一种降纤酶的制备方法与流程

1.本发明属于提取物制备技术领域，具体是涉及一种降纤酶的制备方法。


背景技术：

2.降纤酶通过专一性的激活或灭活作用后，该蛋白酶作用于血液凝固、纤溶系统的各个步骤，产生促凝或抗凝效应，在体外引起血浆纤维蛋白原的凝聚，起凝血作用。在临床上蛇毒类凝血酶能用于防治血栓栓塞性疾病、急性脑梗死，以及脑梗死再复发的预防等。
3.降纤酶本身为白色非结晶粉末，有引湿性，易溶于水。有分解血浆纤维蛋白原、溶解血栓、降低血液粘度和血小板聚集力作用。
4.现有技术降纤酶的制备方法较多，但多因步骤多、时间长、收率低、蛋白构成不稳定导致其活性低，染菌污染的风险较大等缺陷。
5.这些分离纯化降纤酶的方法有：
6.1﹚取deae-sephadexa-50(二乙氨基—乙基-葡萄糖凝胶a-50，简称a-50)，加入新鲜蒸馏水，加热煮沸15min，放至室温，加ph7.6的0.05mol/l tris-hcl缓冲液搅拌，放置数小时，弃去上清液，再加入上述缓冲液，如此反复数次，测ph为7.6，即达平衡。用上述缓冲液平衡，是因为降纤酶的最适ph为7.4～7.6，且在ph7.6的条件下，a-50稳定。再将蛇毒粗品均匀加在a-50柱中。洗脱条件，第一梯度，在搅拌瓶中加ph7.6，含0.1mol/l氯化钠的tris-hcl缓冲液1000ml；第二梯度，在搅拌瓶中加ph7.6，含0.1mol/l氯化钠的tris-hcl缓冲液1000ml，贮存瓶中ph7.6，含0.1mol/l氯化钠的tris-hcl缓冲液1000ml。共分离出9个峰，将合格峰合并，即得降纤酶。
7.2)将尖吻蝮蛇蛇毒20克溶于8.0的缓冲液1000ml中，上柱，用平衡缓冲液冲洗后再用含0.15mol/l氯化钠的缓冲液洗脱，收集含降纤酶活性成分的溶液。亲和层析填料系用经溴化氰活化，接上二氨基二丙基胺后经琥珀酸化，偶联亲和降纤酶的配基而成。将柱层析收集的洗脱液上亲和层析柱，用平衡缓冲液冲洗后，用含0.2mol/l盐酸胍的平衡缓冲液洗脱，收集洗脱液，经超滤去盐浓缩，冻干，即得产品。此法从蛇毒20克制得产品69.3毫克，比活2886单位/毫克。
8.从以上文献中可以看出，由于蛇毒中降纤酶目标蛋白含量低，杂蛋白干扰大，不管是单一运用离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析还是疏水层析，其中哪种都很难纯化到高纯度的降纤酶目标蛋白。另一方面，降纤酶稳定性差，不选择恰当的缓冲液和贮藏条件，即使分离到高纯度目标蛋白，也会很快降解，文献中公开的工艺很难应用于产业化，所以开发一种纯度高、稳定性好能运用于大规模生产的降纤酶工艺成为一种迫切需求。


技术实现要素：

9.本发明要解决的技术问题是提供一种降纤酶的制备方法，纯度高，杂质少。
10.本发明的内容为一种降纤酶的制备方法，包括如下步骤：将含有蛇毒的原料进行阴离子交换层析，疏水层析和金属螯合亲和层析，每次层析后进行浓缩，处理，得到降纤酶，
sephacel，第三次离子交换层析优选nanogel-50sp。
26.所述疏水层析的填料采用butyl sepharose high performance、butyl sepharose 4ff、octyl sepharose 4ff、butyl sepharose 6ff、butyl-s sepharose 6ff、phenyl sepharose 6ff、octyl sepharose cl-4b、phenyl sepharose cl-4b、capto butyl impres、capto butyl、capto octyl、capto phenyl、capto phenyl impres、source 15iso或source 15phe，优选butyl sepharose4ff。
27.所述金属螯合亲和层析的填料采用imac sepharose 6ff、imac sepharose hp或chelating sepharose ff，优选chelating sepharose ff。
