植物RNA甲基化和去甲基化编辑方法及其应用

植物rna甲基化和去甲基化编辑方法及其应用
技术领域
1.本发明涉及植物基因编辑技术领域，具体涉及植物rna甲基化和去甲基化编辑方法及其应用。


背景技术：

2.n6-腺苷酸甲基化(m6a)是动植物mrna上丰度最高的一种化学修饰类型，越来越多的研究发现m6a修饰广泛地参与多种表观遗传调控过程，包括影响mrna剪接、翻译、出核、胞质定位以及mrna的稳定性。在植物中，m6a修饰的添加和去除是一个动态的过程，m6a修饰的添加主要由mta、mtb所形成的甲基转移酶复合体所介导，而m6a的去甲基化由alkbh9b和alkbh10b所催化。m6a修饰在植物mrna加工、生长发育和抗逆反应等过程中发挥重要作用。然而，目前为止，植物中m6a相关研究还十分有限，且现有的研究方法只能通过突变体结合组学技术来研究m6a宏观上的调控功能，在植物中尚未有技术能实现特异性操纵某一功能基因上的m6a修饰水平，以研究微观上m6a对特异基因的调控功能。


技术实现要素：

3.有鉴于此，本发明提供了植物rna甲基化和去甲基化编辑方法及其应用。
4.本发明提供了植物rna甲基化和去甲基化编辑方法及其应用。本发明基于crispr/lshcas13a系统特异性识别并结合rna的功能，将植物rna甲基转移酶复合体核心功能域mta-mtb与无切割活性的dcas13a(dead cas13a)融合，获得dcas13a-mta-mtb融合的rna甲基化编辑工具。将rna去甲基化酶alkbh5与dcas13a融合，获得dcas13a-alkbh5融合的rna去甲基化编辑工具，该工具能够实现对特定基因进行m6a甲基化和去甲基化编辑。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
6.本发明提供了dcas13a，其突变位点包括：
7.(ⅰ)、第1789、1790位的碱基ag突变为gc；和/或
8.(ⅱ)、第1804、1805位的碱基ca突变为gc；和/或
9.(ⅲ)、第3832、3833位的碱基cg突变为gc；和/或
10.(ⅳ)、第3847、3848位的碱基ca突变为gc。
11.在本发明的一些具体实施方案中，所述dcas13a，其具有
12.(ⅰ)、如seq id no.2所示的核苷酸序列；或
13.(ⅱ)、与(ⅰ)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(ⅰ)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
14.(ⅲ)、与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
15.(ⅳ)、与(ⅰ)～(ⅲ)任一项所述核苷酸序列具有至少80％序列同源性的核苷酸序列。
16.本发明还提供了所述dcas13a在植物表达和/或基因编辑中的应用；
17.所述基因编辑包括甲基化和/或去甲基化。
18.本发明还提供了表达元件，包括如下任意项：
19.(ⅰ)、所述dcas13a；和/或
20.(ⅱ)、dcas13a、δmta
446-667
和δmtb
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；和/或
21.(ⅲ)、dcas13a和alkbh5；
22.所述δmta
446-667
具有：
23.(ⅰ)、如seq id no.3所示的核苷酸序列；或
24.(ⅱ)、与(ⅰ)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(ⅰ)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
25.(ⅲ)、与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
26.(ⅳ)、与(ⅰ)～(ⅲ)任一项所述核苷酸序列具有至少80％序列同源性的核苷酸序列；
27.所述δmtb
562-876
具有：
28.(ⅰ)、如seq id no.4所示的核苷酸序列；或
29.(ⅱ)、与(ⅰ)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(ⅰ)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
30.(ⅲ)、与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
31.(ⅳ)、与(ⅰ)～(ⅲ)任一项所述核苷酸序列具有至少80％序列同源性的核苷酸序列；
32.所述alkbh5具有：
33.(ⅰ)、如seq id no.9所示的核苷酸序列；或
34.(ⅱ)、与(ⅰ)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(ⅰ)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
35.(ⅲ)、与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
36.(ⅳ)、与(ⅰ)～(ⅲ)任一项所述核苷酸序列具有至少80％序列同源性的核苷酸序列。
37.在本发明的一些具体实施方案中，所述表达元件还包括nes-(sggs)
2-xten-(sggs)2linker和/或(ggs)
10
linker。
38.在本发明的一些具体实施方案中，所述表达元件包括如下任意项：
39.(ⅰ)、依次包括dcas13a、nes-(sggs)
2-xten-(sggs)2、δmta
446-667
、(ggs)
10
和δmtb
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；和/或
40.(ⅱ)、依次包括dcas13a、nes-(sggs)
2-xten-(sggs)2和alkbh5；
41.所述nes-(sggs)
2-xten-(sggs)2具有：
42.(ⅰ)、如seq id no.5所示的核苷酸序列；或
43.(ⅱ)、与(ⅰ)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(ⅰ)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
44.(ⅲ)、与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
