Sn-2长链多不饱和脂肪酸结构脂及其制备方法和应用

sn-2长链多不饱和脂肪酸结构脂及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于功能性食品技术领域，具体涉及sn-2长链多不饱和脂肪酸结构脂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.肥胖会显著增加患糖尿病、动脉粥样硬化、高脂血症、高血压等疾病的风险，现已成为全球主要的公共健康问题。肥胖的原因主要在于摄入过多的膳食能量，并且体内卡路里消耗不足从而导致脂肪在体内形成了系统性累积。如何优化膳食中油脂种类及开发低热量脂肪已成为预防及控制肥胖的有效途径。目前，利用结构脂来优化油脂种类以降低患病风险的相关研究已成为近年来的研究热点。利用油脂定向修饰技术，不仅可以将天然油脂中特定的脂肪酸进行修饰从而发挥相应的营养特性，还可以用于预防某些疾病或改善代谢条件，这一领域已成为油脂界和营养界科研工作者的共识。
3.在结构脂中，mlm型结构脂被认为是结构脂最理想的结构形式。mlm型结构脂是指在甘油碳链的sn-2位连接长碳链脂肪酸(l)，sn-1,3位连接中碳链脂肪酸(m)的一种特殊结构脂。已有研究表明，mlm型结构脂具有吸收好、功能强的优势和特点，具有最大的保健和营养特性，并具有抗菌、抗炎症的特性。
4.目前，针对mlm型结构脂的合成制备方法主要采用酶法合成。与化学法相比，酶解法由于条件温和、催化专一性高、易于分离等优点，在制备mlm型结构脂产品中得到了广泛应用。现有技术中一般采用一步酶法和三步酶法来制备mlm型结构脂。一步酶法制备mlm型结构脂存在去除副产物(如甘二脂)困难、纯化较复杂、酰基迁移率高的缺点；三步酶法过程主要由三种以上不同定位脂肪酶对甘油和酰基供体进行酯化、甘油水解和酸解，因此合成过程耗时长、成本高、环保效益差，很难进行大规模工业化生产。


技术实现要素：

5.针对上述现有技术，本发明提供一种sn-2长链多不饱和脂肪酸结构脂及其制备方法和应用，为降低体重和体脂率开辟新的方法，同时解决现有技术中结构脂合成耗时长、成本高以及副产物多的技术问题。
6.为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是，提供一种sn-2长链多不饱和脂肪酸结构脂在制备降低体重和体脂率的食品中的应用；sn-2长链多不饱和脂肪酸结构脂为甘油碳链的sn-2位连接长碳链脂肪酸、sn-1,3位连接中碳链脂肪酸后所形成的脂，其中，长碳链脂肪酸的碳原子数为15～25，中碳链脂肪酸的碳原子数为6～10。
7.在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
8.进一步，长碳链脂肪酸的碳原子数为22，中碳链脂肪酸的碳原子数为8。
9.进一步，sn-2长链多不饱和脂肪酸结构脂的结构式如式i所示：
[0010][0011]
其中，r为
[0012]
本发明还公开了一种sn-2长链多不饱和脂肪酸结构脂的制备方法，包括以下步骤：
[0013]
(1)制备sn-2长链单甘脂2d-mag
[0014]
将藻油和sn-1,3特异性水解酶按8～10:2～5的质量比共溶于无水乙醇中，于30～55℃下搅拌反应4～16h；然后将去除sn-1,3特异性水解酶后的反应物加入到由正己烷和koh醇溶液按3:1的体积比混合而成的混合液中，剧烈振荡后静置，收集乙醇相并蒸发去除有机溶剂，即得2d-mag；
[0015]
(2)制备sn-2长链多不饱和脂肪酸1,3c-2d-tag
[0016]
将2d-mag、辛酸、脂肪酶和4a分子筛按80～120:140～160:20～30:1～3的质量比共溶于有机溶剂中，于35～45℃下搅拌反应4～6h，即得1,3c-2d-tag。
[0017]
进一步，2d-mag在使用前经过了纯化，纯化包括以下步骤：
[0018]
将2d-mag按1g:15ml的料液比溶于正己烷中，然后加入85％的乙醇水溶液，静置分层；取下层萃取层并蒸发去除有机相，然后将所得物料溶于由乙醇和正己烷按9:1的体积比混合而成的混合液中，以3000～4000rpm的速度离心4～6min，取上层2d-mag的己烷相，并蒸发去除有机相，即得。
[0019]
进一步，有机溶剂为正己烷。
[0020]
进一步，sn-1,3特异性水解酶为lipozyme rm im或novozym 435；脂肪酶为lipozyme rmim、lipozyme tl im或novozym 435。
[0021]
进一步，步骤(1)中搅拌反应的搅拌速率为200rpm，振荡时间为2min，静置时间为5mim。
[0022]
进一步，还包括1,3c-2d-tag的纯化步骤，纯化方法包括以下步骤：
[0023]
s1：将硅胶和氧化铝等质量混合，再将混合物按2g:5ml的料液比分散于正己烷中，然后将所得浆料填装进300
×
30mm的色谱柱中，得到分离纯化柱；
[0024]