28.离子交换层析：离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有负电荷的称之阳离子交换树脂；而带有正电荷的称之阴离子交换树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的ph条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的ph值洗脱下来。
29.亲和层析：在生物分子中有些分子的特定结构部位能够同其他分子相互识别并结合，如酶与底物的识别结合、受体与配体的识别结合、抗体与抗原的识别结合，这种结合既是特异的，又是可逆的，改变条件可以使这种结合解除。生物分子间的这种结合能力称为亲和力。亲和层析就是根据这样的原理设计的蛋白质分离纯化方法。
30.凝胶过滤层析：凝胶过滤层析法又称为排阻层析或分子筛方法，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。也叫做分子排阻层析一种利用带孔凝胶珠作基质，按照分子大小分离蛋白质或其它分子混合物的层析技术。一般是大分子先流出来，小分子后流出来。
31.疏水层析：根据分子表面疏水性不同来分离生物大分子的一种方法。蛋白质和多肽等生物大分子的表面常常暴露着一些疏水性基团，我们把这些疏水性基团称为疏水补丁，疏水补丁可以与疏水性层析介质发生疏水性相互作用而结合。不同的分子由于疏水性不同，它们与疏水性层析介质之间的疏水性作用力强弱不同，疏水作用层析就是依据这一原理分离纯化蛋白质和多肽等生物大分子的。
32.本发明的有益效果是，本发明采用多次层析，能有效去除杂质，提高降纤酶的纯度，进而以较高的收率获得纯度高、活性好的降纤酶，该方生产周期短，制得的产品纯度高，生产成本低，易于放大生产，大大提高了产品的市场竞争力。
33.本技术采用多次的离子交换层析，疏水层析和金属螯合亲和层析进行处理，在每次层析后都对物质进行浓缩，在离子交换层析的洗脱液中加入了吐温20，且阴离子交换层析中，b液的氯化钠的浓度都高于a液，疏水层析采用的是醋酸铵缓冲液。通过这些设置可以显著的提高降纤酶的纯度，减少杂质，提高纯化效果。
具体实施方式
34.下面实施例只为进一步说明本发明，不以任何形式限制本发明范围。
35.实施例1
36.一种降纤酶的制备方法，步骤为，
37.(1)10g蛇毒冻干粉溶解到(一)柱a，4℃，2500rpm，10min离心，自动离心完毕后，取上清液于烧杯中备用。
38.(2)(一)柱填料：de52cellulose。将上步中的离心液上样，流速为10ml/min，用(一)柱a液洗脱，10％的(一)柱b液梯度洗脱(即最开始为(一)柱a液为90％，(一)柱b液10％；然后逐渐(一)柱a液降低到0％，(一)柱b液提高到100％，即梯度洗脱，下同)，总体积2800ml，流速10ml/min。收集梯度洗脱后具有酶活性的蛋白峰溶液。
39.(3)将上步所得的收集样品倒入装有30kd浓缩膜的浓缩杯中，盖上浓缩杯上盖进行浓缩操作，加入(二)柱a液100ml备用。
40.(4)(二)柱填料：deae sephacel。将上步中得到的样品上样，流速为10ml/min，用(二)柱a液洗脱，25％的(二)柱b液梯度洗脱，总体积2500ml，流速10ml/min。收集梯度洗脱后具有酶活性的蛋白峰溶液。
41.(5)将上步所得的收集样品倒入装有30kd浓缩膜的浓缩杯中，盖上浓缩杯上盖进行浓缩操作，加入(三)柱a液100ml备用。
42.(6)(三)柱填料：nanogel-50sp。将上步中得到的样品上样，流速为5ml/min，用(三)柱a液洗脱，20％的(三)柱b液梯度洗脱，总体积1000ml，流速5ml/min。收集梯度洗脱后具有酶活性的蛋白峰溶液。
43.(7)将上步所得的收集样品倒入装有30kd浓缩膜的浓缩杯中，盖上浓缩杯上盖进行浓缩操作，加入(四)柱a液100ml备用。
