一种用于制备岩藻多糖的微生物的制作方法

1.本发明属于微生物技术领域，具体而言，涉及一种用于制备岩藻多糖的微生物。


背景技术：

2.多糖是一类高分子量聚合物生物材料，多糖组成单元，涉及的糖苷键连接的类型及分支程度的多样性，具有大结构的多样性。由于多糖的物理和化学性质，即水保留能力，流变学和/或膜-形成能力，多糖用于广泛的食品和工业应用，包括织物，涂料，药物和化妆品，作为乳化，稳定化或增稠剂。目前，工业中使用的大多数多糖从植物(例如瓜尔胶，阿拉伯胶)，藻(例如藻酸酯，角叉菜胶)或甲壳类动物(例如壳多糖)得到，微生物多糖(例如黄原胶，吉兰糖胶，细菌藻酸酯)仅占小部分的生物聚合体的市场。植物，藻和动物具有一或更多年的寿命周期，具有几个月或几年的量级的生长速率，产生周期通常是季节性的，而微生物的生长速率是几小时或几天的量级，通常呈现更高生长速率和它们更依从培养条件的操作，因此微生物发酵生产多糖相比于植物，藻或动物的提取具有优势(morenoet al,1998)。
3.岩藻多糖（fgl）是广泛存在于褐藻表面的黏滑成分，是一种水溶性杂多糖。从褐藻中提取的岩藻多糖因其独特理化性能和多种健康功效，可作为活性成分用于化妆品或药妆品开发。但l-岩藻糖在海藻中的含量约为9%~11.2%，且岩藻糖在海藻的总提取的产率仅为约7.6%，严重限制了岩藻糖的广泛应用。公开号为cn 115028750 a的中国专利公开了一种泡叶藻岩藻多糖及其制备方法和应用，具体公开了利用泡叶藻提取岩藻多糖，并对制得的多糖进行抗炎功效的测定。公开号为cn 106046188 b的中国专利公开了一种岩藻多糖的制备方法，具体公开选择藻酸盐提取前处理过程中褐藻的洗涤水来提取岩藻多糖，虽然不单独占用褐藻资源，达到综合利用褐藻资源的目的，但仍存在岩藻多糖得率低的问题。随着对微生物资源的开发，克雷伯菌株属(克雷伯菌株)，肠杆菌属(肠杆菌)，假单胞菌属(假单胞菌)和棍状杆菌属的细菌属等多种微生物被发现具有合成含有l-岩藻糖的细胞外多糖(eps)的能力。因此，利用微生物发酵法生产岩藻多糖将是解决现有的利用提取法制备岩藻多糖存在的得率低，浪费资源等问题。
4.衰老是人类生命中必须经历的自然现象，是一种非常复杂的生理进程。皮肤衰老主要表现为细胞代谢逐渐减缓，活性氧（sod/ros）积累，弹性蛋白含量减少，胶原蛋白逐渐流失，细胞活力下降等，反映在皮肤上就是肌肤失去弹性、光泽，干枯产生皱纹，更甚者出现黑色素沉着、老年斑加速产生等情况。根据不同作用机制一般可将活性原料分为保湿类、清除自由基类、吸收紫外线类以及细胞修复类四种类型，体外功效评价主要有清除自由基能力测试、锁水能力测试及细胞增殖能力测试等。随着人们生活水平的不断提高，大家在满足基本的衣食住行需求之后也开始注重自己的生活质量。随着时代的发展，人们护肤意识的增强，对化妆品的需求日益增加，对护肤品的功效要求也越来越严格，其中舒缓和抗衰化妆品也越来越受到人们的关注。
5.综上所述，利用微生物发酵法生产岩藻多糖从而提高岩藻多糖的产量，降低生产成本，对岩藻多糖的应用有重要的实践意义，同时研究岩藻多糖的功效，也是岩藻多糖生产
0.05g，kh2po41.50 g，k2hpo44.50 g，mgso4·
7h2o 0.20 g，加水溶解后调节ph=7，定容至1000ml，121℃灭菌45min制得；优选地，所述发酵条件为：温度28-33℃，时间48-72h；更优选地，发酵条件为：温度30℃，时间68h。
18.优选地，所述碳源为葡萄糖、山梨醇、糊精、淀粉中至少一种，更优选地，为山梨醇。
19.优选地，步骤s3中所述离心条件为：转速6000-8000rmp，时间20-30min。
20.优选地，步骤s4中所述乙醇浓度为80-95%，更优选地，为85%。