s2：将反应所得1,3c-2d-tag装入分离纯化柱，用洗脱液洗脱，利用tlc和hplc监测从分离纯化柱流出的洗脱液，收集含有的1,3c-2d-tag结构脂的洗脱液，再蒸发去除有机相，即得。
[0025]
本发明的有益效果是：
[0026]
1、本发明采用两步酶法制备sn-2长链多不饱和脂肪酸结构脂，可大大减少酰基转移的发生，在增强反应特异性的同时还提高了工艺生产率，有利于特殊结构脂的生成。
[0027]
2、本发明所制备的sn-2长链多不饱和脂肪酸结构脂(mlm型结构脂)能够使动物脂肪组织减少，肝脏重量降低，粪便中排泄的脂肪量增加，血浆中hdl-胆固醇水平显著升高，而总胆固醇和ldl-胆固醇水平则明显下降，即对体重和体脂率的的降低具有积极作用。
附图说明
[0028]
图1为sn-2长链多不饱和脂肪酸结构脂的合成流程图；
[0029]
图2为底物比率(藻油/乙醇,mol/mol)对2d-mag合成率的影响；
[0030]
图3为不同种类的sn-1,3特异性水解酶对藻油2d-mag含量的影响；
[0031]
图4为sn-1,3特异性水解酶添加量对2d-mag合成的影响；
[0032]
图5为反应温度对2d-mag合成的影响；
[0033]
图6为反应时间对2d-mag合成的影响；
[0034]
图7为不同种类结构脂薄层色谱图；
[0035]
图8为纯化前、后样品中2d-mag液相色谱图；
[0036]
图9为不同种类脂肪酶对单甘脂sn-1,3位辛酸插入率的影响；
[0037]
图10为不同饲料组对c57bl/6小鼠体重增加的影响；每个组别中左侧为饲喂前体重，右侧为饲喂后体重；
[0038]
图11为不同饲料组对c57bl/6小鼠血尿素氮(bun)浓度的影响；
[0039]
图12为不同饲料组对c57bl/6小鼠谷草转氨酶(ast)浓度的影响；
[0040]
图13为不同饲料组对c57bl/6小鼠谷丙转氨酶(alt)浓度的影响；
[0041]
图14为不同饲料组对c57bl/6小鼠胆固醇浓度的影响；
[0042]
图15为不同饲料组对c57bl/6小鼠甘油三脂浓度的影响；
[0043]
图16为不同饲料组对c57bl/6小鼠高密度脂蛋白(hdl-c)含量的影响；
[0044]
图17为不同饲料组对c57bl/6小鼠低密度脂蛋白(ldl-c)含量的影响；
[0045]
图18和19为不同饲料组对c57bl/6小鼠肝脏及肾脏组织切片影响；
[0046]
图20为不同饲料组对c57bl/6小鼠瘦素浓度的影响。
具体实施方式
[0047]
下面结合实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
[0048]
实施例
[0049]
一种sn-2长链多不饱和脂肪酸结构脂，其合成流程如图1所示，具体合成步骤如下：
[0050]
1、制备sn-2长链单甘脂2d-mag
[0051]
称取0.9g藻油和适量无水乙醇(以藻油中甘油三脂能完全反应为准)加入至50ml具塞锥形瓶中，加入0.4g的sn-1,3特异性水解酶(4％-16％，底物质量分数)，在转速为200rpm、30～55℃反应条件下进行磁力搅拌4～16h。然后将反应混合物离心后过滤除去脂肪酶。取离心样品，加入30ml正己烷和10ml 0.8mol/l的koh醇溶液(30％乙醇)，剧烈振荡2min后静置5min，下层醇-水溶液中加入15ml正己烷进行二次提取，剧烈振荡2min后静置分层。形成两层后收集富含2d-mag的乙醇相，以相同体积的正己烷洗涤两次。合并两次萃取所得上清液，在40℃水域温度下旋转蒸发去除有机溶剂，即得。
[0052]
通过对藻油脂肪酸组成(表1)进行分析发现，c22:6(44.37％)和c16:0(27.5％)是藻油主要的脂肪酸成分，除此以外，c22:5、c14:0和c18:1含量也较多，分别达到7.42％，6.21％和5.37％。在藻油总脂肪酸中，多不饱和脂肪酸大多数是具有生理活性的n-3pufa，其含量约占藻油pufa(多不饱和脂肪酸)含量的85.38％。在藻油甘油三酯的sn-2位置上dha
含量最高(47.38％)，其次是c16:0(18.85％)和c22:5(11.34％)。pufa在藻油sn-2位的比例高达64.29％，这表明藻油是sn-2长链多不饱和脂肪酸结构脂较为理想的制备原料。目前，已有多个商品化的dha藻油上市，其中主要以裂壶藻和吴肯氏藻种类居多，本发明选用吴肯氏藻油作为dha的供体来源，尽管不同藻类脂肪酸组成有所差异，但大多数藻油的dha含量均较其他来源高，是仅次于鱼油提供丰富dha的理想来源。
[0053]
表1.藻油脂肪酸及sn-2位脂肪酸含量
[0054][0055][0056]
(1)在酶催化合成2d-mag反应过程中，反应达到平衡后产物的组成与底物物质的量比有密切关系。由图2可知，随着底物中藻油/乙醇摩尔比的升高，2d-mag的生成率显著增加(p《0.05)，当藻油/乙醇摩尔比为1:80时2d-mag的生成比例为37.2％，均高于其他实验组(p《0.05)。
[0057]
