一种高效获取高纯度肌酸激酶同工酶CK-MB的方法与流程

一种高效获取高纯度肌酸激酶同工酶ck-mb的方法
技术领域
1.本技术属于生物医学检验技术领域，更具体地说，是涉及一种高效获取高纯度肌酸激酶同工酶ck-mb的方法。


背景技术：

2.肌酸激酶(ck)是一种二聚体酶，有四种同功酶形式，分别为肌肉型(ck-mm)、脑型(ck-bb)、杂化型(ck-mb)和线粒体型(ck-mt)。mm型主要存在于各种肌肉细胞中，bb型主要存在于脑细胞中，mb型主要存在于心肌细胞中，mt型主要存在于心肌和骨骼肌线粒体中。
3.在心衰、心肌炎等疾病中，ck-mb均可作为标志物进行综合评估诊断。心肌细胞损伤主要以ck-mb增高为主，总ck也会随之增高。一般情况下，ck-mb在心梗起病4小时内升高，16-24小时到达高峰，3-4天恢复正常，若未恢复，表明梗死持续发展。其增高的程度能较准确地反应梗死的范围，其高峰出现时间是否提前有助于判断溶栓治疗是否成功。因此，ck-mb对于临床诊断具有重要作用。
4.标准的检测试剂盒包含检测试剂、校准品和质控品。而目前，罗氏也只有ck-mb的质控品，无校准品。目前市场上高纯度的ck-mb极少，且价格高昂，不利于ck-mb标准物质的研究及相关诊断试剂的开发。使用高纯度的ck-mb作为原料制作系列校准品、质控品，才能保证临床上对ck-mb的准确测定，为体外诊断系列产品奠定基础。因此，ck-mb市场需求量大，研究高效、高纯度的ck-mb的制备方法非常重要。
5.目前，有将ck-m、ck-b基因串联装入大肠杆菌或酵母表达载体，经过系列菌体制备、蛋白纯化等流程后获得纯化的ck-mb，但此方法往往在ck-m或ck-b的基因的c端或n端添加his-tag，用ni柱纯化后所得ck-mb，这种方法得到的ck-mb分子上带有标签，仍与人体内存在的ck-mb有差异，并不能完全适用于人血清标准物质、校准品及质控品的制备。


技术实现要素：

6.本技术的目的在于提供一种高效获取高纯度肌酸激酶同工酶ck-mb的方法，以解决现有技术中制备的ck-mb分子上带有标签、无法完全模拟人体内环境下的ck-mb的技术问题。且所获得的肌酸激酶同工酶ck-mb为hplc级别的纯度，保证了作为ck-mb标准物质候选物的要求。
7.为实现上述目的，本技术提供了一种高效获取高纯度肌酸激酶同工酶ck-mb的方法，包括以下步骤：
8.将高活性的ck-mm蛋白置于第一变性剂溶液中进行第一变性处理得到无活性的变性ck-mm蛋白溶液；
9.将与所述高活性的ck-mm蛋白活性相当的ck-bb蛋白置于第二变性剂溶液中进行第二变性处理得到无活性的变性ck-bb蛋白溶液；
10.将所述变性ck-mm蛋白溶液和所述变性ck-bb蛋白溶液等活性混合，置于复性剂溶液中进行复性处理得到混合蛋白溶液；
11.将所述混合蛋白溶液进行纯化处理得到只含高纯度高活性的肌酸激酶同工酶ck-mb。
12.进一步地，所述第一变性剂溶液为含有3～6m第一变性剂、50～80mm第一缓冲液、5～10mm第一还原剂的溶液，溶液ph为7.0～8.5。
13.进一步地，所述第一变性剂为以下至少一种：盐酸胍、尿素。
14.进一步地，所述第一缓冲液为以下至少一种：tris-hcl缓冲液、pipes缓冲液、mops缓冲液。
15.进一步地，所述第一还原剂为以下至少一种：二硫基苏糖醇(dtt)、半胱氨酸。
16.进一步地，所述第一变性处理条件为：4～25℃下静置或搅拌10～24h。
17.进一步地，所述第二变性剂溶液为含有2～4m第二变性剂、50～80mm第二缓冲液、5～10mm第二还原剂的溶液，溶液ph为7.0～8.5。
18.进一步地，所述第二变性剂为以下至少一种。
19.进一步地，所述第二缓冲液为以下至少一种：tris-hcl缓冲液、pipes缓冲液、mops缓冲液。
20.进一步地，所述第二还原剂为以下至少一种：二硫基苏糖醇(dtt)、半胱氨酸。
21.进一步地，所述第二变性处理条件为：4～25℃下静置或搅拌10～24h。
22.进一步地，所述高活性的ck-mm蛋白的活性为105iu/l-106iu/l。
23.进一步地，所述复性剂溶液含有50～80mm第三缓冲液、5～10mm第三还原剂、0.5～2mm螯合剂；所述复性剂溶液还含有以下至少一种：1～2m保护剂、10wt～20wt％稳定剂、1wt～2wt％表面活性剂。
24.进一步地，，所述复性剂溶液还含有10wt～20wt％稳定剂和1wt～2wt％表面活性剂。