21.借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点：本发明的肺炎克雷伯氏菌具有促进胶原蛋白、紧致皮肤、清除自由基、抗氧化及保湿等多种作用，能够有效解决现有岩藻多糖得率低及应用的问题。本发明的肺炎克雷伯氏菌发酵制备岩藻多糖具有方法简单，产量高，便于操作，适于推广。
22.上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例及附图详细说明如后。
附图说明
23.图1为根据实施例2的不同浓缩岩藻多糖的细胞毒性；图2为根据实施例2的流式细胞法测定岩藻多糖对细胞中胶原蛋白i的影响；图3为根据实施例2的免疫荧光法测定岩藻多糖对细胞中胶原蛋白i的影响；图4为根据实施例2的岩藻多糖对细胞中弹性蛋白含量的影响；图5为根据实施例3的岩藻多糖对细胞中sod超氧化歧化酶含量的影响；图6为根据实施例3的岩藻多糖对细胞中ros自由基含量的影响；图7为根据实施例3的岩藻多糖对dpph清除效果；图8为根据实施例4的岩藻多糖对细胞中fgf7含量的影响；图9为根据实施例4的岩藻多糖的锁水能力测试结果。
实施方式
24.为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面将结合本发明实施例及附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
25.实施例1 肺炎克雷伯氏菌的筛选及岩藻多糖生产1. 肺炎克雷伯氏菌的筛选（1）选择性固体培养基的制备：扩增培养基为：山梨醇 4g，蛋白胨 4.5g，酵母提取物（英国，oxoid） 0.05g，kh2po41.50 g， k2hpo44.50 g，mgso4·
7h2o 0.20 g，加水溶解后调节ph=7，定容至1000ml，121℃灭菌45min制得。
26.在扩增培养基中加入山梨醇溶液和琼脂，培养基中山梨醇和琼脂的浓度分别为4%和1.5%，灭菌后将平板倾入无菌平皿中，待其凝固后得到选择性固体培养基。
27.（2）采集痰液样品，接种到无菌扩增培养基中30℃下培养24h。
28.（3）取扩增后的痰液菌液稀释后涂布于平板上，放入30℃培养箱中静置培养48h，挑选平板上有透明圈的菌落的菌株，进行基因序列比对，确定菌株类别，从而筛选出肺炎克雷伯氏菌。
29.2. 利用肺炎克雷伯氏菌发酵产岩藻多糖（1）将所获肺炎克雷伯氏菌接种到扩增固体培养基上，30℃下进行活化12h天，得到活化的肺炎克雷伯氏菌，将活化的肺炎克雷伯氏菌接种到液体扩增培养基中，30℃下培养12h，得到肺炎克雷伯氏菌种子液。
30.（2）将肺炎克雷伯氏菌菌液接种于发酵培养基中，接种量为5%，30℃下发酵68h，得到肺炎克雷伯氏菌发酵液。其中，发酵液配方：山梨醇 4g，蛋白胨 4.5g，酵母提取物（英国，oxoid） 0.05g， kh2po41.50 g，k2hpo44.50 g，mgso4·
7h2o 0.20 g，加水溶解后调节ph=7，定容至1000ml，121℃灭菌45min制得。
31.(3) 发酵结束后，测定肺炎克雷伯氏菌发酵液测定黏度，后经巴氏消毒，于8000 rpm下离心20 min，去除菌体收集上清液。
32.（4）在上清液中加入终浓度为80-95%乙醇，对岩藻多糖进行提取，提取后的岩藻多糖固体经冷冻干燥后，得到岩藻多糖（fgl）固体。
33.3. 岩藻多糖单糖组成测定（1）称取20mg冷冻干燥所得的fgl样品于玻璃试管中，加2ml 2m h2so
4 于沸水中分解4h，加入过量的baco3中和至中性，离心，上清液过滤后，用高效液相色谱法（hplc）测定水解液中单糖组成。hplc方法为：87h色谱柱，5mm h2so4为流动相，柱温50℃，流速为0.5ml/min。