44.(8)(四)柱填料：butyl sepharose 4ff。将上步中得到的样品上样，流速为10ml/min，用(四)柱缓冲液洗脱，流速10ml/min。收集梯度洗脱后具有酶活性的蛋白峰溶液。
45.(9)将上步所得的收集样品倒入装有30kd浓缩膜的浓缩杯中，盖上浓缩杯上盖进行浓缩操作，加入(五)柱缓冲液100ml备用。
46.(10)(五)柱填料：chelating sepharose ff。将上步中得到的样品上样，流速为5ml/min，用(四)柱缓冲液洗脱，流速5ml/min。收集梯度洗脱后具有酶活性的蛋白峰溶液。
47.(11)将上步所得的收集样品倒入装有30kd浓缩膜的浓缩杯中，盖上浓缩杯上盖进行浓缩操作，加入水得到降纤酶。
48.所述(一)柱a液为0.2％吐温20，0.02m tris hcl缓冲液，ph7.80。
49.所述(一)柱b液为0.2％吐温20，0.5m nacl，0.02m tris hcl缓冲液，ph7.80。
50.所述(二)柱a液为0.2％吐温20，0.05m nacl，0.025m naac hac缓冲液，ph5.50。
51.所述(二)柱b液为0.2％吐温20，0.25m nacl，0.025m naac hac缓冲液，ph5.50。
52.所述(三)柱a液为0.2％吐温20，0.05m nacl，0.025m naac hac缓冲液，ph5.00。
53.所述(三)柱b液为0.2％吐温20，0.25m nacl，0.025m naac hac缓冲液，ph5.00。
54.所述(四)柱缓冲液为1.5m醋酸铵，0.02m tris hcl缓冲液，ph为7.00。
55.所述(五)柱缓冲液为0.04m tris hcl缓冲液，ph7.20。
56.实施例2
57.一种降纤酶的制备方法，步骤为，
58.(1)10g蛇毒冻干粉溶解到(一)柱a，4℃，5000rpm，15min离心，自动离心完毕后，取
上清液于烧杯中备用。
59.(2)(一)柱填料：de52cellulose。将上步中的离心液上样，流速为10ml/min，用(一)柱a液洗脱，10％的(一)柱b液梯度洗脱，总体积2800ml，流速10ml/min(即最开始为(一)柱a液为90％，(一)柱b液10％；然后逐渐(一)柱a液降低到0％，(一)柱b液提高到100％，即梯度洗脱，下同)。收集梯度洗脱后具有酶活性的蛋白峰溶液。
60.(3)将上步所得的收集样品倒入装有30kd浓缩膜的浓缩杯中，盖上浓缩杯上盖进行浓缩操作，加入(二)柱a液100ml备用。
61.(4)(二)柱填料：anx sepharose 4ff。将上步中得到的样品上样，流速为10ml/min，用(二)柱a液洗脱，25％的(二)柱b液梯度洗脱，总体积2500，ml流速10ml/min。收集梯度洗脱后具有酶活性的蛋白峰溶液。
62.(5)将上步所得的收集样品倒入装有30kd浓缩膜的浓缩杯中，盖上浓缩杯上盖进行浓缩操作，加入(三)柱a液100ml备用。
63.(6)(三)柱填料：sourse 15q。将上步中得到的样品上样，流速为5ml/min，用(三)柱a液洗脱，20％的(三)柱b液梯度洗脱，总体积1000ml，流速5ml/min。收集梯度洗脱后具有酶活性的蛋白峰溶液。
64.(7)将上步所得的收集样品倒入装有30kd浓缩膜的浓缩杯中，盖上浓缩杯上盖进行浓缩操作，加入(四)柱a液100ml备用。
65.(8)(四)柱填料：butyl-s sepharose 6fast flow。将上步中得到的样品上样，流速为10ml/min，用(四)柱缓冲液洗脱，流速10ml/min。收集梯度洗脱后具有酶活性的蛋白峰溶液。
66.(9)将上步所得的收集样品倒入装有30kd浓缩膜的浓缩杯中，盖上浓缩杯上盖进行浓缩操作，加入(五)柱缓冲液100ml备用。