(2)为了筛选出最适宜催化2d-mag的sn-1,3特异性水解酶，对6种不同的脂肪酶novozym 435、lipozyme rm im、lipozyme tl im、newlase f、lipase ay和lipase ak进行筛选和测试。由图3可知，在酶催化藻油的醇解反应中，不同脂肪酶催化合成2d-mag的效果有较大差异，六种脂肪酶催化生成2d-mag的活性由高到低依次为：lipozyme rm im》novozym 435》lipozyme tl im》newlase f》lipase ak》lipase ay。其中，lipozyme rm im和novozym 435催化形成2d-mags的含量相对较高，分别为34.7％和28.1％，这反映出lipozyme rm im较其他脂肪酶的催化能力更强。lipozyme tl im及lipase ak和newlase f催化藻油形成2d-mag的含量分别为13.3％、9.6％和11.3％，显著低于lipozyme rm im和novozym 435(p《0.05)。甘油三酯上sn-2酰基位置具有较大的空间位阻，sn-2位置较sn-1,3更难以酰基化。因此，具有相同特异性脂肪酶的催化效果受空间位阻及脂肪酸结构的影响较大，与脂肪酶novozym 435和lipozyme tl im相比，lipozyme rm im能区域和立体选择性
催化甘油三酯sn-1,3位发生水解、酯化和酯交换反应，催化2d-mag能力较好，故本发明优先采用lipozyme rm im脂肪酶作为sn-1,3特异性水解酶来制备2d-mag。
[0058]
(3)一般情况下，酶作为合成反应催化剂与反应速率及产物生成量呈正相关关系。本发明考察了4～16％ sn-1,3特异性水解酶添加量(占反应底物总质量的百分比)对2d-mag合成率的影响。由图4可见，当lipozyme rm im含量从4％增加至10％后，2d-mag生成量从22.4％增加至39.1％(p《0.05)，这表明加酶量对酶解效果有显著的影响，此时酯化反应主要表现为酶控制反应。当加酶量超过10％后，2d-mag生成量由39.1％逐渐下降至33.5％(p《0.05)，说明酶量的增加并没有进一步提高产物的生成率，此时表现为底物控制反应。
[0059]
(4)一般而言，反应温度的升高会加快反应速度从而缩短反应时间，但过高的温度则会降低脂肪酶活性和反应物的稳定性。由图5可知，2d-mag的合成率变化分为两个阶段，当反应温度从30℃升高至35℃时，2d-mag合成率由33.5％增加至35.8％，当反应体系继续由35℃升温至55℃后，合成率则出现下降趋势。这表明35℃是lipozyme rm im催化合成2d-mag的最适温度，该温度下2d-mag的得率最高，因此35℃是合成2d-mags较为理想的温度水平。
[0060]
(5)大多数酶的最适温度不是完全固定的，它与作用时间长短有关，当反应时间延长时酶的最适温度会向反应所需温度数值较低的方向移动。由图6可见，随着反应的持续tag(甘油三酯)由最高值91.3％逐渐降低至2.5小时后的3.4％(p《0.05)，这表明酶催化反应在0～3h内反应速率较高。在此期间，2d-mag和1,2-dag逐渐升高，其中2d-mag在第3h后达到最高值41.2％(p《0.05)，表明tag醇解反应速度在0～3小时范围较快，随着反应的持续进行2d-mag含量开始下降，6h后降至19％(p《0.05)。过长的醇解反应时间可能会导致大量的游离脂肪酸生成，甚至sn-2位的酰基转移生成1-mag/1,3-dag之后被进一步醇解生成甘油和ees(乙酯)。综合反应时间及合成产物积累的因素，反应时间为3h时酯化反应效率最高、时间成本较低。
[0061]
2、sn-2长链单甘脂2d-mag的纯化
[0062]
将1g步骤(1)制得的产物溶解于15ml正己烷中，然后加入10ml 85％乙醇水溶液，将混合溶液转移到分离漏斗中静置分层。形成两层后，去除含有酯类和未反应甘油三酯残基上层，保留含2d-mag的下层萃取层。将下层萃取层在40℃水浴条件下旋转蒸发干其他有机相，然后将样品加入至乙醇/正己烷(90:10v/v)溶液中以3500rpm的速度离心5分钟，吸取上层2d-mag的己烷相，蒸发去除有机相，即得纯化后的2d-mag。
[0063]
(1)薄层色谱(tlc)是一种简单的反应产物定性方法，它能够利用各组分在固定相分离差异的不同简单、快速的对产物进行定性。本发明利用tlc技术分别对藻油、步骤(1)制得的2d-mag及纯化后的2d-mag进行分析，并根据薄层色谱中斑点的比移值(rf)对各组分进行初步判断(图7)。结果显示藻油中分别含有单甘脂(rf≈0.05)、游离脂肪酸(rf≈0.1～0.4)、甘油二酯(rf＝0.48)和甘油三酯(rf≈0.70)。通过酶法催化藻油与乙醇反应得到的2d-mag在tlc板中仅出现一个斑点(rf≈0.06)，初步断定制备的最终产物中单甘脂含量较多。由于产物未经纯化，因此tlc的斑点有拖尾现象。对2d-mag进一步萃取纯化后，2d-mag的斑点拖尾现象消失且斑点更加集中，表明用sn-1,3特异性水解酶催化藻油醇解形成了单甘脂，且纯化方法提高了单甘脂的纯度。