34.（2）结果显示，该肺炎克雷伯氏菌具有高产岩藻多糖的特征，其多糖产量为7.28g/l，多糖中单糖组成为岩藻糖，半乳糖和半乳糖醛酸，其中三种单糖摩尔比为3.1：2.1：1，质量百分比为47%：35%：18%。
35.该菌株于2022年10月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmcc no.25947。
36.实施例2 岩藻多糖抗皱功效测定1. 岩藻多糖的制备（1）将所获肺炎克雷伯氏菌接种到扩增固体培养基上，30℃下进行活化12h天，得到活化的肺炎克雷伯氏菌，将活化的肺炎克雷伯氏菌接种到液体扩增培养基中，30℃下培养12h，得到肺炎克雷伯氏菌种子液。
37.（2）将肺炎克雷伯氏菌菌液接种于发酵培养基中，接种量为5%，30℃下发酵68h，得到肺炎克雷伯氏菌发酵液。其中，发酵液配方：山梨醇 4g，蛋白胨 4.5g，酵母提取物（英国，oxoid） 0.05g，kh2po41.50 g，k2hpo44.50 g，mgso4·
7h2o 0.20 g，加水溶解后调节ph=7，定容至1000ml，121℃灭菌45min制得。
38.(3) 发酵结束后，测定肺炎克雷伯氏菌发酵液测定黏度，后经巴氏消毒，于8000 rpm下离心20 min，去除菌体收集上清液。
39.（4）在上清液中加入终浓度为80-95%乙醇，对岩藻多糖进行提取，经测定发酵所得岩藻多糖组成成分为岩藻糖，半乳糖和半乳糖醛酸，其中三种单糖摩尔比为3.1：2.1：1，质
量百分比为47%：35%：18%。
40.2. fgl细胞毒性实验(1) 细胞培养与传代当细胞汇合度达到90%人真皮成纤维细胞汇合度的时候可以将细胞进行传代，去除上清后用pbs将细胞清洗1-2次，加适量胰酶进行消化细胞8 min左右，然后添加完全培养基终止消化，此时细胞可以进行1:3-1:6传代，传代后将细胞放在5 % co2，37℃培养箱中进行培养。
41.(2) 细胞铺板观察细胞状态及汇合率后细胞铺板，细胞消化后离心，用台盼蓝染色细胞，在显微镜下细胞计数，铺好的细胞板在培养箱中静置培养。
42.(3) 加测试样品细胞贴壁后，向细胞板中分别添加0.75%，0.37%和19%浓度的岩藻多糖测试样品溶液，对照为不加岩藻多糖，添加同等体积的溶剂的空白细胞，加样后继续在培养箱中静置培养24 h。
43.（4）检测向培养后的细胞板中添加mtt，再培养3h。培养后离心（1000rpm，10min），小心吸掉上清，用每空加入150ul 二甲基亚砜，置摇床上低速震荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪od490nm测量各孔的吸光值。不同浓度岩藻多糖的细胞毒性见图1。其中，0.19%为细胞无毒性安全使用浓度。
44.3. fgl对胶原蛋白的影响3.1 流式细胞技术检测(1) 细胞培养与传代当细胞汇合度达到90%人真皮成纤维细胞汇合度的时候可以将细胞进行传代，去除上清后用pbs将细胞清洗1-2次，加适量胰酶进行消化细胞8 min左右，然后添加完全培养基终止消化，此时细胞可以进行1:3-1:6传代，传代后将细胞放在5 % co2，37℃培养箱中进行培养。
45.(2) 细胞铺板观察细胞状态及汇合率后细胞铺板，细胞消化后离心，用台盼蓝染色细胞，在显微镜下细胞计数，铺好的细胞板在培养箱中静置培养。
46.(3) 加测试样品细胞贴壁后，向细胞板中分别添加0.05%岩藻多糖测试样品和benchmark溶液，空白对照为不加岩藻多糖，添加同等体积的溶剂的空白细胞，加样后继续在培养箱中静置培养24 h。