25.进一步地，所述复性剂溶液还含有1～2m保护剂、10wt～20wt％稳定剂和1wt～2wt％表面活性剂。
26.进一步地，所述第三缓冲液为以下至少一种：tris-hcl缓冲液、pipes缓冲液、mops缓冲液。
27.进一步地，所述第三还原剂为以下至少一种：二硫基苏糖醇(dtt)、半胱氨酸。
28.进一步地，所述螯合剂为edta。
29.进一步地，所述保护剂为以下至少一种：bsa、脯氨酸、peg-1000。
30.进一步地，所述稳定剂为以下至少一种：海藻糖、甘油、甘露糖醇。
31.进一步地，所述表面活性剂为以下至少一种：tween20、tritonx100。
32.与现有技术相比，本技术具有以下的技术效果：
33.本技术的一种高效获取高纯度肌酸激酶同工酶ck-mb候选物质的方法通过对不含标签的ck-mm蛋白和不含标签的ck-bb蛋白分别进行变性处理，分别获取变性的ck-m、ck-b亚基。通过将以上两种不存在酶活性的蛋白质混合，并进行复性处理，并纯化制备出不带任何标签的ck-mb。制备出的ck-mb分子不带任何标签、内含可完全模拟人体内环境的ck-mb，更适用于制备人血清ck-mb校准品或质控品。
34.本技术的一种高效获取高纯度肌酸激酶同工酶ck-mb的方法制备出的ck-mb为hplc级别的纯度，且活性高，保证了作为ck-mb标准物质候选物的要求，可用于大量制作人
血清基质ck-mb校准品、质控品。
附图说明
35.为了更清楚地说明本技术实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
36.图1为本技术实施例8提供的ck-mb的分子筛纯化峰图；
37.图2为本技术实施例8提供的ck-mb纯化产物的sds-page电泳图；
38.图3为本技术实施例8提供的ck-mb纯化产物的高效液相色谱图。
具体实施方式
39.为了使本技术要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本技术，并不用于限定本技术。
40.本技术中，术语“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，a和/或b，可以表示：单独存在a，同时存在a和b，单独存在b的情况。其中a，b可以是单数或者复数。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
41.本技术中，“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“以下至少一项(个)”或其类似表达，是指的这些项中的任意组合，包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。例如，“a，b，或c中的至少一项(个)”，或，“a，b，和c中的至少一项(个)”，均可以表示：a，b，c，a-b(即a和b)，a-c，b-c，或a-b-c，其中a，b，c分别可以是单个，也可以是多个。
42.应理解，在本技术的各种实施例中，上述各过程的序号的大小并不意味着执行顺序的先后，部分或全部步骤可以并行执行或先后执行，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本技术实施例的实施过程构成任何限定。
43.在本技术实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本技术。在本技术实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。
44.本技术实施例说明书中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间重量的比例关系，因此，只要是按照本技术实施例说明书相关组分的含量按比例放大或缩小均在本技术实施例说明书公开的范围之内。具体地，本技术实施例说明书中所述的质量可以是μg、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。
45.术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，用来将目的如物质彼此区分开，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。例如，在不脱离本技术实施例范围的情况下，第一xx也可以被称为第二xx，类似地，第二xx也可以被称为第一xx。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。