[0064]
(2)图8显示的是2d-mag样品在纯化前和纯化后的hplc结果。2d-mag纯化前分别在
4.9min和5.5min有最大样品峰出现，表明同时存在两种单甘脂或分子内发生了酰基转移现象。一般条件下单甘酯是1-mag和2-mag的混合物，这是由于分子内酰基转移的活化能比较低。经过纯化处理后，2d-mag仅在5.5min处有最大样品峰且未见4.9min的样品峰，这表明本研究采用的溶剂萃取法能够在低温条件下结晶分离得到纯度为88.5％的2d-mag，通过结构脂的tlc和hplc均证明了该制备方法和纯化方法是可靠有效的。
[0065]
3、制备sn-2长链多不饱和脂肪酸结构脂1,3c-2d-tag
[0066]
将100g纯化后的2d-mag、150g辛酸、25g脂肪酶和2g 4a分子筛加入到1000ml正己烷中，在转速为200rpm、40℃反应条件下进行磁力搅拌5h，待反应结束后，以5000rpm的转速离心10min，以去除脂肪酶，得到1,3c-2d-tag。
[0067]
为了确定酯化反应中适宜的脂肪酶，对三种脂肪酶lipozyme rm im、lipozyme tl im和novozym 435进行了对比筛选。由图9可知，三种脂肪酶催化辛酸插入sn-1,3位形成mlm型结构脂的合成率有明显差异，其中lipozyme rm im的催化活性最高，辛酸的插入率达到34.6％。lipozyme tl im和novozym 435催化后辛酸的插入率分别为25.1％和32.2％，三种脂肪酶的催化活性由高到低依次为：lipozyme rm im》lipozyme tl im》novozym 435。
[0068]
4、sn-2长链多不饱和脂肪酸结构脂1,3c-2d-tag的纯化
[0069]
离心去除脂肪酶后，用无水硫酸钠干燥有机相，并通过真空蒸发除去过量的溶剂。使用柱色谱法纯化反应混合物：将10g硅胶和10g氧化铝加入到50ml正己烷中制成浆料，然后倒入300
×
30mm色谱柱中。将步骤3制得的1,3c-2d-tag(含有mag、dags、tags)装载到层析柱上，然后用正己烷/乙醚(95/5,v/v)溶液进行洗脱。回收洗脱后的分级组分，用tlc和hplc对洗脱后的组分进行分析，根据分析结果收集纯化后的1,3c-2d-tag结构脂。
[0070]
实验例
[0071]
1、gc-fid法测定sn-2长链多不饱和脂肪酸结构脂sn-2位脂肪酸的组成
[0072]
脂肪酸甲酯化采下述方法进行分析：用2ml 0.5m naoh-ch3oh与3g样品在60℃下皂化30分钟，并在60℃下与14％三氟化硼反应5分钟。反应完成后，用约2ml己烷萃取脂肪酸甲酯，然后计算所得的单甘脂sn-2位上脂肪酸组成的摩尔百分比。
[0073]
气相色谱条件：色谱柱为ffap毛细管柱(agilent，30m
×
0.25mm
×
0.5μm；检测器为fid。载气为n2，流速设定为1.0ml/min，进样口压力为25psi，分流比设定为30:1。初始炉温设置为140℃保持1min，然后以10℃/min的速度增加到230℃并保持8min。检测器的温度保持在280℃。根据脂肪酸的标准分析，峰值时间和相对峰面积将用于脂肪酸甲酯的定量和定性分析。sn-2长链多不饱和脂肪酸结构脂修饰前后脂肪酸组成及含量如表2所示。
[0074]
表2.藻油修饰前后脂肪酸组成及含量
[0075][0076][0077]
注：nf表示未发现；sfa表示饱和脂肪酸；mufa表示单不饱和脂肪酸；pufa表示多不饱和脂肪酸
[0078]
藻油的脂肪酸主要以c22:6(44.37％)和c16:0(27.5％)为主，其次是c14:0、c18:1和c22:5，含量分别为6.21％、5.37％和7.42％(表2)。其中pufa在藻油sn-2位的比例高达64.29％，显著高于sfa(28.16％)和mufa(5.01％)，特别是47.38％的dha在天然藻油中主要集中在甘油三酯sn-2位上，远高于其他脂肪酸含量，这表明天然藻油是sn-2多不饱和脂肪酸mlm结构脂的理想修饰原料之一。修饰后的mlm结构脂主要以c22:6、c16:0和c8:0为主，含量分别为38.14％、24.39％和20.35％。与天然藻油相比，结构脂中辛酸插入率为33.16％且主要位于甘油骨架sn-1,3位，插入的辛酸中93.82％分布在甘油骨架sn-1,3位上，7.48％分布在sn-2位上。修饰后的结构脂中sn-1,3位dha从45.87％下降至37.52％(p《0.05)，而sn-1,3位的辛酸则上升至29.33％。此外，修饰后的结构脂sn-2位dha含量变化不明显(39.38％)。
[0079]
2、动物实验
[0080]
(1)实验动物
[0081]
c57bl/6小鼠(6周龄左右，雌雄各半)，平均体重(25
±
