腹主动脉切片的he染色图，结果显示ad可显著抑制ppe诱导的血管重塑，包括血管壁增厚、外膜大量细胞浸润以及中膜外膜边界模糊等病理改变。
[0119]
图2中的e为evg染色图，结果表明ad可显著抑制ppe诱导的腹主动脉血管弹力纤维的变薄、断裂和降解。
[0120]
图2中的f为cd68免疫组化染色图，结果表明ad可显著抑制ppe诱导的腹主动脉血管中巨噬细胞浸润。
[0121]
3.南洋杉酮(ao)抑制tnf-α诱导的血管平滑肌细胞炎症因子表达和mmp9活化
[0122]
图3中的a为不同浓度ao处理血管平滑肌细胞48h的细胞存活率试验。由此可知，ao在100μm的浓度范围内细胞安全性较好。
[0123]
图3中的b-e分别为100ng/ml tnf-α处理24h，同时用25μm ao处理，细胞中mcp-1、il-1β、il-18和mmp9的相对基因表达水平。由此可知，ao可显著抑制tnf-α诱导的血管平滑肌细胞中mmp9的mrna表达水平的上调，从而抑制细胞外基质成分降解。同时，ao可显著抑制tnf-α诱导的血管平滑肌细胞中炎症因子的mrna表达水平的上调，从而抑制平滑肌细胞炎症损伤。
[0124]
图3中的f和g分别为100ng/ml tnf-α处理48h，同时用25μm ao处理，明胶酶谱检测细胞培养基上清中mmp9活性的代表性条带和定量结果。由此可知，ao可显著抑制tnf-α诱导的血管平滑肌细胞中mmp9酶活性的上调，从而抑制细胞外基质成分降解。
[0125]
4.南洋杉酮(ao)灌胃给药抑制ppe诱导的小鼠腹主动脉瘤
[0126]
图4中的a为动物实验流程图。100mg/kg/day ao预灌胃2天后，第3天灌胃后进行aaa造模手术。术后每天继续灌胃给药，14天后进行取材。
[0127]
图4中的b和c分别为小鼠腹主动脉大体照片和腹主动脉肾下段最大直径统计，结果表明ao灌胃给药可显著抑制ppe诱导的小鼠腹主动脉扩张。
[0128]
图4中的d为小鼠腹主动脉切片的he染色图，结果显示ao可显著抑制ppe诱导的血管重塑，包括血管壁增厚、外膜大量细胞浸润以及中膜外膜边界模糊等病理改变。
[0129]
图4中的e为evg染色图，结果表明ao可显著抑制ppe诱导的腹主动脉血管弹力纤维的变薄、断裂和降解。
[0130]
图4中的f为cd68免疫组化染色图，结果表明ao可显著抑制ppe诱导的腹主动脉血管中巨噬细胞浸润。
[0131]
5.ad/ao腹腔注射可显著抑制ppe诱导的小鼠腹主动脉瘤
[0132]
图5中的a为实验流程图。ad或ao 50mg/kg/day腹腔注射预给药2天后，第3天给药
后进行aaa造模手术，之后仍每天进行腹腔注射给药，14天后牺牲小鼠。
[0133]
图5中的b为ad和ao抑制ppe诱导的小鼠腹主动脉瘤的大体照片，图5中的c为腹主动脉肾下段最大直径统计，结果表明ad和ao均可显著减轻ppe诱导的腹主动脉扩张。
[0134]
图5中的d为小鼠腹主动脉切片的he染色图，结果显示ad和ao均可显著抑制ppe诱导的血管重塑，包括血管壁增厚、外膜大量细胞浸润以及中膜外膜边界模糊等病理改变。
[0135]
图5中的e为evg染色图，结果表明ad和ao可显著抑制ppe诱导的腹主动脉血管弹力纤维的变薄、断裂和降解。
[0136]
图5中的f为cd68免疫组化染色图，结果表明ad和ao可显著抑制ppe诱导的腹主动脉血管中巨噬细胞浸润。
[0137]
6.ad/ao灌胃给药可显著抑制ppe诱导的小鼠腹主动脉早期炎症期炎症因子和mmp9表达
[0138]
图6中的a为小鼠实验流程图。ad或ao灌胃100mg/kg/day预灌胃3天后进行aaa造模手术。术后每天继续灌胃给药，3天后进行取材。ad或ao可显著抑制小鼠腹主动脉血管中mcp-1、il-6、tnf-α、il-1β、il-18和mmp9的基因表达(见图6中的b-g)。ad或ao可显著抑制小鼠腹主动脉血管中mmp9蛋白表达的(图6中的h)wb代表性条带及其(图6中的i)定量结果。由此可见，ad和ao可显著抑制ppe诱导引起的小鼠腹主动脉血管早期炎症期的炎症损伤和细胞外基质降解。
[0139]
7.ad/ao可显著抑制tnf-α诱导的血管平滑肌细胞以及ppe诱导的小鼠主动脉血管中nf-κb/nlrp3通路的激活。
[0140]
图7中的a和b为100ng/ml tnf-α处理24h，同时用25μg/ml ad或25μm ao处理血管平滑肌细胞，ad或ao抑制tnf-α诱导的血管平滑肌细胞中nlrp3的基因表达。100ng/ml tnf-α处理48h，同时用25μg/ml ad或25μm ao处理，ad或ao抑制tnf-α诱导的血管平滑肌细胞中nlrp3的蛋白表达(图7中的c)的wb代表性条带及其(图7中的d)定量结果。由此可见，ad和ao均可显著抑制tnf-α诱导的血管平滑肌细胞中nlrp3的活化。
[0141]
图7中的e和f为25μg/ml ad或25μm ao预处理血管平滑肌细胞12h，再采用100ng/ml tnf-α处理细胞30min，ad或ao抑制tnf-α诱导的血管平滑肌细胞中nf-κb p65的磷酸化蛋白的wb代表性条带及其定量结果。由此可见，ad和ao均可显著抑制tnf-α诱导的血管平滑肌细胞中nf-κb的活化。
[0142]
ad/ao 100mg/kg/day预灌胃3天后进行aaa造模手术。术后每天继续灌胃给药，3天后进行取材。ad或ao可显著抑制小鼠腹主动脉血管中(图7中的g)nlrp3的基因表达。ad或ao可显著抑制小鼠腹主动脉血管中nlrp3的蛋白表达和nf-κb p65磷酸化表达(图7中的h-j)。由此可见，在小鼠体内，ad和ao均可显著抑制ppe诱导的小鼠腹主动脉肾下段血管中nf-κb和nlrp3的活化。