47.（4）检测与分析培养24h后，用流式细胞仪在特定波长下统计分析带有胶原蛋白i特异性标记的细胞，测定岩藻多糖对细胞弹性蛋白表达的影响。流式细胞法测定岩藻多糖对胶原蛋白i的影响见图2。其中，0.05%浓度的岩藻多糖和benchmark均可以分别提高胶原蛋白i的表达，提高71%和82%，表明两者均能促进胶原蛋白的表达。
48.3.2 荧光定量pcr检测
(1) 细胞培养与传代当细胞汇合度达到90%人真皮成纤维细胞汇合度的时候可以将细胞进行传代，去除上清后用pbs将细胞清洗1-2次，加适量胰酶进行消化细胞8 min左右，然后添加完全培养基终止消化，此时细胞可以进行1:3-1:6传代，传代后将细胞放在5 % co2，37℃培养箱中进行培养。
49.(2) 细胞铺板观察细胞状态及汇合率后细胞铺板，细胞消化后离心，用台盼蓝染色细胞，在显微镜下细胞计数，铺好的细胞板在培养箱中静置培养。
50.(3) 加测试样品细胞贴壁后，将培养基换为低血清培养基，向细胞板中添加0.05%岩藻多糖测试样品，空白对照为不加岩藻多糖，添加同等体积的溶剂的空白细胞，加样后继续在培养箱中静置培养24 h。
51.（4）检测与分析培养24h后进行免疫荧光实验，并在特定波长下用荧光显微镜拍照，通过分析细胞中特异性表达胶原蛋白i的细胞含量分析岩藻多糖对胶原蛋白含量的影响。通过免疫荧光法测定岩藻多糖对细胞中胶原蛋白i的影响如图3所示。其中，0.05%岩藻多糖处理后，细胞表现出强烈的绿色荧光，表明其对细胞胶原蛋白的表达有明显的促进作用。
52.4. fgl对弹性蛋白的影响(1) 细胞培养与传代当细胞汇合度达到90%人真皮成纤维细胞汇合度的时候可以将细胞进行传代，去除上清后用pbs将细胞清洗1-2次，加适量胰酶进行消化细胞8 min左右，然后添加完全培养基终止消化，此时细胞可以进行1:3-1:6传代，传代后将细胞放在5 % co2，37℃培养箱中进行培养。
53.(2) 细胞铺板观察细胞状态及汇合率后细胞铺板，细胞消化后离心，用台盼蓝染色细胞，在显微镜下细胞计数，铺好的细胞板在培养箱中静置培养。
54.(3) 加测试样品细胞贴壁后，将培养基换为低血清培养基，向细胞板中添加0.25%岩藻多糖测试样品，空白对照为不加岩藻多糖，添加同等体积的溶剂的空白细胞，加样后继续在培养箱中静置培养24 h。
55.（4）检测与分析培养24h后收集细胞，提取细胞中的rna后进行反转录cda，并用q-pcr检测弹性蛋白表达量情况。岩藻多糖对细胞中弹性蛋白含量影响如图4所示。其中，岩藻多糖对弹性蛋白的表达提高120%左右，对弹性蛋白有明显的促进作用。
56.实施例3 岩藻多糖抗氧化功效测定1. 岩藻多糖的制备（1）将所获肺炎克雷伯氏菌接种到扩增固体培养基上，30℃下进行活化12h天，得到活化的肺炎克雷伯氏菌，将活化的肺炎克雷伯氏菌接种到液体扩增培养基中，30℃下培养12h，得到肺炎克雷伯氏菌种子液。
57.（2）将肺炎克雷伯氏菌菌液接种于发酵培养基中，接种量为5%，30℃下发酵68h，得到肺炎克雷伯氏菌发酵液。其中，发酵液配方：山梨醇 4g，蛋白胨 4.5g，酵母提取物（英国，oxoid） 0.05g，kh2po41.50 g，k2hpo44.50 g，mgso4·
7h2o 0.20 g，加水溶解后调节ph=7，定容至1000ml，121℃灭菌45min制得。
58.(3) 发酵结束后，测定肺炎克雷伯氏菌发酵液测定黏度，后经巴氏消毒，于8000 rpm下离心20 min，去除菌体收集上清液。
59.（4）在上清液中加入终浓度为80-95%乙醇，对岩藻多糖进行提取，经测定发酵所得岩藻多糖组成成分为岩藻糖，半乳糖和半乳糖醛酸，其中三种单糖摩尔比为3.1：2.1：1，质量百分比为47%：35%：18%。