2)g，由陆军特色医学中心实验动物中心提供，实验动物合格证号：scxk(京)2019-0010。保持饲养室环境温度为(24
±
1)℃，相对湿度(50
±
5)％，照明时间为12h。sn-2长链多不饱和脂肪酸1,3c-2d-tag采用实施例中的方法制得。小鼠混合饲料由陆军特色医学中心实验动物中心提供。
[0082]
(2)小鼠饲养、取材
[0083]
将70只c57bl/6小鼠在实验室适应性喂养7天后，随机分成6组：正常组、高脂组、1,2,3c-tag组、1,3c-2d-tag低剂量组、1,3c-2d-tag中剂量组、1,3c-2d-tag高剂量组(20、50、
100g/kg
·
d)，适应性喂养5d后，按体重均等原则随机分组，每组2笼，每笼5只小鼠，按照相应饲料配方(表3)采用自由进食饮水方式饲养小鼠6周。每天称量小鼠食物摄入量、更换饲料及饮用水，每周称量小鼠体重并更换2次笼具垫料，定时清除霉变饲料和粪便，并及时对饲养环境进行消毒与清洁。
[0084]
饲养周期结束后，小鼠禁食24小时，称量并记录体重，腹腔注射3％水合三氯乙醛进行麻醉处死。摘眼球收集全血，分离血清，冻存待检；之后对小鼠进行解剖分离肝脏、肾脏，睾丸周边及肾周边脂肪，称重后置于马福尔林溶液中进行固定用于后续的病理染色分析。取材完毕后将所有小鼠尸体进行集中无害化处理。
[0085]
表3.实验小鼠饲料配方表(％)
[0086][0087]
(3)结构脂对小鼠体重的影响
[0088]
实验小鼠饲喂期间每周称量1次并记录其体重，饲喂周期结束后最终测量小鼠体重。解剖取其肾脏、肝脏、肾周脂等部位，用pbs溶液洗去浮血，用滤纸吸干后称重，计算器官指数：器官指数(％)＝器官湿重(g)/小鼠体重(g)*100。
[0089]
肥胖与高脂血症及动脉粥样硬化关系密切，而体重则是大鼠肥胖程度最直观的反映指标。c57bl/6小鼠经过6周的饲喂后，所有实验组小鼠体重均高于饲喂前(图10)，其中空白组小鼠体重增加6.1g，显著高于饲喂前(p《0.05)。高脂组小鼠体重较饲喂前增加13.7g，显著高于饲喂前和饲养后空白组(p《0.05)，表明动物造模成功。添加10％的1,2,3c-tag组小鼠体重较饲养前无明显变化，表明1,2,3c-tag结构脂能够有效预防及控制小鼠肥胖。添加低剂量、中剂量、高剂量的1,3c-2d-tag实验组小鼠体重分别较饲喂前增加11.3％(p《0.05)、8.9％(p《0.05)和1.3％(p《0.05)。除低剂量组外，中剂量和高剂量1,3c-2d-tag实验组小鼠体重均显著低于高脂模型组，这表明1,3c-2d-tag能够降低c57bl/6小鼠体重的增加。此外，在整个饲喂实验过程中，正常组小鼠精神状态无异常，活泼好动，高脂组小鼠体态稍大，精神相对萎靡，活动量少。1,3c-2d-tag实验组小鼠精神状态好，活泼好动且反应敏捷，无死亡现象，这表明1,3c-2d-tag抑制大鼠体重增长并非是通过减少食物摄入导致。
[0090]
肝脏和肾脏是小鼠进行脂代谢的重要组织器官，肝脏指数变化可以较好地判断肝脏的损伤情况，肝脏指数升高表示肝脏有充血、水肿、增生及肥大等变化，降低则表示脏器萎缩、生长受阻或退行性病变。由表4可知，空白组肝脏指数(lw/bw)均低于模型组与各实验组，其中模型组为4.86％，显著高于高剂量、中剂量和低剂量1,3c-2d-tag实验组(p《0.05)，这表明1,3c-2d-tag能够对小鼠肝脏的增生或肥大有一定抑制作用。高脂组、模型组肾脏指数均低于正常组(p《0.05)，其中模型组与低剂量组、高剂量实验组的肾脏指数基本一致(p》
0.05)，表明1,3c-2d-tag对小鼠体重的控制不是通过肾脏代谢完成的，但1,2,3c-tag组小鼠肾脏指数显著高于正常组、模型组及各实验组(p《0.05)，结合其对小鼠体重控制的影响可以推测，1,2,3c-tag主要通过肾脏的代谢来实现对小鼠体重的影响。由此看来，结构脂sn-1,3位脂肪酸对动物脂代谢的影响较大，sn-2位脂肪酸的不饱和类型同样对体重变化有影响。
[0091]
表4.不同饲料组对c57bl/6小鼠体重增加的影响
[0092]
组别肝脏湿重/体重(％)肾脏湿重/体重(％)对照组3.92
±
0.13c1.04
±
0.05b高脂组4.86
±
0.18a0.95
±
0.03c1,2,3c-tag组4.57
±
0.26
ab
1.40
±
0.05a低剂量组4.24
±
0.09
bc
0.90
±
0.06c中剂量组4.26
±
0.12
bc
1.02
±
0.04b高剂量组4.32
±
0.11b1.00
±
0.04
bc
[0093]
(4)结构脂对小鼠脂质代谢的影响
[0094]
①
将收集到的血液在4℃下以4000rmp的转速下离心15min，收集上清液后用自动血液分析仪测定各血液样品的谷丙转氨酶(alt)、谷草转氨酶(ast)和血尿素氮(bun)。
[0095]