45.(ⅳ)、与(ⅰ)～(ⅲ)任一项所述核苷酸序列具有至少80％序列同源性的核苷酸序列；
46.所述(ggs)
10
具有：
47.(ⅰ)、如seq id no.6所示的核苷酸序列；或
48.(ⅱ)、与(ⅰ)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(ⅰ)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
49.(ⅲ)、与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
50.(ⅳ)、与(ⅰ)～(ⅲ)任一项所述核苷酸序列具有至少80％序列同源性的核苷酸序列。
51.在本发明的一些具体实施方案中，所述dcas13a、nes-(sggs)
2-xten-(sggs)2、δmta
446-667
、(ggs)
10
和δmtb
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依次连接为dcm；
52.所述dcas13a、nes-(sggs)
2-xten-(sggs)2和alkbh5依次连接为dca；
53.所述dcm具有：
54.(ⅰ)、如seq id no.7所示的核苷酸序列；或
55.(ⅱ)、与(ⅰ)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(ⅰ)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
56.(ⅲ)、与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
57.(ⅳ)、与(ⅰ)～(ⅲ)任一项所述核苷酸序列具有至少80％序列同源性的核苷酸序列；
58.所述dca具有：
59.(ⅰ)、如seq id no.10所示的核苷酸序列；或
60.(ⅱ)、与(ⅰ)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(ⅰ)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
61.(ⅲ)、与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
62.(ⅳ)、与(ⅰ)～(ⅲ)任一项所述核苷酸序列具有至少80％序列同源性的核苷酸序列；
63.所述dcm和/或dca末端还包括ha标签。
64.在上述研究的基础上，本发明还提供了表达载体，包括所述表达元件。
65.在本发明的一些具体实施方案中，所述dcm和/或dca与p1300载体连接；
66.所述p1300载体包括：atu6启动子驱动的crispr引导序列、卡那霉素和潮霉素抗性基因。
67.本发明还提供了宿主，包括如下任意项：
68.(ⅰ)、转染所述表达元件；和/或
69.(ⅱ)、转染所述表达载体。
70.本发明还提供了如下任意项在植物rna甲基化和/或去甲基化编辑中的应用：
71.(ⅰ)、所述表达元件；和/或
72.(ⅱ)、所述表达载体；和/或
73.(ⅲ)、所述宿主。
74.在本发明的一些具体实施方案中，所述表达元件依次包括dcas13a、nes-(sggs)
2-xten-(sggs)2、δmta
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、(ggs)
10
和δmtb
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时，调节植物rna甲基化；
75.所述表达元件依次包括dcas13a、nes-(sggs)
2-xten-(sggs)2和alkbh5时，调节植物rna去甲基化。
76.本发明还提供了植物rna甲基化和/或去甲基化编辑方法，基于如下任意项编辑：
77.(ⅰ)、所述表达元件；和/或
78.(ⅱ)、所述表达载体；和/或
79.(ⅲ)、所述宿主。
80.在本发明的一些具体实施方案中，所述植物rna甲基化和/或去甲基化编辑方法，包括如下步骤：
81.步骤1：取所述宿主培养活化，得到侵染液；
82.步骤2：取所述侵染液侵染植物，实现植物rna甲基化和/或去甲基化编辑。
83.本发明提供了烟草rna甲基化和去甲基化编辑方法，包括如下步骤：
84.步骤1：合成报告基因编辑靶点grna t1和t2引物序列，通过退火形成核苷酸二聚体结构，
85.步骤2：使用bsai内切酶切开p1300-dcm/dcdm/dca/dcda载体质粒环，利用t4 dna连接酶分别将靶点grna t1序列、t2序列分别退火形成核苷酸二聚体与p1300-dcm、p1300-dcdm和p1300-dca、p1300-dcda质粒载体片段进行连接反应，从而构建靶向编辑报告基因的rna甲基化质粒载体p1300-dcm-grna t1、p1300-dcdm-grna t1、p1300-dcm-grna t2、p1300-dcdm-grna t2和去甲基化质粒载体p1300-dca-grna t1、p1300-dcda-grna t1、p1300-dca-grna t2、p1300-dcda-grna t2，以及无插入grna t1序列和t2序列靶点的p1300-dcm-nontarget和p1300-dca-nontarget，作为阴性对照组；
86.步骤3：将构建好的报告基因载体及p1300-dcm-grna t1、p1300-dcdm-grna t1、p1300-dcm-grna t2、p1300-dcdm-grna t2和去甲基化质粒载体p1300-dca-grna t1、p1300-dcda-grna t1、p1300-dca-grna t2、p1300-dcda-grna t2编辑载体，以及阴性对照p1300-dcm-nontarget和p1300-dca-nontarget分别转化农杆菌gv3101，抗性筛选、培养、活化；
87.步骤4：将活化过的农杆菌菌液侵染烟草叶片。
88.在本发明的一些具体实施方案中，所述报告基因具有：
89.(ⅰ)、如seq id no.12所示的核苷酸序列；或
90.(ⅱ)、与(ⅰ)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(ⅰ)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
91.(ⅲ)、与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