60.2. fgl对sod超氧化物歧化酶的影响(1) 细胞培养与传代当细胞汇合度达到90%表皮角质形成细胞汇合度的时候可以将细胞进行传代，去除上清后用pbs将细胞清洗1-2次，加适量胰酶进行消化细胞8 min左右，然后添加完全培养基终止消化，此时细胞可以进行1:3-1:6传代，传代后将细胞放在5 % co2，37℃培养箱中进行培养。
61.(2) 细胞铺板观察细胞状态及汇合率后细胞铺板，细胞消化后离心，用台盼蓝染色细胞，在显微镜下细胞计数，铺好的细胞板在培养箱中静置培养。
62.(3) 加测试样品细胞贴壁后，将培养基换为低血清培养基，向细胞板中添加0.25%岩藻多糖测试样品，空白对照为不加岩藻多糖，添加同等体积的溶剂的空白细胞，加样后继续在培养箱中静置培养24 h。
63.（4）检测与分析培养24h后收集细胞，提取细胞中的rna后进行反转录cda，并用q-pcr测定sod超氧化物歧化酶含量。自由基使人的皮肤发生氧化，而sod则作为一种抗氧化酶可以阻断氧化的发生，从而阻断了人衰老晒黑的进程。岩藻多糖对细胞中sod超氧化歧化酶含量的影响见图5。其中，岩藻多糖可以提高sod表达40%左右，对sod的表达有明显的促进作用。
64.3. fgl对ros自由基含量的影响(1) 细胞培养与传代当细胞汇合度达到90%表皮角质形成细胞汇合度的时候可以将细胞进行传代，去除上清后用pbs将细胞清洗1-2次，加适量胰酶进行消化细胞8 min左右，然后添加完全培养基终止消化，此时细胞可以进行1:3-1:6传代，传代后将细胞放在5 % co2，37℃培养箱中进行培养。
65.(2) 细胞铺板观察细胞状态及汇合率后细胞铺板，细胞消化后离心，用台盼蓝染色细胞，在显微镜下细胞计数，铺好的细胞板在培养箱中静置培养。
66.(3) 加测试样品细胞贴壁后，向细胞板中添加0.1%岩藻多糖测试样品，空白对照为不加岩藻多糖，添加同等体积的溶剂的空白细胞，加样后继续在培养箱中静置培养24 h。
67.（4）检测与分析培养24h后，用流式细胞仪在特定波长下统计分析带有ros特异性探针的细胞，测定岩藻多糖对ros自由基含量的影响。岩藻多糖对细胞中ros自由基含量的影响见图6。其中，未处理的细胞中ros含量为94%，0.1%岩藻多糖处理后细胞中的ros含量降低为76.5%。氧自由基（ros）含量过高皮肤会粗糙，长斑，暗沉，皱纹，干燥。结果表明，fgl降低ros含量约17.5%左右，具有抗氧化作用。
68.4. dpph自由基清除能力称取一定量的dpph，用无水乙醇配制成0.04mg/ml的dpph溶液。分别取2ml岩藻多糖溶液，加入2ml dpph溶液，混合均匀，室温放置30min后，5000r/min离心10min。取200ul上清液到96孔板中，于517nm处测定反应液吸光值。用vc作为阳性对照。
69.样品对dpph自由基的清除率用以下公式计算：清除率rs(%)=[1-(a1-a2)
÷
a0]
×
100%。其中，a0—2ml无水乙醇+ 2ml dpph溶液的吸光值；a1—2ml样品溶液+ 2ml dpph溶液的吸光值；a2—2ml样品溶液+ 2ml无水乙醇的吸光值。
[0070]
岩藻多糖对dpph清除效果如图7。结果表明，vc对dpph的清除率为95%，岩藻多糖对dpph的清除率为54%，同浓度的竞品对dpph的清除率为17%，表明岩藻多糖对自由基有明显的清作用。
[0071]
实施例4 fgl细胞修复和保湿功效测定1. 岩藻多糖的制备（1）将所获肺炎克雷伯氏菌接种到扩增固体培养基上，30℃下进行活化12h天，得到活化的肺炎克雷伯氏菌，将活化的肺炎克雷伯氏菌接种到液体扩增培养基中，30℃下培养12h，得到肺炎克雷伯氏菌种子液。