血尿素氮(bun)是蛋白质代谢的主要终末产物，主要通过肾小球滤过而排出体外，是判断肾功能损伤的参考指标之一。如图11所示，高脂组小鼠bun浓度(16.4mmol/l)高于正常组(13.8mmol/l)，表明高脂饲料对小鼠肾功能正常发挥有影响。与高脂组相比，低剂量1,3c-2d-tag实验组bun无显著变化。中剂量1,3c-2d-tag实验组bun(15.1mmol/l)较高脂组有显著下降(p《0.05)，这表明中剂量的1,3c-2d-tag并不会造成小鼠肾毒性反应。
[0096]
肝脏为脂类、糖类以及蛋白质代谢的主要器官，谷草转氨酶(ast)及谷丙转氨酶(alt)是肝功能的代表性指标之一，能够直观反映出肝细胞的损伤程度，越高表明肝脏受损程度越大。图12～13显示高脂组ast和alt均显著高于正常组(p《0.05)，表明高脂饲料诱导的高脂血症会损伤小鼠肝脏功能并影响脂代谢。与正常组相比，低剂量1,3c-2d-tag实验组ast有显著增加，但中剂量和高剂量实验组则无显著变化(p》0.05)。与ast类似，中剂量和高剂量实验组alt正常组相比也无明显变化(p》0.05)。这些结果均表明中剂量和高剂量1,3c-2d-tag并不会造成小鼠肝脏毒性反应。
[0097]
②
甘油三脂(tg)和总胆固醇(tc)含量的测定：分别取甘油三脂、总胆固醇试剂盒，在洁净的96孔板中标注空白孔，标准孔，样本孔，用10ul的移液枪吸取蒸馏水注入96孔板的前三个孔作为空白孔，每个孔2.5ul，在空白孔后三个孔每孔注入2.5ul校准品作为标准孔，其余为样本孔，样本孔为实验组的5组样品，滴加顺序依次为空白组、低浓度组(15％)、中浓度组(30％)和高浓度组(45％)，每组5个样品，每个样品滴加3个孔做平行试验，每个孔注入样品2.5ul，样品滴加完毕后，再用500ul移液枪吸取250ul工作液注入空白孔、标准孔和样本孔的每一个孔中，充分混匀，置于37℃烘箱中孵育10分钟，设置波长为510nm，用酶标仪测定其吸光度值。
[0098]
如图14～15所示，与空白组相比，高脂组小鼠tg和tc显著高于正常组，反映出高脂饲料能够有效提高小鼠血液中tg和tc含量。与高脂组相比，低剂量1,3c-2d-tag组对小鼠tg和tc有降低作用，但效果不明显(p》0.05)。中剂量和高剂量1,3c-2d-tag组能够显著降低小
鼠tg和tc含量，这表明1,3c-2d-tag具有抑制小鼠总胆固醇和甘油三脂升高的作用。
[0099]
③
高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)和低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)含量的测定：取高密度脂蛋白胆固醇试剂盒，将洁净的96孔板分别标注为空白孔，标准孔，样本孔，用10ul的移液枪吸取蒸馏水注入96孔板的前三个孔作为空白孔，每个孔2.5ul，在空白孔后三个孔每孔注入2.5ul校准品作为标准孔，其余为样本孔，样本孔为实验组的5组样品，滴加顺序依次为空白组、低浓度组(15％)、中浓度组(30％)和高浓度组(45％)，每组5个样品，每个样品滴加3个孔做平行试验，每个孔注入样品2.5ul，样品滴加完毕后，再用250ul移液枪吸取180ul工作液r1注入空白孔、标准孔和样本孔的每一个孔中，充分混匀，放在37℃烘箱中孵育5分钟，设置波长为546nm，用酶标仪测定每个孔的吸光度值a1，取出96孔板，用250ul移液枪吸取60ul工作液r2注入空白孔、标准孔和样本孔的每一个孔中，充分混匀，放在37℃烘箱中孵育5分钟，设置波长为546nm，用酶标仪测定每个孔的吸光度值a2，再计算血清中高密度脂蛋白胆固醇的含量。
[0100]
高密度脂蛋白是由脂质和蛋白质及其所携带的调节因子组成的复杂脂蛋白，主要反映抗动脉粥样硬化的能力，是冠心病的保护因子。由图16～17可知，饲喂6周后正常组hdl-c均低于高脂组、模型组及实验组，其中高剂量组hdl-c显著高于模型组和中、低剂量组(p《0.05)，这表明高剂量1,3c-2d-tag对c57bl/6小鼠hdl-c具有升高作用，且呈现良好的量效关系。与空白组相比，1,2,3c-tag也显著提高了hdl-c含量(p《0.05)。
[0101]
与hdl-c相比，模型组和低剂量1,3c-2d-tag组小鼠ldl-c含量均较其他组显著升高(p《0.05)，高剂量1,3c-2d-tag组和1,2,3c-tag组小鼠ldl-c含量与空白组无显著性差别，中剂量1,3c-2d-tag组ldl-c最低，这表明中高剂量1,3c-2d-tag对小鼠ldl-c含量具有一定的控制作用。综合来看，1,3c-2d-tag对高脂饲料诱发的高脂小鼠动脉粥样硬化具有一定的改善作用，特别是中剂量组对大鼠血脂的调节效果较好。
[0102]
(5)结构脂对小鼠肝脏、肾脏组织的影响
[0103]
将小鼠的肝脏、肾脏、脂肪组织清洗后至于4％多聚甲醛溶液中固定。肝脏器官切取右叶纵断面，约4～5mm3；肾脏纵向沿最大剖面切取一半，乘放于装有福尔马林的2ml离心管中浸泡10min，取出后制作切片，随后进行he染色(苏木精-染色)。