67.(10)(五)柱填料：imac sepharose 6ff。将上步中得到的样品上样，流速为5ml/min，用(四)柱缓冲液洗脱，流速5ml/min。收集梯度洗脱后具有酶活性的蛋白峰溶液。
68.(11)将上步所得的收集样品倒入装有30kd浓缩膜的浓缩杯中，盖上浓缩杯上盖进行浓缩操作，加入水得到降纤酶。
69.其他和实施例1相同。
70.对比例1
71.对比例1和实施例1的区别在于：
72.所述(一)柱a液为0.02m tris hcl缓冲液，ph7.80。
73.所述(一)柱b液为0.5m nacl，0.02m tris hcl缓冲液，ph7.80。
74.所述(二)柱a液为0.05m nacl，0.025m naac hac缓冲液，ph5.50。
75.所述(二)柱b液为0.25m nacl，0.025m naac hac缓冲液，ph5.50。
76.所述(三)柱a液为0.05m nacl，0.025m naac hac缓冲液，ph5.00。
77.所述(三)柱b液为0.25m nacl，0.025m naac hac缓冲液，ph5.00。
78.其他和实施例1相同。
79.对比例2
80.对比例2和实施例1的区别在于：
81.所述(一)柱a液为0.2％吐温20，0.02m tris hcl缓冲液，ph7.80。
82.所述(一)柱b液为0.2％吐温20，0.5m nacl，0.02m tris hcl缓冲液，ph7.80。
83.所述(二)柱a液为0.2％吐温20，0.02m tris hcl缓冲液，ph7.80。
84.所述(二)柱b液为0.2％吐温20，0.5m nacl，0.02m tris hcl缓冲液，ph7.80。
85.所述(三)柱a液为0.2％吐温20，0.02m tris hcl缓冲液，ph7.80。
86.所述(三)柱b液为0.2％吐温20，0.5m nacl，0.02m tris hcl缓冲液，ph7.80。
87.其他和实施例1相同。
88.对比例3
89.对比例3和实施例1的区别在于：
90.所述(四)柱缓冲液为1.5m nacl，0.02m tris hcl缓冲液，ph为7.00。其他和实施例1相同。
91.对比例4
92.对比例4和实施例1的区别在于：
93.减少金属螯合亲和层析步骤，即去掉实施例1的步骤(10)，其他和实施例1相同。
94.实验例1
95.检测上述实施例1-2和对比例1-4的纯度，并给出检测数据。
96.表1不同物质的产品纯度表
[0097][0098]
注：出血毒检测方法：取本品，用氯化钠注射液制成每1ml中含100单位的溶液作为供试品溶液。取体重18～22g的小白鼠5只，背部皮下注射供试品溶液0.2ml，注射后24小时处死动物，剥皮观察，小鼠背部注射部位不得有出血现象。
[0099]
神经毒检测方法：取本品，用氯化钠注射液制成每1ml中含75单位的溶液作为供试品溶液。取体重300～500g的鸽3只，每1kg体重静脉注射供试品溶液0.5ml，观察24小时，动物不得出现抽搐、死亡，如3只鸽中有一只出现抽搐或死亡，应另取鸽5只复试，均不得出现死亡。
[0100]
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本技术的保护范围限于这些例子；在本技术的思路下，以上实施例或者不同实施
例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本技术中一个或多个实施例的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
[0101]
本技术中一个或多个实施例旨在涵盖落入本技术的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本技术中一个或多个实施例的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。

技术特征：