[0072]
（2）将肺炎克雷伯氏菌菌液接种于发酵培养基中，接种量为5%，30℃下发酵68h，得到肺炎克雷伯氏菌发酵液。其中，发酵液配方：山梨醇 4g，蛋白胨 4.5g，酵母提取物（英国，oxoid） 0.05g，kh2po41.50 g，k2hpo44.50 g，mgso4·
7h2o 0.20 g，加水溶解后调节ph=7，定容至1000ml，121℃灭菌45min制得。
[0073]
(3) 发酵结束后，测定肺炎克雷伯氏菌发酵液测定黏度，后经巴氏消毒，于8000 rpm下离心20 min，去除菌体收集上清液。
[0074]
（4）在上清液中加入终浓度为80-95%乙醇，对岩藻多糖进行提取，经测定发酵所得岩藻多糖组成成分为岩藻糖，半乳糖和半乳糖醛酸，其中三种单糖摩尔比为3.1：2.1：1，质量百分比为47%：35%：18%。
[0075]
2. fgl修复功能检测(1) 细胞培养与传代当细胞汇合度达到90%表皮角质形成细胞汇合度的时候可以将细胞进行传代，去除上清后用pbs将细胞清洗1-2次，加适量胰酶进行消化细胞8 min左右，然后添加完全培养基终止消化，此时细胞可以进行1:3-1:6传代，传代后将细胞放在5% co2，37℃培养箱中进行培养。
[0076]
(2) 细胞铺板
观察细胞状态及汇合率后细胞铺板，细胞消化后离心，用台盼蓝染色细胞，在显微镜下细胞计数，铺好的细胞板在培养箱中静置培养。
[0077]
(3) 加测试样品细胞贴壁后，将培养基换为低血清培养基，向细胞板中添加0.25%岩藻多糖测试样品，空白对照为不加岩藻多糖，添加同等体积的溶剂的空白细胞，加样后继续在培养箱中静置培养24 h。
[0078]
（4）检测与分析培养24h后收集细胞，提取细胞中的rna后进行反转录cda，并用q-pcr测定 fgf7细胞生长因子的含量。fgf7细胞生长因子能刺激上皮细胞增殖和基底角质形成细胞用于创伤愈合，在皮肤组织细胞的生长、分化、再生和迁移中起作重要的生理功能。岩藻多糖处理前后细胞中fgf7含量变化如图8。其中，岩藻多糖可以提高fgf7细胞生长因子50%左右，对细胞增长因子表达有明显的促进作用。
[0079]
3. fgl持久保湿锁水效果测定称取10g的0.2%的岩藻多糖样品混合液添加到含有滤纸的培养皿中，待滤纸完全浸湿后称重。以0.1%的透明质酸为阳性对照，以水为阴性对照。将浸润好的滤纸培养皿放入高温高湿环境中，每隔1h进行称重。8h后结束，根据测定的培养皿和滤纸的重量变化分析岩藻多糖的相对锁水能力。岩藻多糖的锁水能力见图9。其中，0.2%岩藻多糖相对于水可以提高滤纸150%左右的锁水能力，且其锁水能力比透明质酸钠有明显提升趋势。
[0080]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的方法及技术内容作出些许的更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

技术特征：
1.一种用于制备岩藻多糖的微生物，其特征在于，所述微生物为肺炎克雷伯氏菌klebsiella pneumoniae，株号sd1010，于2022年10月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmcc no.25947。2.一种如权利要求1所述的用于制备岩藻多糖的微生物的筛选方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：s1：样品采集并培养；s2：将培养后的样品涂到选择性固体培养基上，置于培养箱中培养，挑选平板上有透明分泌物的菌落的菌株，进行基因序列比对，确定菌株类别，从而筛选出产胞外多糖的肺炎克雷伯氏菌。