[0104]
脱水：先依次使用不同浓度的乙醇溶液(70％、80％、90％)脱水各30min，再放入乙醇溶液(95％、100％)各脱水两次，每次20min，逐渐脱去组织块中的水分；蜡透：分别使用二甲苯酒精溶液(混合比1:1)和二甲苯石蜡混合溶液(混合比1:1)各透明15min，再放入55℃石蜡溶液中进行蜡透60min。包埋：将石蜡模子在酒精灯上稍加热后置于桌面上，倒入少许石蜡，将器官材料切面朝下放入蜡模中，再放上包埋盒，轻轻倒入熔蜡。切片：将已固定好的石蜡块置于切片机上，切取5～10μm厚度的组织切片，在载玻片上展开贴好切片。脱蜡：切片置于60℃水浴锅中融化石蜡，用二甲苯分别浸泡以脱除切片中石蜡30min后，用100％无水乙醇、80％无水乙醇分别浸泡5min，接着用蒸馏水洗脱5min后染色；染色：将切片置于苏木精溶液中染色5min后，用蒸馏水反复冲洗5min，经不同浓度乙醇脱水10min后，放入0.5％伊红溶液中染色3min；水透：分别用80％乙醇、95％乙醇脱水3min，用二甲苯透明5min；封片：将透明切片滴加中性树胶，盖上盖玻片封固。经he染色后的切片置于100倍倒置荧光显微镜下观察、拍照。
[0105]
图18显示，空白组的肝脏病理切片中，肝细胞个体完整，界线清晰，细胞饱满且充
实，细胞核基本未受到损伤，大小基本一致，且形状呈圆形，呈放射性均匀有序的排列在中心静脉周围。对照组小鼠肝脏细胞核损伤严重，排列紊乱，组织结构疏松，具有较大面积的空泡现象，1,3c-2d-tag结构脂和1,2,3c-tag组小鼠肝脏细胞略有肿大，排列相对均匀，组织结构致密，少见或未见空泡现象，细胞形态及结构与空白组较为相似。中链脂肪酸比长链脂肪酸溶解度更高，直接在肝脏中提供能量，而长链脂肪酸主要在肠壁胶束运输后通过淋巴系统被吸收进行代谢。基于此，sn-1,3位中链脂肪酸的代谢及吸收主要集中在肝脏器官，且中链脂肪酸能够使得能量代谢更快。小鼠肾脏切片显示，模型组小鼠肝细胞界线清晰，肾脏细胞略微扩大，细胞核略微变小，核膜增厚，染色质变深，细胞质内充满大量大小不等的脂肪滴，将细胞核挤向一边，视野内脂肪滴数量较多。1,3c-2d-tag实验组肾脏细胞有一部分受到损伤，但损伤程度相对较轻，个别细胞疑似有轻微水肿现象。
[0106]
对比空白组肝脏和肾脏切片(图19)不难发现，低剂量组肝细胞排列较为紊乱，细胞核大小不一，细胞界限较为明显，存在少量比例的空泡现象。中剂量组肝细胞排列有序，排列比较紧密，细胞间隙比较明显，中心静脉周围的细胞呈规律的顺序排列，细胞呈规律的散发状分布，肝细胞总体形态有所缓解。高剂量组肝细胞形态与空白组小鼠肝细胞形态更为接近，排列相对规整，脂肪滴大小相对较小，数量相对较少，肝细胞界线清晰，肝窦可见。与空白组相比，高剂量1,3c-2d-tag组肝细胞中脂肪滴的大小和数量无明显区别，表明肝细胞中甘油三脂的合成受到控制后减少了在细胞内的聚积。相对低剂量组而言，高剂量1,3c-2d-tag组肾细胞核膜清楚光滑、完整，核仁清晰可见，胞浆染色新鲜均匀，中央静脉及静脉窦状隙没有发现扩张和充血，未见纤维组织增生和炎症细胞浸润，更接近于空白组肾细胞形态，结果证实各剂量1,3c-2d-tag对肝脏和肾脏组织的影响有一定量效关系。
[0107]
(6)结构脂对小鼠瘦素的影响
[0108]
瘦素是由脂肪组织分泌的一种激素，其与下丘脑神经细胞上的瘦素受体结合，产生饱食反应等一系列生理效应，限制机体的能量摄入和消耗以调节体重和体脂量。图20显示高脂模型组瘦素含量为1.47ng/ml，显著高于正常组和实验组(p《0.05)，这表明肥胖在一定程度上导致了激素失衡，进而无法引起小鼠对能量摄入的做出限制性选择。尽管低剂量1,3c-2d-tag结构脂组瘦素含量低于高脂模型组，但明显高于中剂量组和高剂量组(p《0.05)，这表明1,3c-2d-tag在一定剂量条件下才具有调节激素失衡的作用。瘦素在体内通过调控机体的食欲来实现对体质量的调节及体脂的自稳。有研究表明，肥胖者体内血液循环中存在与瘦素功能拮抗的物质(甘油三脂)或者同时存在瘦素介导的神经信号传导通路异常(瘦素受体转运效率下降)，使机体的这种自稳调节系统遭受不同程度的破坏，表现为肥胖者体内瘦素水平往往很高进而产生瘦素抵抗。1,2,3c-tag组瘦素含量与正常组、1,3c-2d-tag中剂量组、1,3c-2d-tag高剂量组无显著性差异，这表明中链脂肪酸能够降低瘦素抵抗，从而对机体调节、控制体脂自稳系统具有一定的积极作用。由此不难发现，中剂量和高剂量1,3c-2d-tag结构脂能够显著降低膳食诱导的大鼠体内的瘦素质量浓度，有效缓解由肥胖引起的瘦素抵抗。
[0109]
甘油三脂不同位置的脂肪酸差异是导致脂肪酸能够高效利用的重要原因。在此过程中，sn-2长链多不饱和脂肪酸mlm型结构脂sn-1,3位的脂肪酸在消化道内会优先被胰脂肪酶水解产生游离脂肪酸及可被高效吸收的2-mag。对于1,3c-2d-tag结构脂而言，sn-1,3位中链脂肪酸油脂肪酸体积小，溶解度高，由于其亲水性较高不容易重新转脂化为tag，且