92.(ⅳ)、与(ⅰ)～(ⅲ)任一项所述核苷酸序列具有至少80％序列同源性的核苷酸序
列。
93.在本发明的一些具体实施方案中，所述基因编辑靶点grna引物组包括：grna t1引物组、grna t2引物组或grna shr引物组中的一种或多种；
94.所述grna t1的引物组具有：
95.(ⅰ)、上游引物具有如seq id no.13所示的核苷酸序列；和
96.(ⅱ)、下游引物具有如seq id no.14所示的核苷酸序列；或
97.(ⅲ)、与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
98.(ⅳ)、与(ⅰ)～(ⅲ)任一项所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(ⅰ)～(ⅲ)任一项所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
99.(
ⅴ
)、与(ⅰ)～(ⅳ)任一项所述核苷酸序列具有至少80％序列同源性的核苷酸序列；
100.所述grna t2的引物组具有：
101.(ⅰ)、上游引物具有如seq id no.15所示的核苷酸序列；和
102.(ⅱ)、下游引物具有如seq id no.16所示的核苷酸序列；或
103.(ⅲ)、与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
104.(ⅳ)、与(ⅰ)～(ⅲ)任一项所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(ⅰ)～(ⅲ)任一项所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
105.(
ⅴ
)、与(ⅰ)～(ⅳ)任一项所述核苷酸序列具有至少80％序列同源性的核苷酸序列。
106.本发明提供了拟南芥rna甲基化和去甲基化编辑方法，包括如下步骤：
107.步骤1：合成shr基因转录本上编辑位点核苷酸引物序列，通过退火形成核苷酸二聚体结构；
108.步骤2：使用bsai内切酶切开p1300-dcm、p1300-dcdm和p1300-dca、p1300-dcda载体质粒环，利用t4 dna连接酶分别将靶点grna shr序列退火形成核苷酸二聚体与p1300-dcm、p1300-dcdm和p1300-dca、p1300-dcda质粒载体片段进行连接反应，构建靶向编辑植物内源基因rna甲基化质粒载体p1300-dcm-shr、p1300-dcdm-shr和p1300-dca-shr、p1300-dcda-shr，以及无编辑靶点的p1300-dcm-nontarget和p1300-dca-nontarget，作为阴性对照组；
109.步骤3：将质粒载体p1300-dcm-shr、p1300-dcdm-shr和p1300-dca-shr、p1300-dcda-shr，以及无编辑靶点的p1300-dcm-nontarget和p1300-dca-nontarget转化农杆菌gv3101，抗性筛选、培养、活化；
110.步骤4：将活农杆菌菌液侵染拟南芥，筛选，获得转基因植株。
111.在本发明的一些具体实施方案中，所述grna shr的引物组具有：
112.(ⅰ)、上游引物具有如seq id no.19所示的核苷酸序列；和
113.(ⅱ)、下游引物具有如seq id no.20所示的核苷酸序列；或
114.(ⅲ)、与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
115.(ⅳ)、与(ⅰ)～(ⅲ)任一项所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(ⅰ)～(ⅲ)任一项所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
116.(
ⅴ
)、与(ⅰ)～(ⅳ)任一项所述核苷酸序列具有至少80％序列同源性的核苷酸序列；
117.所述p1300-dcdm中的dcdm具有：
118.(ⅰ)、如seq id no.8所示的核苷酸序列；或
119.(ⅱ)、与(ⅰ)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(ⅰ)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
120.(ⅲ)、与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
121.(ⅳ)、与(ⅰ)～(ⅲ)任一项所述核苷酸序列具有至少80％序列同源性的核苷酸序列；
122.所述p1300-dcda中的dcda具有：
123.(ⅰ)、如seq id no.11所示的核苷酸序列；或
124.(ⅱ)、与(ⅰ)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(ⅰ)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
125.(ⅲ)、与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
126.(ⅳ)、与(ⅰ)～(ⅲ)任一项所述核苷酸序列具有至少80％序列同源性的核苷酸序列。
127.本发明提供了植物rna甲基化和去甲基化编辑方法及其应用。本发明提供了植物rnan6-methyladenonsine(m6a)甲基化和去甲基化编辑方法，从而为植物特定基因转录本rna上添加和去除m6a甲基化修饰的创建方法。所述的应用是：基于crispr/lshcas13a系统特异性识别并结合rna的功能，将拟南芥植物rna甲基转移酶复合体核心功能域mta-mtb与无切割活性的dcas13a(dead cas13a)融合，获得dcas13a-mta-mtb融合的rna甲基化编辑构建。将rna去甲基化酶alkbh5与dcas13a融合，获得dcas13a-alkbh5融合的rna去甲基化编辑构建，该应用能够实现对特定基因进行m6a甲基化和去甲基化编辑，有望应用于相关m6a修饰基因的功能研究。此外，通过dcas13a-mta-mtb的rna甲基化编辑工具操纵植物关键发育基因上的m6a修饰水平可影响植株表型，改良植物相关性状，这在在将来的作物育种中也具有重要应用潜力。
附图说明
128.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
