一种谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇及其制备方法与应用

1.本发明涉及金纳米簇技术领域，尤其涉及一种谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇及其制备方法与应用。


背景技术：

2.au纳米簇(au ncs)因其独特的量子尺寸效应、光学、生物相容性和环境友好等特性在传感、催化和生物成像等领域得到广泛应用。通过改变金纳米簇配体的种类可以进一步扩宽金纳米簇的应用。而目前已有一些研究用谷胱甘肽(gsh)作为保护配体，然而现有大多制备谷胱甘肽保护的金纳米簇或合金纳米簇需要额外加入还原剂(如柠檬酸钠等)，所用原料较多、成本较高。
3.因此，现有技术还有待于改进和发展。


技术实现要素：

4.鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇及其制备方法与应用，旨在解决现有制备谷胱甘肽保护的合金纳米簇需要额外加入还原剂、所用原料较多、成本较高的问题。
5.本发明的技术方案如下：
6.本发明的第一方面，提供一种谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇的制备方法，其中，包括步骤：
7.提供金源、铂源、谷胱甘肽和第一溶剂；
8.将所述金源、铂源、谷胱甘肽加入到第一溶剂中进行反应，得到所述谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇。
9.可选地，所述金源包括氯金酸、氯金酸钾中的至少一种；所述铂源包括氯铂酸、氯铂酸钾中的至少一种，所述第一溶剂包括水、甲醇、n,n-二甲基甲酰胺中的至少一种。
10.可选地，所述反应的温度为37-90℃，所述反应的时间为6.5-24h。
11.可选地，所述金源中的金元素与所述铂源中的铂元素的摩尔比为5：(1～5)。
12.本发明的第二方面，提供一种谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇，其中，采用本发明如上所述的制备方法制备得到。
13.本发明的第三方面，提供一种本发明如上所述的谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇在制备用于检测甲胎蛋白的产品中的应用。
14.可选地，所述产品包括试剂、试剂盒中的一种。
15.可选地，所述检测甲胎蛋白包括步骤：
16.提供电极基底；
17.将生物素修饰的一抗结合在所述电极基底表面，然后滴加牛血清白蛋白溶液；
18.再滴加待测甲胎蛋白溶液，然后滴加二抗标记的谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇，得到修饰电极；
19.通过测定所述修饰电极的电化学发光强度，测定待测甲胎蛋白溶液的浓度。
20.其中，一抗和二抗均是针对甲胎蛋白的抗体。
21.可选地，所述二抗标记的谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇的制备方法包括步骤：
22.将谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇加入到第二溶剂中，然后加入二抗，反应后，将得到的固体产物溶解在第二溶剂中，加入牛血清白蛋白溶液，反应后，得到所述二抗标记的谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇。
23.可选地，所述生物素修饰的一抗通过链霉亲和素、对氨基苯酸结合在所述电极基底表面。
24.有益效果：本发明以谷胱甘肽作为还原剂和保护剂，与金源、铂源通过一步反应制备得到谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇。本发明不需要加入额外的还原剂，所用原料少，成本低，制备方法简单。此外，本发明制备得到的谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇具有较强的电化学发光(ecl)性能，可用于甲胎蛋白的检测。
附图说明
25.图1中a为本发明实施例1中制备得到的谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇的tem结果，b为本发明实施例1中制备得到的谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇的eds结果。
26.图2中a为本发明实施例5中对对比例1中的gsh-au ncs、对比例2中的gsh-pt ncs、实施例1中的gsh-au
2.5
pt ncs进行电化学发光强度测试的结果图，b为对实施例1中的gsh-au
2.5
pt ncs及ru(bpy)
32+
进行电化学发光强度测试的结果图。
27.图3为本发明实施例6中测定的电化学发光强度与时间曲线图。
28.图4为本发明实施例6中测定的电化学发光强度与甲胎蛋白浓度的对数值的曲线图。
29.图5为本发明实施例7中特异性测试结果图。
具体实施方式