3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，步骤s1中所述样品采集自痰液；所述培养条件为：温度30℃，时间24h。4.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，步骤s2中所述选择性固体培养基按照如下方法制备：向扩增培养基中加入山梨醇和琼脂粉，使得培养基中山梨醇的浓度是4 %，琼脂粉含量为1.5%，灭菌后倒入无菌平皿中，冷却凝固后得到选择性固体培养基。5.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，所述扩增培养基组成为：山梨醇 4g，蛋白胨 4.5g，酵母提取物 0.05g，kh2po
4 1.50 g，k2hpo
4 4.50 g，mgso4·
7h2o 0.20 g，加水溶解后调节ph=7，定容至1000ml，121℃灭菌45min制得。6.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，步骤s2中所述培养条件为：温度30℃，时间48h。7.一种根据权利要求1-6中任一项所述的用于制备岩藻多糖的微生物制备岩藻多糖的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：s1：将肺炎克雷伯氏菌接种到选择性扩增固体培养基上，30℃下进行活化培养12h，得到活化的肺炎克雷伯氏菌，将活化的肺炎克雷伯氏菌接种到液体扩增培养基中，30℃下培养12h，得到肺炎克雷伯氏菌菌液；s2：将肺炎克雷伯氏菌菌液按照接种量为5-10%接种于发酵液中发酵，得到肺炎克雷伯氏菌发酵液；s3：将发酵好的肺炎克雷伯氏菌发酵液离心，收集上清液，将菌体清洗后重悬，最后巴氏杀菌，即得发酵产物；s4：在发酵产物加入一定浓度的乙醇，搅拌静置后得到岩藻多糖沉淀，待沉淀溶解后经冷冻干燥，得到岩藻多糖固体。8.根据权利要求7所述的制备岩藻多糖的方法，其特征在于，步骤s2中所述发酵液配方为：碳源 40g，蛋白胨 4.5g，酵母提取物 0.05g，kh2po
4 1.50 g，k2hpo
4 4.50 g，mgso4·
7h2o 0.20 g，加水溶解后调节ph=7，定容至1000ml，121℃灭菌45min制得；所述碳源为葡萄糖、山梨醇、糊精、淀粉中的至少一种；所述发酵条件为：温度28-33℃，时间48-72h。9.根据权利要求7所述的制备岩藻多糖的方法，其特征在于，步骤s3中所述离心条件为：转速6000-8000rmp，时间20-30min。10.根据权利要求7所述的制备岩藻多糖的方法，其特征在于，步骤s4中所述乙醇浓度为80-95%。

技术总结
本发明公开提供了一种用于制备岩藻多糖的微生物，所述微生物为肺炎克雷伯氏菌Klebsiella Pneumoniae，株号SD1010，于2022年10月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.25947。本发明还提供了一种用于制备岩藻多糖的微生物的筛选方法以及基于该菌株的胞外多糖制备方法。本发明采用新型肺炎克雷伯氏菌菌种，具有高产岩藻多糖的特征，其胞外多糖产物具有良好的促进胶原蛋白、紧致皮肤、清除自由基、抗氧化及保湿等多种功效，细胞毒性小，安全性高等作用，能够解决现有引起皮肤衰老的一系列问题。本发明的肺炎克雷伯氏菌发酵方法简单，多糖产量高，适于推广。适于推广。适于推广。


技术研发人员：张莎莎 崔树梅 史鲁秋 薛虹宇 苏桂珍
受保护的技术使用者：南京盛德百泰生物科技有限公司
技术研发日：2023.05.17
技术公布日：2023/7/22