129.图1示实施例1中植物rna甲基化和去甲基化编辑工具模式图；其中，a示甲基化编辑工具dcm工作模式图；b示dcm融合蛋白各组分排列顺序；其中dcdm为dcm甲基转移酶活点
突变，作为阴性对照；c示去甲基化编辑工具dca工作模式图；d示dca融合蛋白各组分排列顺序，dcda为dca去甲基化酶活点突变，作为阴性对照；e示使用原始原核lshcas13a序列构建载体，在烟草中检测不到lshcas13a和融合蛋白表达；注：#上标代表使用原始原核序列的cas13a；f示烟草叶片中使用植物密码子优化和点突变的lshcas13a构建载体，可以检测到dcas13a与dcm、dcdm融合蛋白的表达；g示烟草叶片中使用植物密码子优化和点突变的lshcas13a构建载体，可以检测到dcas13a与dca、dcda融合蛋白的表达；注：f-g使用ha抗体检测，其中control为未注射农杆菌的烟草叶片样品；
130.图2示实施例2中植物中dcm和dca甲基化和去甲基化编辑功能检测；其中，a示报告基因结构，黑色箭头指示编辑靶点位置；b示烟草叶肉细胞中外源报告基因甲基化编辑功能检测，dcm-nontarget和dcdm-grna t1/t2为阴性对照；c示烟草叶肉细胞中外源报告基因去甲基化编辑功能检测，dca-nontarget和dcda-grna t1/t2为阴性对照；d示拟南芥内源shr基因结构及m6a甲基化修饰区间；黑色箭头指示编辑靶点位置；e示拟南芥内源shr基因甲基化编辑功能检测，dcm-non(dcm-nontarget)和dcdm-shr为阴性对照；f示拟南芥内源shr基因去甲基化编辑功能检测，dca-non(dca-nontarget)和dcda-shr为阴性对照；统计方法使用student t检验，*代表显著差异(p值《0.05)，**代表极显著差异(p值《0.01)，***代表极极显著差异(p值《0.001)。
具体实施方式
131.本发明公开了植物rna甲基化和去甲基化编辑方法及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
132.现有技术只能够应用于动物细胞，载体质粒无法应用于植物转化。cas13序列未经植物密码子优化，在植物体内表达效率低。crispr引导序列(grna)需要病毒转染以转移到动物细胞，也无法应用植物细胞转化。
133.本发明提供了植物rna n6-methyladenonsine(m6a)甲基化和去甲基化编辑方法，从而为植物特定基因转录本rna上添加和去除m6a甲基化修饰的创建方法。所述的应用是：基于crispr/lshcas13a系统特异性识别并结合rna的功能，将拟南芥植物rna甲基转移酶复合体核心功能域mta-mtb与无切割活性的dcas13a(dead cas13a)融合，获得dcas13a-mta-mtb融合的rna甲基化编辑构建。将rna去甲基化酶alkbh5与dcas13a融合，获得dcas13a-alkbh5融合的rna去甲基化编辑构建(如图1)，该应用能够实现对特定基因进行m6a甲基化和去甲基化编辑，有望应用于相关m6a修饰基因的功能研究。此外，通过dcas13a-mta-mtb的rna甲基化编辑工具操纵植物关键发育基因上的m6a修饰水平可影响植株表型，改良植物相关性状，这在在将来的作物育种中也具有重要应用潜力。
134.本发明所用到的序列如下所示：
135.seq id no.1：
136.》原始lshcas13a核苷酸序列：
137.atgggaaatcttttcggacataaaagatggtacgaagtgagagataagaaggatttcaagattaagaga
aaggttaaggttaagaggaattacgatggaaacaagtacattcttaatatcaatgagaataacaataaggaaaaaattgataataataagttcattaggaaatacatcaactataaaaaaaacgataatatccttaaggaatttactagaaagttccatgcaggtaacattctttttaaattaaaaggtaaagagggaattatcaggatcgaaaataacgatgattttcttgagactgaggaggtggtgttgtacatcgaggcatatggtaagtcagaaaaattaaaggcattgggaatcacaaagaaaaagatcatcgacgaggctatcaggcaaggaattactaaggatgataagaaaatcgagattaaaaggcaggagaacgaggaagagatcgaaatcgatattagagacgagtatacaaacaagacacttaatgattgttctatcatccttagaatcattgaaaatgatgaacttgaaactaagaagtcaatctatgagatctttaagaacattaacatgtcattgtataagattatcgagaagatcatcgagaacgagactgagaaggtgttcgagaatagatattacgaagagcatcttagggagaaattgttgaaagacgataaaattgatgttattttgacaaatttcatggaaattagagagaaaattaagtctaacttggaaattcttggtttcgttaagttctacttgaatgttggaggtgacaaaaagaaatctaagaataagaaaatgttggttgaaaagattcttaacatcaatgttgaccttacagttgaagacattgctgatttcgttattaaggaattggaattttggaacattactaagagaatcgaaaaagttaaaaaagttaaca
138.atgaatttttggaaaaaagaaggaataggacttacatcaagtcatatgttcttttgg
139.ataagcatgagaaatttaagatcgaaagagagaacaagaaagataaaattgtgaa
140.gttttttgttgagaacattaagaacaactctatcaaagagaaaattgagaagattct
141.tgctgagtttaaaatcgacgagttgatcaaaaagttggaaaaagagttgaagaagg
142.gaaactgtgatactgaaattttcggaattttcaaaaaacattacaaagttaacttcg
143.attctaagaaattctctaagaagtctgatgaggagaaggagctttacaaaatcatct