30.本发明提供一种谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇及其制备方法与应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
31.除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。
32.本发明实施例提供一种谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇的制备方法，其中，包括步骤：
33.s11、提供金源、铂源、谷胱甘肽和第一溶剂；
34.s12、将所述金源、铂源、谷胱甘肽加入到第一溶剂中进行反应，得到所述谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇。
35.本发明实施例以谷胱甘肽作为还原剂和保护剂，与金源、铂源通过一步反应制备得到谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇。本发明实施例不需要加入额外的还原剂，所用原料少，成本低，制备方法简单。本发明实施例制备得到的谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇具有
较强的电化学发光性能，可用于甲胎蛋白的检测。
36.本发明实施例中谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇中谷胱甘肽与金铂合金纳米簇通过au与谷胱甘肽分子中s形成的共价键、pt与谷胱甘肽分子中s形成的共价键连接。
37.步骤s11中，在一些实施方式中，所述金源包括氯金酸、氯金酸钾中的至少一种，但不限于此。
38.在一些实施方式中，所述铂源包括氯铂酸、氯铂酸钾中的至少一种，但不限于此。
39.在一些实施方式中，所述第一溶剂包括水(例如超纯水)、甲醇、n,n-二甲基甲酰胺中的至少一种。
40.步骤s12中，在一些实施方式中，所述反应的温度为37-90℃，所述反应的时间为6.5-24h。
41.在一些实施方式中，所述金源中的金元素与所述铂源中的铂元素的摩尔比为5：(1～5)。例如可以是5:1、5:2、5:3、5:4、1:1等。
42.本发明实施例还提供一种电化学发光材料，包括谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇。
43.本发明实施例还提供一种采用本发明实施例如上所述的制备方法制备得到的谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇。单金属金纳米簇的电化学发光效率较低，而本实施例中双金属金铂合金纳米簇由于金铂之间的协同效应，可使纳米簇的电化学发光强度显著提升。同时本发明实施例中的谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇可用于甲胎蛋白的微量检测，检测范围为0.01-1000ng
·
ml-1
，检测线为1.0pg
·
ml-1
。
44.甲胎蛋白(afp)是一种肿瘤标志物，主要由新生儿的肝脏、卵黄囊和胃肠道产生。成熟和健康的肝细胞不产生甲胎蛋白，因此健康成人血清甲胎蛋白水平低于20ng
·
ml-1
。然而，当人们患有某些恶性肿瘤时，血清中甲胎蛋白浓度通常高于25ng
·
ml-1
。因此，开发准确检测人血清中的甲胎蛋白及其浓度的方法至关重要。基于此，本发明实施例还提供一种本发明如上所述的谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇在制备用于检测甲胎蛋白的产品中的应用。金铂合金纳米簇具有较高的电化学发光强度，可用于甲胎蛋白的微量检测，检测范围为0.01-1000ng
·
ml-1
，检测线为1.0pg
·
ml-1
。
45.在一些实施方式中，所述产品包括试剂、试剂盒中的一种，但不限于此。
46.在一些实施方式中，所述检测甲胎蛋白包括步骤：
47.s21、提供电极基底；
48.s22、将生物素修饰的一抗结合在所述电极基底表面，然后滴加牛血清白蛋白溶液；
49.s23、再滴加待测甲胎蛋白溶液，然后滴加二抗标记的谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇，得到修饰电极；
50.s24、通过测定所述修饰电极的电化学发光强度，测定待测甲胎蛋白溶液的浓度；
51.其中，一抗和二抗均是针对甲胎蛋白的抗体。
52.本实施方式中，采用双极放大策略，以谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇作为电化学发光信号标记物，建立一个具有“抗体-抗原-抗体”三明治免疫夹心结构的修饰电极(即免疫传感器)。利用链霉亲和素和生物素之间的强亲和力，形成一种新型的生物反应扩增体系，有助于提高修饰电极的电化学发光效率，使其具有更宽的检测范围；基于抗原与抗体之
间的特异性结合作用，一方面实现了对抗原分子(甲胎蛋白)的特异性检测，另一方面又提高修饰电极的电化学发光效率，进一步拓宽其检测范围，实现了对甲胎蛋白微量检测，对甲胎蛋白具有宽检测范围。
53.步骤s21中，在一些实施方式中，所述电极基底包括但不限于玻碳电极、丝网印刷电极中的一种。