技术特征：
1.贝壳杉提取物在制备预防和/或治疗腹主动脉瘤的产品中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述腹主动脉瘤为肾下段腹主动脉瘤。3.贝壳杉提取物在下述至少一项中的应用：1)在制备抑制腹主动脉弹力板破裂的产品中的应用；2)在制备抑制腹主动脉血管壁炎症细胞浸润的产品中的应用；3)在制备抑制腹主动脉血管壁中炎症因子表达的产品中的应用；4)在制备抑制腹主动脉血管壁基质金属蛋白酶表达的产品中的应用；5)在制备抑制腹主动脉血管壁炎症通路激活的产品中的应用；6)在制备抑制血管平滑肌细胞基质金属蛋白酶表达的产品中的应用；7)在制备抑制血管平滑肌细胞炎症因子表达的产品中的应用；8)在制备抑制血管平滑肌细胞炎症通路激活的产品中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：2)中，所述炎症细胞为巨噬细胞和/或白细胞；3)中，所述炎症因子为白细胞介素6(il-6)、单核细胞趋化因子-1(mcp-1)、肿瘤坏死因子α(tnf-α)、il-1β和il-18；4)中，所述基质金属蛋白酶为基质金属蛋白酶9(mmp9)；5)中，所述炎症通路为核因子κb(nf-κb)和nod样受体热蛋白结构域相关蛋白3(nlrp3)炎症小体通路；6)中，所述基质金属蛋白酶为mmp9；7)中，所述炎症因子为il-6、mcp-1、il-1β和il-18；8)中，所述炎症通路为nf-κb和nlrp3炎症小体通路。5.根据权利要求1-4中任一项所述的应用，其特征在于：所述贝壳杉提取物的活性成分包括南洋杉酮(araucarone，ao)，其结构式为如下所示：6.权利要求1-4中任一项所述的应用，其特征在于：所述贝壳杉提取物为贝壳杉的乙醇水溶液提取物。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述乙醇水溶液中乙醇的体积分数为60％～100％。8.权利要求1-7中任一项所述的应用，其特征在于：所述产品为药物或药物制剂。

技术总结
本发明公开了贝壳杉提取物在制备抗腹主动脉瘤的产品中的应用，属于医药领域。本发明公开了贝壳杉提取物(Agathis dammara extract，AD)及单体南洋杉酮(Araucarone，AO)的药物新用途。所述新用途为贝壳杉提取物及单体南洋杉酮在抗腹主动脉瘤中的应用。本发明采用与临床相关的腹主动脉瘤模型：猪胰腺弹力蛋白酶诱导的小鼠腹主动脉瘤；实验证明，贝壳杉提取物和单体南洋杉酮能明显抑制弹力蛋白酶诱导的小鼠腹主动脉瘤的发生发展。诱导的小鼠腹主动脉瘤的发生发展。


技术研发人员：祁荣 张庆义
受保护的技术使用者：北京大学
技术研发日：2023.05.23
技术公布日：2023/7/22