144.atagataccttaagggaaggattgaaaagatccttgttaatgagcagaaggttaga
145.ttgaagaagatggagaagattgaaatcgagaaaatccttaatgagtcaatcctttc
146.agagaagatccttaagagggttaagcagtacactcttgagcatattatgtatcttgg
147.taaattgagacataatgatatcgatatgactactgtgaacactgatgatttctcaag
148.attgcatgcaaaggaggagcttgacttggagttgattacttttttcgcttctactaat
149.atggagttgaacaagattttttcccgtgaaaacatcaacaacgacgagaacatcga
150.cttcttcggtggagacagggagaaaaactacgttttggataagaagattttgaactc
151.taagattaagattatcagagatttggatttcatcgataacaagaacaatatcactaa
152.taattttattagaaagttcactaaaattggaactaatgaacgaaaccgtattttaca
153.cgctatttctaaggagagagatcttcagggaactcaagacgattataataaggtga
154.ttaacattatccaaaatttgaagatctctgatgaagaggtttctaaagctcttaatt
155.tggatgtggtgttcaaggataagaagaatatcattactaaaatcaacgatatcaaa
156.atttcagaggagaataacaacgatattaaatacttgccttctttctctaaggttttg
157.ccagaaattcttaacctttatagaaataaccctaagaatgagccattcgatacaatt
158.gagacagaaaagattgttcttaacgcacttatttatgttaacaaggagttgtataag
159.aaattaattcttgaggatgaccttgaagagaatgaatcaaaaaatatcttccttcag
160.gagttgaaaaagactcttggtaacattgatgaaattgatgagaacatcattgagaa
161.ttattacaaaaatgctcagatttcagcttctaagggtaataacaaggctattaaaaa
162.atatcaaaagaaggttatcgaatgctacatcggttatcttagaaaaaattatgagg
163.aacttttcgacttttctgacttcaaaatgaacatccaagaaatcaagaagcaaatca
164.aggatattaacgacaataagacttacgagagaattactgttaagacatctgacaag
165.actatcgttatcaatgatgatttcgaatacatcatttctattttcgcacttcttaatt
166.ctaatgctgttatcaataaaatcaggaataggttcttcgctacttcagtgtggctta
167.acacatctgagtaccagaatatcatcgatatccttgatgagatcatgcagcttaata
168.ctttgagaaatgaatgtattacagagaactggaacttgaatcttgaggagttcattc
169.aaaagatgaaggagatcgagaaggattttgatgattttaaaattcagactaagaag
170.gaaatttttaacaactattacgaggatatcaaaaacaatattcttacagagtttaag
171.gatgatattaacggttgtgatgttcttgaaaagaaattagagaagattgttattttt
172.gatgacgaaactaaatttgaaattgacaaaaagtctaatattcttcaagacgagca
173.gagaaagttgtctaatatcaataagaaggacttgaagaagaaagtggatcagtata
174.ttaaagataaggatcaagaaatcaaatctaaaatcctttgtaggatcatcttcaact
175.ctgactttttgaagaagtataaaaaggagatcgataatttgattgaagatatggaa
176.tctgaaaatgagaacaagtttcaggaaatctactatcctaaagagagaaaaaacga
177.attgtacatctataagaaaaacctttttttgaatattggtaatccaaattttgataa
178.aatctacggacttatttctaacgacattaagatggcagatgctaagttcctttttaa
179.tatcgatggaaagaatatcagaaaaaataaaatctctgaaatcgacgctattctta
180.agaacttgaacgacaaattgaacggatattctaaggagtataaggaaaagtacatt
181.aaaaaattgaaggaaaatgatgatttttttgcaaagaacatccaaaacaaaaatta
182.caagtcttttgagaaggattataacagagtgtctgaatataaaaaaatcagggatc
183.ttgtggaatttaactatttgaataaaattgaatcttaccttattgatatcaactgga
184.aattagctatccagatggcaagattcgagagggacatgcactacatcgtgaacgga
185.cttagggaacttggtattatcaaattgtctggatacaacacaggtatctcccgtgca
186.taccctaagaggaatggatctgatggattctacacaacaactgcttactataagttc
187.tttgatgaggaatcatataaaaagttcgagaagatttgctacggtttcggtatcgat
188.ctttctgaaaattctgagatcaacaagcctgagaacgaatctattagaaactacatc
189.tctcatttttatatcgtgagaaatccattcgctgattattctatcgctgagcaaatcg