46.本技术实施例提供了一种高效获取高纯度肌酸激酶同工酶ck-mb的方法，包括以下步骤：
47.(1)将高活性的ck-mm蛋白置于第一变性剂溶液中进行第一变性处理得到无活性
mb蛋白的复性率的作用。在本技术实施中，当复性剂溶液中同时含有10wt～20wt％稳定剂和1wt～2wt％表面活性剂时，可以提高得到的ck-mb蛋白的复性率。在本技术实施中，当复性剂溶液中同时含有1～2m保护剂、10wt～20wt％稳定剂和1wt～2wt％表面活性剂时，可以进一步提高得到的ck-mb蛋白的复性率。
57.在本技术实施中，保护剂可选自以下至少一种：bsa、脯氨酸、peg-1000；稳定剂可选自以下至少一种：海藻糖、甘油、甘露糖醇；表面活性剂可选自以下至少一种：tween20、tritonx100。
58.在本技术实施中，10wt～20wt％稳定剂指的是在复性剂溶液中，稳定剂占复性剂溶液的质量分数为10-20％；同样地，1wt～2wt％表面活性剂指的是在复性剂溶液中，表面活性剂占复性剂溶液的质量分数为1-2％。
59.上述步骤(4)中，通过对复性处理后的混合蛋白溶液进行纯化处理来获得高纯度、高活性的肌酸激酶同工酶ck-mb。
60.本技术实施例的一种高效获取高纯度肌酸激酶同工酶ck-mb候选物质的方法通过对不含标签的ck-mm蛋白和不含标签的ck-bb蛋白分别进行变性处理，分别获取变性的ck-m、ck-b亚基。通过将以上两种不存在酶活性的蛋白质混合，并进行复性处理，并纯化制备出不带任何标签的ck-mb。制备出的ck-mb分子不带任何标签、内含可完全模拟人体内环境的ck-mb，更适用于制备人血清ck-mb校准品或质控品。
61.本技术实施例的一种高效获取高纯度肌酸激酶同工酶ck-mb的方法制备出的ck-mb为hplc级别的纯度，且活性高，保证了作为ck-mb标准物质候选物的要求，可用于大量制作人血清基质ck-mb校准品、质控品。
62.通过本技术实施例的变性处理和复性处理，可以获得高纯度、高活性的ck-mb，复性率达到64.52％，最终产物的活力达到8.8
×
105u/l。
63.以下通过具体实施例来举例说明本技术实施例的一种高效获取高纯度肌酸激酶同工酶ck-mb的方法。
64.实施例1
65.本技术实施例1提供一种高效获取高纯度肌酸激酶同工酶ck-mb的方法，包括以下步骤：
66.(1)将105iu/l级别活性的ck-mm蛋白置于10ml第一变性剂溶液中进行第一变性处理得到变性ck-mm蛋白溶液；第一变性剂溶液的ph为7.5，含有以下成分：6m盐酸胍(gdn-hcl)，50mm tris-hcl缓冲液，5mm dtt，第一变性处理条件为：在4℃下搅拌24h，磁力搅拌器搅拌转速为200rpm。经过变性处理后，使用全自动生化仪检测变性前后肌酸激酶活性，测得ck-mm的变性率为99.7％。
67.(2)将105iu/l级别活性的ck-bb蛋白置于10ml第二变性剂溶液中进行第二变性处理得到变性ck-bb蛋白溶液；第二变性剂溶液的ph为7.5，含有以下成分：4m盐酸胍(gdn-hcl)，50mm tris-hcl缓冲液，5mm dtt，第二变性处理条件与第一变性处理条件相同。经过变性处理后，采用步骤(1)同样的方法测得ck-bb的变性率为98.7％。
68.(3)各取0.5ml变性ck-mm蛋白溶液和变性ck-bb蛋白溶液混合，装入1ml不带针头的注射器中，重力作用下缓慢滴入35ml的复性剂溶液中进行复性处理得到混合溶液；复性剂溶液含有以下成分：50mm tris-hcl缓冲液，2mm dtt，1mm edta，复性处理的条件为：在4
℃下搅拌24h，搅拌转速为200rpm。经过复性处理后，采用同样的方法测得ck-mb的复性率为28.2％。
69.(4)将混合蛋白溶液浓缩至1ml后上样至superdex200 increase 10/300gl分子筛柱中，以0.5ml/min流速，流动相(50mm tris-hcl缓冲液，300mm nacl，5％甘油，1mm dtt)进行纯化。
70.实施例2
71.其与实施例1不同之处在于，步骤(1)中所采用的第一变性剂溶液为：ph为7.5，含有以下成分：6m尿素，50mm tris-hcl缓冲液，5mm dtt，步骤(2)中所采用的第二变性剂溶液均为：4m尿素，50mm tris-hcl缓冲液，5mm dtt。其他处理步骤相同。步骤(1)测得ck-mm的变性率为61.9％，步骤(2)测得ck-bb的变性率为66.7％。