54.步骤s22中，在一些实施方式中，所述生物素修饰的一抗通过链霉亲和素或对氨基苯酸结合在所述电极基底表面。具体地，先将链霉亲和素滴加在电极基底表面或将对氨基苯酸通过电沉积的方式固定到电极基底表面，然后由于链霉亲和素和生物素之间具有强亲和力作用，当滴加生物素修饰的一抗时，生物素修饰的一抗会与电极基底表面的链霉亲和素相结合；或由于对氨基苯酸和生物素修饰的一抗之间可以发生酰胺化反应，当滴加生物素修饰的一抗时，生物素修饰的一抗通过与电极基底表面的对氨基苯酸发生酰胺化反应结合在所述电极基底表面。
55.在一些实施方式中，所述将生物素修饰的一抗结合在所述电极基底表面的步骤具体包括：
56.将浓度为10-1000μg
·
ml-1
的链霉亲和素溶液滴加电极基底表面或将对氨基苯酸通过电沉积的方式固定到电极基底表面；
57.然后滴加浓度为10-1000μg
·
ml-1
的生物素修饰的一抗溶液，使得所述生物素修饰的一抗结合在所述电极基底表面。
58.步骤s22中，在生物素修饰的一抗上如果直接滴加抗原(甲胎蛋白)，一抗和抗原之间可能发生酰胺化反应，这样抗原抗体之间的结合就可能不是由于两者之间的特异性造成的，滴加牛血清白蛋白，可以封闭生物素修饰的一抗上的羧基基团，阻止可能发生的酰胺化反应。
59.步骤s23中，由于抗原抗体之间的特异性结合作用，滴加待测甲胎蛋白溶液时，甲胎蛋白会与一抗分子结合，滴加二抗标记的谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇时，二抗与抗原(甲胎蛋白)特异性结合，构建了“抗体-抗原-抗体”的免疫夹心结构。
60.在一些实施方式中，所述二抗标记的谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇的制备方法包括步骤：
61.将谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇加入到第二溶剂中，然后加入二抗，反应后，将得到的固体产物溶解在第二溶剂中，加入牛血清白蛋白溶液(可封闭二抗上的羧基基团，阻止后续可能发生的二抗与甲胎蛋白之间的酰胺化反应，保证后续二抗与甲胎蛋白的特异性结合)，反应后，得到所述二抗标记的谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇。
62.步骤s23中，以溶液的形式滴加二抗标记的谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇，溶液中二抗标记的谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇的浓度为10-1000μg
·
ml-1
。
63.步骤s24中，通过测定所述修饰电极的电化学发光强度，测定待测甲胎蛋白溶液的浓度。具体地，可先配制一系列已知的不同浓度的甲胎蛋白溶液，制备一系列修饰电极，测试其电化学发光强度，得到甲胎蛋白溶液与电化学发光强度的关系曲线，然后当测定未知浓度甲胎蛋白溶液时，通过测定的电化学发光强度，并根据甲胎蛋白溶液与电化学发光强度的关系曲线，即可得到此未知浓度甲胎蛋白溶液的浓度(将测定的电化学发光强度代入到关系曲线中，得到未知浓度甲胎蛋白溶液的浓度)。
64.测试所述修饰电极的电化学发光强度时，以三乙胺为共反应剂，通过循环伏安法测试所述修饰电极的电化学发光信号，实现了对甲胎蛋白的微量检测。具体地，当甲胎蛋白浓度增大时，结合的二抗标记的金铂合金纳米簇就越多，由于金铂合金纳米簇具有电化学发光特性，所以二抗标记的金铂合金纳米簇越多，电化学信号就越强，因此可以达到检测甲胎蛋白浓度的效果。
65.下面通过具体的实施例进行详细说明。
66.以下实施例中针对甲胎蛋白的生物素修饰的一抗购于上海领潮生物技术有限公司，型号为l1c00301，针对甲胎蛋白的二抗购于上海领潮生物技术有限公司，货号为l1c00302。
67.实施例1
68.谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇的制备：
69.将haucl4(1ml，20mm)水溶液与h2ptcl6(1ml，6.67mm)水溶液混合，加入谷胱甘肽(gsh)水溶液(2ml、15mm)，37℃下反应24h，离心纯化，固体置于烘箱中干燥，得到谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇，4℃保存备用。
70.对谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇通过tem-eds分析，结果如图1中b所示，可知谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇中au和pt原子个数比为2.5:1，将谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇记作gsh-au
2.5
pt ncs；对gsh-au
2.5
pt ncs进行tem表征，其tem结果如图1中(a)所示，gsh-au
2.5
pt ncs尺寸上具有良好的单分散性，粒径在2.39
±
0.31nm。
71.实施例2