190.atagagtttcaaatcttttgtcttactctactaggtataacaactctacatacgcttc
191.tgttttcgaagtttttaagaaggacgttaaccttgattatgatgaacttaagaaaaa
192.gttcaagttgattggaaataacgatatcttggagagattgatgaaaccaaagaaag
193.tttctgttttggaacttgagtcttataactctgattacatcaaaaaccttattattga
194.acttttgacaaagattgagaatactaatgatactctt
195.seq id no.2：
196.》植物密码子优化及点突变dcas13a序列
197.[0198][0199]
[0200]
注：加粗且有下划线的核酸碱基为第1789、1790、1804、1805、3832、3833、3847和3848位核酸碱基突变位点，分别为ag-》gc，ca-》gc，cg-》gc，ca-》gc
[0201]
seq id no.3：》δmta
446-667
[0202]
cgtgctgattactgttctgaagctgaacttggtgaggcacaatggattaactgtgacatccgttcttttcgaatggacattttgggaacctttggagttgttatggcggatccaccatgggacattcacatggaacttccatatggaacaatggctgatgacgaaatgcgaactcttaatgttccctcgttacagactgacggtttgattttcctctgggtcactggtcgtgctatggaactaggccgtgaatgtttggagctttggggatacaagcgagtggaagagatcatatgggtaaagacaaatcaacttcaacgtattattcgaacaggaagaacaggtcactggctcaaccatagcaaagagcattgtctggttggaatcaaaggaaatccagaagtgaacagaaacatcgacacagatgtgattgtcgcagaggttagagaaacaagccggaagccagacgagatgtatgcaatgttagagaggatcatgccaagagcaagaaagctcgagttattcgcccgtatgcacaatgctcatgccggatggctatcacttgggaaccagcttaacggtgtccgattaataaacgaaggtcttcgagctcggtttaaagcatcataccctgaaatagatgtccagccaccatcaccaccaaga
[0203]
seq id no.4：》δmtb
562-876
[0204]
ccttctaggggagagcaaaatgactattcccagaactttgtggatactggaatgcggccccagaatttcattcgggagctggagcttaccaatgtggaagactaccccaagcttagagagctcatacagaagaaggatgagattgtatctaattctgcttctgcaccaatgtatctgaaaggcgacttgcatgaagttgagttatctcccgagttatttggaacaaagtttgatgttattcttgttgacccaccatgggaggaatatgtccatagagctcctggtgtttctgatagtatggagtattggacatttgaggacattatcaatctcaagattgaggcaatagctgacactccatccttcctcttcctctgggttggtgatggtgttgggcttgagcaagggcgccaatgcctgaaaaagtggggtttcagaaggtgtgaagacatttgctgggtgaaaaccaacaaaagtaatgcagcaccaacattgcgacatgattctcgtactgtgtttcagcgttccaaggagcactgcttgatggggataaagggtactgttcgacgtagcactgatggccatataatccatgctaacatcgacactgacgtaattattgctgaagagcctccttatggttcgactcagaagcctgaagatatgtataggataatagagcattttgcacttggtcgccggaggcttgagcttttcggtgaagaccacaatattcgagctggctggcttactgttggaaaaggcctttcgtcctcaaactttgagccacaggcttatgtgaggaacttcgcagacaaggagggtaaagtgtggctaggaggaggaggaagaaatccacctccagacgcaccgcatcttgttgtgactactcccgatatagaatcgctgcggcccaaatcaccaatgaagaatcagcaacaacaa
[0205]
seq id no.5：》nes-(sggs)
2-xten-(sggs)2[0206]
tgatactcttggatccggtaccctgcctcctctggagcgactgaccctgtccggaggatcctccggaggatcctccggatccgaaaccccaggaacctccgaatccgctaccccagaatcctccggaggatcctccggaggatcccgtgctgattactgttctga
[0207]
seq id no.6：》(ggs)
10
[0208]
ctcggtttaaagcatcataccctgaaatagatgtccagccaccatcaccaccaagaggaggatccggaggatccggaggatccggaggatccggaggatccggaggatccggaggatccggaggatccggaggatccggatccccttctaggggagagcaaaatgac
[0209]
seq id no.7：》dcm核苷酸序列
[0210]
atgggaaacctcttcggacacaagagatggtacgaggtgagggacaagaagg
[0211]
acttcaagatcaagcgtaaggtgaaggtgaagaggaactacgacgggaacaagta
[0212]
catcctcaacatcaacgagaacaacaacaaagagaagatcgataacaacaagttca
[0213]