72.实施例3
73.其与实施例1不同之处在于，步骤(1)、步骤(2)中所采用的ck-mm、ck-bb的活性均为104iu/l级别。其他处理步骤相同。步骤(1)测得ck-mm的变性率为90.8％，步骤(2)测得ck-bb的变性率为89.7％，步骤(3)测得ck-mb的复性率为21.6％。
74.实施例4
75.其与实施例1不同之处在于，步骤(3)中，复性剂溶液含有以下成分：50mm tris-hcl缓冲液，2mm dtt，1mm edta，1m脯氨酸。采用同样的方法测得ck-mb的复性率为32.98％。其他处理步骤相同。
76.实施例5
77.其与实施例1不同之处在于，步骤(3)中，复性剂溶液含有以下成分：50mm tris-hcl缓冲液，2mm dtt，1mm edta，10％甘油。采用同样的方法测得ck-mb的复性率为37.85％。其他处理步骤相同。
78.实施例6
79.其与实施例1不同之处在于，步骤(3)中，复性剂溶液含有以下成分：50mm tris-hcl缓冲液，2mm dtt，1mm edta，1％tween20。采用同样的方法测得ck-mb的复性率为35.05％。其他处理步骤相同。
80.实施例7
81.其与实施例1不同之处在于，步骤(3)中，复性剂溶液含有以下成分：50mm tris-hcl缓冲液，2mm dtt，1mm edta，10％甘油，1％tween。采用同样的方法测得ck-mb的复性率为63.31％。其他处理步骤相同。
82.实施例8
83.其与实施例1不同之处在于，步骤(3)中，复性剂溶液含有以下成分：50mm tris-hcl缓冲液，2mm dtt，1mm edta，1m脯氨酸，10％甘油，1％tween。采用同样的方法测得ck-mb的复性率为64.52％。其他处理步骤相同。
84.本技术实施例纯化后的ck-mb的分子筛峰图(akta峰图)如图1所示，峰尖的出峰位置在15.568ml，最高的紫外吸收值为144.842mau。收集出峰位置样品，测定其ck活力达8.8
×
105u/l。对其进行sds-page电泳，结果如图2所示，可见其纯度高，没有杂带。
85.收集出峰位置样品，对其进行高效液相色谱分析，使用agilent-1100，选择superdex5/150分析型柱子，流速为0.5ml/min，20μl，过流动相(50mm tris缓冲液，ph为
8.0，300mm nacl，5％甘油，1mm dtt)后，所得峰图如图3所示。可见其无杂峰，表明所得ck-mb样品纯度非常高。
86.本技术实施例制备的ck-mb活力值达到8.8
×
105u/l，而人体内正常值是25iu/l，可见，本技术实施例制备的ck-mb活性非常高。
87.实施例9
88.其与实施例1不同之处在于，步骤(3)中，复性剂溶液含有以下成分：50mm tris-hcl缓冲液，2mm dtt，1mm edta，1m bsa，10％甘油，1％tween。采用同样的方法测得ck-mb的复性率为63.69％。其他处理步骤相同。
89.实施例1、实施2相比表明，在对ck-mm和ck-bb的变性处理过程中，使用含盐酸胍的变性剂溶液相比于使用含尿素的变性剂溶液，可以使得ck-mm和ck-bb获得更高的变性率。
90.实施例1、实施3相比表明，在对ck-mm和ck-bb的变性、复性处理过程中，使用105iu/l级别的蛋白相比于使用104iu/l级别的蛋白，可以使得ck-mm和ck-bb获得更高的变性率及复性率。
91.实施例1、实施例4-实施例6相比表明，在复性处理过程中，在复性剂溶液中添加脯氨酸或甘油或tween20，可以提高ck-mb的复性率。
92.实施例4-6、实施例7-9相比表明，在复性处理过程中，在复性剂溶液中同时添加甘油和tween20或同时添加脯氨酸、甘油和tween20或同时添加bsa、甘油和tween20，可以进一步显著提高ck-mb的复性率，复性率最高可以达到64.52％。
93.以上实施例仅表达了本技术的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本技术专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本技术构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本技术的保护范围。因此，本技术专利的保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：