主要通过门静脉(非淋巴系统)运输至肝脏，更容易被消化吸收用于在体内快速供应能量(不与钙或镁离子形成皂化复合物)，中碳链脂肪酸无法储存在脂肪组织中进而降低了小鼠患高血脂症的几率与风险。水解后的2d-mag长链脂肪酸则在甘油的保护下避免氧化，在小肠被粘膜细胞吸收并通过肠壁进行较好的吸收。因此将长链不饱和脂肪酸嫁接在tag的sn-2位上，不仅可以有效利用中链脂肪酸供能及时的优势，同时又能克服长链多不饱和脂肪酸吸收困难的状况。
[0110]
虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。

技术特征：
1.sn-2长链多不饱和脂肪酸结构脂在制备降低体重和体脂率的食品中的应用；所述sn-2长链多不饱和脂肪酸结构脂为甘油碳链的sn-2位连接长碳链脂肪酸、sn-1,3位连接中碳链脂肪酸后所形成的脂，其中，长碳链脂肪酸的碳原子数为15～25，中碳链脂肪酸的碳原子数为6～10。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述长碳链脂肪酸的碳原子数为22，所述中碳链脂肪酸的碳原子数为8。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述sn-2长链多不饱和脂肪酸结构脂的结构式如式i所示：其中，r为4.sn-2长链多不饱和脂肪酸结构脂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备sn-2长链单甘脂2d-mag将藻油和sn-1,3特异性水解酶按8～10:2～5的质量比共溶于无水乙醇中，于30～55℃下搅拌反应4～16h；然后将去除sn-1,3特异性水解酶后的反应物加入到由正己烷和koh醇溶液按3:1的体积比混合而成的混合液中，剧烈振荡后静置，收集乙醇相并蒸发去除有机溶剂，即得2d-mag；(2)制备sn-2长链多不饱和脂肪酸1,3c-2d-tag将2d-mag、辛酸、脂肪酶和4a分子筛按80～120:140～160:20～30:1～3的质量比共溶于有机溶剂中，于35～45℃下搅拌反应4～6h，即得1,3c-2d-tag。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，2d-mag在使用前经过了纯化，纯化包括以下步骤：将2d-mag按1g:15ml的料液比溶于正己烷中，然后加入85％的乙醇水溶液，静置分层；取下层萃取层并蒸发去除有机相，然后将所得物料溶于由乙醇和正己烷按9:1的体积比混合而成的混合液中，以3000～4000rpm的速度离心4～6min，取上层2d-mag的己烷相，并蒸发去除有机相，即得。6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述有机溶剂为正己烷。7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述sn-1,3特异性水解酶为lipozyme rm im或novozym 435；所述脂肪酶为lipozyme rm im、lipozyme tl im或novozym 435。8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中搅拌反应的搅拌速率为200rpm，振荡时间为2min，静置时间为5mim。9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，还包括1,3c-2d-tag的纯化步骤，纯化方法包括以下步骤：s1：将硅胶和氧化铝等质量混合，再将混合物按2g:5ml的料液比分散于正己烷中，然后将所得浆料填装进300
×
30mm的色谱柱中，得到分离纯化柱；
s2：将反应所得1,3c-2d-tag装入分离纯化柱，用洗脱液洗脱，利用tlc和hplc监测从分离纯化柱流出的洗脱液，收集含有的1,3c-2d-tag结构脂的洗脱液，再蒸发去除有机相，即得。10.权利要求4～9任一项所述的制备方法制得的sn-2长链多不饱和脂肪酸结构脂。

技术总结
本发明公开了Sn-2长链多不饱和脂肪酸结构脂及其制备方法和应用，属于功能性食品技术领域。本发明中的采用该结构的Sn-2长链多不饱和脂肪酸结构脂为甘油碳链的Sn-2位连接长碳链脂肪酸、Sn-1,3位连接中碳链脂肪酸后所形成的脂，其中，长碳链脂肪酸的碳原子数为15～25，中碳链脂肪酸的碳原子数为6～10，该结构脂主要用于制备降低体重和体脂率的药物，能有效缓解由肥胖引起的瘦素抵抗。本发明采用两步酶法制备Sn-2长链多不饱和脂肪酸结构脂，可大大减少酰基转移的发生，在增强反应特异性的同时还提高了工艺生产率，有利于特殊结构脂的生成。有利于特殊结构脂的生成。有利于特殊结构脂的生成。


技术研发人员：王强 向小凤 谢跃杰 王锴 王操 王怡涵
受保护的技术使用者：重庆第二师范学院
技术研发日：2023.04.20
技术公布日：2023/7/25