tccgtaagtacatcaactacaagaagaacgacaacatcctgaaagagttcacgagg
[0214]
aagttccacgccggaaacatcctcttcaagctcaagggaaaagaggggatcatcag
[0215]
gattgagaacaacgacgacttcctcgagactgaagaggtggtgctttacatcgagg
[0216]
cttacgggaagtctgagaagcttaaggctctcgggatcaccaagaagaagatcatc
[0217]
gacgaggctatcaggcagggaatcaccaaggatgacaagaagattgagatcaaga
[0218]
ggcaagagaacgaggaagagatcgagatcgatatcagggacgagtacaccaacaa
[0219]
gaccctcaacgactgctctatcatcctccgtatcatcgagaacgacgagcttgagac
[0220]
taagaagtccatctacgagatcttcaagaacatcaacatgagcctctacaagattat
[0221]
cgagaaaattatcgaaaacgagactgagaaggtgttcgagaacaggtactacgag
[0222]
gaacacctccgtgagaagctcctcaaggacgataagatcgatgtgatcctcaccaa
[0223]
cttcatggaaattcgtgagaagatcaagtccaacctcgagatcctcggcttcgtgaa
[0224]
gttctaccttaacgttggcggggataagaagaagtcgaagaacaagaaaatgctgg
[0225]
tcgagaagatcttgaacattaacgtggacctcaccgtcgaggatatcgctgacttcg
[0226]
tgatcaaagagcttgagttctggaacatcaccaagcgtatcgagaaggtgaaaaag
[0227]
gtgaacaacgagttccttgagaagaggcgtaacaggacctatatcaagagctacgt
[0228]
gctcctcgacaagcacgagaagtttaagatcgagcgtgagaacaaaaaggacaag
[0229]
atcgtcaagttcttcgtggaaaacatcaagaacaactccatcaaagagaaaattga
[0230]
gaagattctcgccgagttcaagattgacgagctgatcaagaagctcgagaaagagc
[0231]
tgaagaagggcaactgcgacactgagatcttcgggattttcaagaagcactacaag
[0232]
gtcaacttcgacagcaagaagttctccaagaagtccgacgaagagaaagagttgta
[0233]
caagatcatctaccgttacctcaaggggcgtatcgaaaagatccttgtgaacgagc
[0234]
agaaggtgaggctcaagaagatggaaaagattgaaatagagaaaatcctcaacga
[0235]
gagcatcctctcggagaagatccttaagagggtgaagcagtacaccctcgagcaca
[0236]
tcatgtacctcggaaagctcaggcacaacgacatcgatatgactaccgtgaacacg
[0237]
gacgacttctctaggctccatgccaaagaagagttggacctcgagcttatcaccttc
[0238]
ttcgccagcactaacatggaactcaacaagatattcagccgagagaatatcaacaa
[0239]
cgatgagaacatcgactttttcggcggcgaccgagagaagaactacgttctcgaca
[0240]
aaaagattctcaactctaagatcaagatcattagggacctcgacttcatcgacaaca
[0241]
agaacaatatcaccaacaacttcatcagaaagttcaccaagatcgggaccaacgag
[0242]
gcgaacagaatcctcgccgctatcagcaaagagagggatctccagggaacccagga
[0243]
cgactataacaaggtgatcaacatcatccagaacctgaagatcagtgacgaagagg
[0244]
tgagcaaggctctcaacctcgatgtggtgttcaaggataagaaaaacatcatcacg
[0245]
aagattaacgacatcaagatctccgaggaaaacaacaacgatatcaagtacctgcc
[0246]
gagcttcagcaaggttctccctgagattcttaacctctaccgtaacaacccgaagaa
[0247]
cgagcctttcgacactatcgagacagaaaagatcgtgctcaacgccctcatctacgt
[0248]
gaacaaagaactctacaaaaagctcatcttggaggacgaccttgaggaaaacgagt
[0249]
ccaagaacatattcctgcaagagcttaagaaaaccctcgggaacatcgatgagatc
[0250]
gacgagaacatcattgagaactattacaagaacgcccagatcagcgccagcaaggg
[0251]
aaacaacaaggccatcaagaagtaccagaaaaaggtcatcgagtgctacatcggct
[0252]
acctccgtaagaactatgaggaactgttcgacttcagcgatttcaagatgaacatcc
[0253]
aagagatcaaaaagcagatcaaggatatcaatgataacaagacctacgagcgtatt
[0254]
accgtcaagaccagcgataagaccatcgtcatcaacgatgacttcgagtacattatc
[0255]
tctatcttcgccctcctcaactccaacgcggtgattaacaagatccgtaaccgtttct
[0256]
tcgcgacctctgtgtggcttaacactagcgagtaccaaaacattatcgacatcctgg
[0257]