1.一种高效获取高纯度肌酸激酶同工酶ck-mb的方法，其特征在于，包括以下步骤：将高活性的ck-mm蛋白置于第一变性剂溶液中进行第一变性处理得到无活性的变性ck-mm蛋白溶液；将与所述高活性的ck-mm蛋白活性相当的ck-bb蛋白置于第二变性剂溶液中进行第二变性处理得到无活性的变性ck-bb蛋白溶液；将所述变性ck-mm蛋白溶液和所述变性ck-bb蛋白溶液等活性混合，置于复性剂溶液中进行复性处理得到混合蛋白溶液；将所述混合蛋白溶液进行纯化处理得到只含高纯度高活性的肌酸激酶同工酶ck-mb。2.如权利要求1所述的一种高效获取高纯度肌酸激酶同工酶ck-mb的方法，其特征在于，所述第一变性剂溶液为含有3～6m第一变性剂、50～80mm第一缓冲液、5～10mm第一还原剂的溶液，溶液ph为7.0～8.5。3.如权利要求2所述的一种高效获取高纯度肌酸激酶同工酶ck-mb的方法，其特征在于，所述第一变性剂为以下至少一种：盐酸胍、尿素；和/或，所述第一缓冲液为以下至少一种：tris-hcl缓冲液、pipes缓冲液、mops缓冲液；和/或，所述第一还原剂为以下至少一种：二硫基苏糖醇、半胱氨酸；和/或，所述第一变性处理条件为：4～25℃下静置或搅拌10～24h。4.如权利要求1所述的一种高效获取高纯度肌酸激酶同工酶ck-mb的方法，其特征在于，所述第二变性剂溶液为含有2～4m第二变性剂、50～80mm第二缓冲液、5～10mm第二还原剂的溶液，溶液ph为7.0～8.5。5.如权利要求4所述的一种高效获取高纯度肌酸激酶同工酶ck-mb的方法，其特征在于，所述第二变性剂为以下至少一种：盐酸胍、尿素；和/或，所述第二缓冲液为以下至少一种：tris-hcl缓冲液、pipes缓冲液、mops缓冲液；和/或，所述第二还原剂为以下至少一种：二硫基苏糖醇、半胱氨酸；和/或，所述第二变性处理条件为：4～25℃下静置或搅拌10～24h。6.如权利要求1所述的一种高效获取高纯度肌酸激酶同工酶ck-mb的方法，其特征在于，所述高活性的ck-mm蛋白的活性为105iu/l-106iu/l。7.如权利要求1所述的一种高效获取高纯度肌酸激酶同工酶ck-mb的方法，其特征在于，所述复性剂溶液含有50～80mm第三缓冲液、5～10mm第三还原剂、0.5～2mm螯合剂；所述复性剂溶液还含有以下至少一种：1～2m保护剂、10wt～20wt％稳定剂、1wt～2wt％表面活性剂。8.如权利要求7所述的一种高效获取高纯度肌酸激酶同工酶ck-mb的方法，其特征在于，所述复性剂溶液还含有10wt～20wt％稳定剂和1wt～2wt％表面活性剂；或所述复性剂溶液还含有1～2m保护剂、10wt～20wt％稳定剂和1wt～2wt％表面活性剂。9.如权利要求7所述的一种高效获取高纯度肌酸激酶同工酶ck-mb的方法，其特征在于，所述第三缓冲液为以下至少一种：tris-hcl缓冲液、pipes缓冲液、mops缓冲液；和/或，所述第三还原剂为以下至少一种：二硫基苏糖醇、半胱氨酸；和/或所述螯合剂为edta。10.如权利要求7所述的一种高效获取高纯度肌酸激酶同工酶ck-mb的方法，其特征在于，所述保护剂为以下至少一种：bsa、脯氨酸、peg-1000；和/或，所述稳定剂为以下至少一种：海藻糖、甘油、甘露糖醇；和/或，
所述表面活性剂为以下至少一种：tween20、tritonx100。

技术总结
本申请提供了一种高效获取高纯度肌酸激酶同工酶CK-MB的方法，包括以下步骤：将高活性的CK-MM蛋白置于第一变性剂溶液中进行第一变性处理得到无活性的变性CK-MM蛋白溶液；将与高活性的CK-MM蛋白活性相当的CK-BB蛋白置于第二变性剂溶液中进行第二变性处理得到无活性的变性CK-BB蛋白溶液；将变性CK-MM蛋白溶液和变性CK-BB蛋白溶液等活性混合，置于复性剂溶液中进行复性处理得到混合蛋白溶液；将混合蛋白溶液进行纯化处理得到高纯度高活性的肌酸激酶同工酶CK-MB。本申请制备出的CK-MB分子不带任何标签、可完全模拟人体环境下的CK-MB，更适用于制备人血清CK-MB校准品或质控品；且制备出的CK-MB活性高、纯度高。纯度高。纯度高。


技术研发人员：胡卫江 胡逸姗 陈铭伟
受保护的技术使用者：嘉兴优瑞生物科技有限公司
技术研发日：2023.04.26
技术公布日：2023/7/25