1.一种降纤酶的制备方法，其特征是，包括如下步骤：将含有蛇毒的原料进行阴离子交换层析，疏水层析和金属螯合亲和层析，每次层析后进行浓缩，处理，得到降纤酶，所述阴离子交换层析的次数为至少2次；首次的阴离子交换层析采用的洗脱方式为以a液和b液为洗脱液进行梯度洗脱，其中，所述a液为含有吐温20的tris hcl缓冲液，所述b液为含有吐温20和氯化钠的tris hcl缓冲液；第二次的阴离子交换层析采用的洗脱方式为以a液和b液为洗脱液进行梯度洗脱，其中，所述a液和b液都为含有吐温20和氯化钠的醋酸缓冲液，其中b液的氯化钠的浓度高于a液；所述疏水层析采用的洗脱液为含有0.5-2.5mol/l的醋酸铵的缓冲液；所述金属螯合亲和层析采用的洗脱液为0.01-0.1mol/l的tris hcl缓冲液。2.如权利要求1所述的降纤酶的制备方法，其特征是，在疏水层析之前，还包括第三次阴离子交换层析，第三次阴离子交换层析采用的洗脱方式为以a液和b液为洗脱液进行梯度洗脱，其中，所述a液和b液都为含有吐温20和氯化钠的醋酸缓冲液，其中b液的氯化钠的浓度高于a液。3.如权利要求1所述的降纤酶的制备方法，其特征是，含有蛇毒的原料为蛇毒冻干粉溶解在溶剂中，离心后得到的溶液，溶剂为含质量浓度0.1％～0.5％吐温20的0.01～0.1mol/l的tris hcl缓冲液，ph7.80
±
0.10。4.如权利要求1所述的降纤酶的制备方法，其特征是，浓缩采取的方法为，将层析后的物质加入到5～30kd浓缩膜中进行浓缩。5.如权利要求2所述的降纤酶的制备方法，其特征是，首次的阴离子交换层析中，a液和b液最开始的体积比为90:10；第二次的阴离子交换层析中，a液和b液最开始的体积比为75:25；第三次的阴离子交换层析中，a液和b液最开始的体积比为80:20。6.如权利要求1或2所述的降纤酶的制备方法，其特征是，首次的阴离子交换层析中，a液为含质量浓度0.2％吐温20的0.02mol/l的tris hcl缓冲液，ph7.8；所述b液为含质量浓度0.2％吐温20和0.5mol/l nacl的0.02mol/l的tris hcl缓冲液，ph7.8。7.如权利要求1或2所述的降纤酶的制备方法，其特征是，第二次的阴离子交换层析中，a液为含质量浓度0.2％吐温20和0.05mol/l nacl的0.025mol/l的醋酸缓冲液，ph5.5；所述b液为含质量浓度0.2％吐温20和0.25mol/l nacl的0.025mol/l的醋酸缓冲液，ph5.5。8.如权利要求2所述的降纤酶的制备方法，其特征是，第三次的阴离子交换层析中，a液为含质量浓度0.2％吐温20和0.05mol/l nacl的0.025mol/l的醋酸缓冲液，ph5.0；所述b液为含质量浓度0.2％吐温20和0.25mol/l nacl的0.025mol/l的醋酸缓冲液，ph5.0。9.如权利要求1-5任一项所述的降纤酶的制备方法，其特征是，所述疏水层析采用的洗脱液为1.5mol/l醋酸铵，0.02mol/l tris hcl缓冲液，ph为7；所述金属螯合亲和层析采用的洗脱液为0.04mol/l的tris hcl缓冲液，ph为7.2。10.如权利要求1-5任一项所述的降纤酶的制备方法，其特征是，所述金属螯合亲和层析的填料为imac sepharose 6ff、imac sepharose hp或chelating sepharose ff。

技术总结
本发明属于提取物制备技术领域，具体是涉及一种降纤酶的制备方法，包括如下步骤：将含有蛇毒的原料进行阴离子交换层析，疏水层析和金属螯合亲和层析，每次层析后进行浓缩，处理，得到降纤酶，所述阴离子交换层析的次数为至少2次；本申请可以显著的提高降纤酶的纯度，减少杂质，提高纯化效果。提高纯化效果。


技术研发人员：刘达 马晓宁 刘选 李多娇 杨世平 蔡小涛 李波 向岳辉 刘坤 康璐 刘雄杰 张静 刘娟
受保护的技术使用者：康普药业股份有限公司
技术研发日：2023.04.28
技术公布日：2023/7/25