72.本实施例提供一种谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇，其制备方法与实施例1的区别仅在于h2ptcl6水溶液的浓度为20mm。
73.实施例3
74.本实施例提供一种谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇，其制备方法与实施例1的区别仅在于h2ptcl6水溶液的浓度为4mm。
75.对比例1
76.本实施例提供一种谷胱甘肽保护的金纳米簇，其制备方法与实施例1基本相同，区别仅在于不加入h2ptcl6，得到的产物记作gsh-au ncs。
77.对比例2
78.本实施例提供一种谷胱甘肽保护的铂纳米簇，其制备方法与实施例1基本相同，区别仅在于不加入haucl4，得到的产物记作gsh-pt ncs。
79.实施例5
80.对实施例1中的gsh-au
2.5
pt ncs、对比例1中的gsh-au ncs、对比例2中的gsh-pt ncs及ru(bpy)
32+
进行电化学发光强度测试。
81.将0.2m三乙胺(tea)溶解在0.1m pbs(ph＝7.4)中，然后分别加入1mg
·
ml-1
的对实施例1中的gsh-au
2.5
pt ncs、对比例1中的gsh-au ncs、对比例2中的gsh-pt ncs，以5mm玻碳电极为工作电极、ag/agcl电极为参比电极，pt片电极为对电极浸入到上述溶液中，进行循环伏安测试，0-1.2v正向扫描，扫描速度为50mv/s，检测ecl信号，通过光电倍增管(pmt＝700v)转换为电信号，分别测试gsh-au ncs/tea、gsh-pt ncs/tea、gsh-au
2.5
pt ncs/tea体系的电化学发光峰值强度，测试结果如图2中a所示，图a中，a表示gsh-au ncs/tea，b表示
gsh-pt ncs/tea、c表示gsh-au
2.5
pt ncs/tea，可见gsh-au
2.5
pt ncs/tea体系具有最好的电化学发光峰值强度，其峰值强度分别是gsh-au ncs/tea和gsh-pt ncs/tea体系的6.8倍和94倍。
82.利用上述方法(与上述方法相同的实验条件)，对实施例1中的gsh-au
2.5
pt ncs及ru(bpy)
32+
进行电化学发光强度测试，结果如2中b所示，可见当tea浓度相同为0.2m时，1mg
·
ml-1
gsh-au
2.5
pt ncs的电化学发光强度是0.6μmru(bpy)
32+
的电化学发光强度的3.14倍。
83.实施例6
84.本实施例中链霉亲和素溶液、生物素修饰的一抗溶液、二抗标记的gsh-aupt ncs溶液的溶剂均为pbs缓冲液(10mm，ph＝7.4)。
85.在新抛光的5mm玻碳电极(gce)表面，滴加20μl浓度为0.01mg
·
ml-1
链霉亲和素溶液，孵化后用pbs冲洗；再滴加20μl浓度为0.01mg
·
ml-1
的生物素修饰的一抗(afp biotin-ab1)溶液，孵化后用pbs缓冲液冲洗；滴加20μl 1％的牛血清白蛋白水溶液，孵化后pbs缓冲液冲洗；滴加20μl不同浓度的甲胎蛋白溶液(浓度分别为0、0.01、0.1、1、5、10、100、1000ng
·
ml
–1)，孵化后pbs缓冲液冲洗；最后，滴加20μl浓度为0.01mg
·
ml-1
的二抗标记的gsh-au
2.5
pt ncs(记作afp ab
2-gsh-aupt ncs)溶液，得到修饰电极。
86.以修饰电极为工作电极、ag/agcl电极为参比电极，pt片电极为对电极，浸在tea的pbs溶液(0.2m tea溶解在0.1m pbs缓冲液，ph＝7.4)中，进行循环伏安测试，0-1.2v正向扫描，扫描速度为50mv/s，检测ecl信号，通过光电倍增管(pmt＝800v)转换为电信号。实现了对甲胎蛋白的微量检测，结果如图3和4所示。结果表明电化学发光强度与相应的甲胎蛋白浓度对数曲线在0.01-1000ng
·
ml-1
范围内呈线性关系(r2＝0.994)，检测线lod为1.0pg
·
ml-1
(s/n＝3)，即检测范围为0.01-1000ng
·
ml-1
，检测线为1.0pg
·
ml-1
。
87.其中：
88.afp ab
2-gsh-aupt ncs的制备方法为：将1mg gsh-au
2.5
pt ncs溶解于pbs缓冲液中，加入1ml浓度为10μg
·
ml-1
二抗(afp-ab2)溶液，反应后离心洗涤，得到的固体溶解在pbs中，加入0.5ml，1％牛血清白蛋白水溶液，反应后离心洗涤。最终得到的固体溶解在pbs缓冲液中，浓度为0.01mg
·
ml-1
，并于4℃保存。
89.实施例7特异性检测实验
90.与实施例6的区别在于，将滴加20μl不同浓度的甲胎蛋白溶液替换为分别滴加20μl浓度为100ng
·
ml-1
的psa、浓度为100ng
·
ml-1
的cea、浓度为100ng
·
ml-1
的cyfra211、浓度为100ng
·
ml-1
的hcg、浓度为10ng
·
ml
–1的甲胎蛋白(afp)溶液。电化学发光强度测试结果如图5所示，其中mix表示100ng
·
ml-1
的psa、100ng
·
ml-1
的cea、100ng
·
ml-1
的cyfra211、100ng
·
ml-1
的hcg和10ng
·
ml
–1afp溶液混合物，可见本发明提供的基于谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇的修饰电极对甲胎蛋白具有检测特异性。
91.综上所述，本发明提供一种谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇及其制备方法与应用。本发明以谷胱甘肽作为还原剂和保护剂，与金源、铂源通过一步反应制备得到谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇。本发明不需要加入额外的还原剂，所用原料少，成本低，制备方法简单。此外，本发明制备得到的谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇具有较强的电化学发光性能，进而基于谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇通过建立一个三明治免疫夹心结构，实现了
对甲胎蛋白微量检测，检测范围为0.01-1000ng
·
ml-1
，检测线为1.0pg
·
ml-1
。
92.应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

技术特征：
1.一种谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇的制备方法，其特征在于，包括步骤：提供金源、铂源、谷胱甘肽和第一溶剂；将所述金源、铂源、谷胱甘肽加入到第一溶剂中进行反应，得到所述谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述金源包括氯金酸、氯金酸钾中的至少一种；所述铂源包括氯铂酸、氯铂酸钾中的至少一种，所述第一溶剂包括水、甲醇、n,n-二甲基甲酰胺中的至少一种。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述反应的温度为37-90℃，所述反应的时间为6.5-24h。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述金源中的金元素与所述铂源中的铂元素的摩尔比为5：(1～5)。5.一种谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇，其特征在于，采用如权利要求1-4任一项所述的制备方法制备得到。6.一种权利要求5所述的谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇在制备用于检测甲胎蛋白的产品中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂、试剂盒中的一种。8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述检测甲胎蛋白包括步骤：提供电极基底；将生物素修饰的一抗结合在所述电极基底表面，然后滴加牛血清白蛋白溶液；再滴加待测甲胎蛋白溶液，然后滴加二抗标记的谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇，得到修饰电极；通过测定所述修饰电极的电化学发光强度，测定待测甲胎蛋白溶液的浓度；其中，一抗和二抗均是针对甲胎蛋白的抗体。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述二抗标记的谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇的制备方法包括步骤：将谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇加入到第二溶剂中，然后加入二抗，反应后，将得到的固体产物溶解在第二溶剂中，加入牛血清白蛋白溶液，反应后，得到所述二抗标记的谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇。10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述生物素修饰的一抗通过链霉亲和素、对氨基苯酸结合在所述电极基底表面。

技术总结
本发明公开一种谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇及其制备方法与应用，制备方法包括步骤：提供金源、铂源、谷胱甘肽和第一溶剂；将所述金源、铂源、谷胱甘肽加入到第一溶剂中进行反应，得到所述谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇。本发明以谷胱甘肽作为还原剂和保护剂，与金源、铂源通过一步反应制备得到谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇。本发明不需要加入额外的还原剂，所有原料少，成本低，制备方法简单。此外，本发明制备得到的谷胱甘肽保护的金铂合金纳米簇具有较强的电化学发光性能，可用于甲胎蛋白的检测。白的检测。白的检测。


技术研发人员：张玲 周慧文 刘阮珊
受保护的技术使用者：哈尔滨工业大学（深圳）
技术研发日：2023.04.13
技术公布日：2023/7/25