acgagatcatgcagctcaacactctcagaaacgagtgcatcaccgagaactggaac
[0258]
ctgaacctcgaagagttcatccaaaagatgaaggaaatcgaaaaggactttgacga
[0259]
ctttaagatccagaccaagaaagagattttcaacaactattacgaggatattaaga
[0260]
acaacatcttgactgagtttaaggacgacattaacgggtgcgacgtgctcgaaaag
[0261]
aagttggagaaaatcgtcatcttcgacgacgagactaagttcgaaatcgacaagaa
[0262]
gtctaacatcctccaggacgagcagaggaagctcagcaacattaacaaaaaagacc
[0263]
ttaaaaagaaggtggaccagtacattaaggacaaggaccaagagattaagagcaa
[0264]
gatcctctgcaggatcatcttcaacagcgactttctcaaaaagtataagaaagaaat
[0265]
tgacaacctcatcgaggacatggaaagcgagaatgagaacaagtttcaagagatct
[0266]
actacccgaaagagcgtaagaacgaactgtacatctacaagaaaaacctgttcctg
[0267]
aacatcgggaacccgaatttcgacaagatctacgggctcatcagcaatgacattaa
[0268]
gatggccgacgccaagttcctgttcaacatcgacggaaagaacattaggaagaaca
[0269]
aaatcagcgagattgacgccatcctgaagaaccttaacgacaagctcaacgggtac
[0270]
tccaaagagtacaaagaaaagtatatcaaaaagttgaaagagaatgacgacttctt
[0271]
tgccaagaacatccagaacaagaactacaagagcttcgagaaggactacaaccgtg
[0272]
tgagcgagtacaagaagatcagggacctcgtcgagttcaactacctgaacaagatc
[0273]
gagagctacctgatcgacatcaactggaagctcgctatccagatggctaggttcga
[0274]
gagggatatgcactacatcgtgaacggacttcgagagctgggcatcatcaagctct
[0275]
caggatacaacaccggaatcagcagggcttaccctaagaggaatggaagcgacgg
[0276]
attctacactaccaccgcctactacaagtttttcgacgaggaaagctataagaagtt
[0277]
tgaaaagatctgttacggcttcgggatcgacctctctgagaacagtgaaatcaaca
[0278]
agcctgagaacgagtctatcgcaaactacatcagcgccttctacatcgttaggaacc
[0279]
cgttcgccgactactctatcgctgagcagatcgatagagtgagcaacctgctctctt
[0280]
acagcaccaggtacaacaactcgacctacgcctctgttttcgaagtgttcaagaagg
[0281]
atgttaacctcgactacgacgagttgaagaagaaattcaagctgatcgggaacaat
[0282]
gacatactcgagcgactcatgaagcctaagaaggtgtcagttctcgagttggagag
[0283]
ctacaactccgactacatcaaaaacctcatcatcgagctgctcaccaaaatcgaga
[0284]
acactaacgataccctgcatcaccatcaccaccacggtaccctgcctcctctggagc
[0285]
gactgaccctgtccggaggatcctccggaggatcctccggatccgaaaccccagga
[0286]
acctccgaatccgctaccccagaatcctccggaggatcctccggaggatcccgtgct
[0287]
gattactgttctgaagctgaacttggtgaggcacaatggattaactgtgacatccgt
[0288]
tcttttcgaatggacattttgggaacctttggagttgttatggcggatccaccatgg
[0289]
gacattcacatggaacttccatatggaacaatggctgatgacgaaatgcgaactctt
[0290]
aatgttccctcgttacagactgacggtttgattttcctctgggtcactggtcgtgcta
[0291]
tggaactaggccgtgaatgtttggagctttggggatacaagcgagtggaagagatc
[0292]
atatgggtaaagacaaatcaacttcaacgtattattcgaacaggaagaacaggtca
[0293]
ctggctcaaccatagcaaagagcattgtctggttggaatcaaaggaaatccagaag
[0294]
tgaacagaaacatcgacacagatgtgattgtcgcagaggttagagaaacaagccgg
[0295]
aagccagacgagatgtatgcaatgttagagaggatcatgccaagagcaagaaagct
[0296]
cgagttattcgcccgtatgcacaatgctcatgccggatggctatcacttgggaacca
[0297]
gcttaacggtgtccgattaataaacgaaggtcttcgagctcggtttaaagcatcata
[0298]
ccctgaaatagatgtccagccaccatcaccaccaagaggaggatccggaggatccg
[0299]
gaggatccggaggatccggaggatccggaggatccggaggatccggaggatccgg
[0300]
aggatccggatccccttctaggggagagcaaaatgactattcccagaactttgtgg
[0301]
atactggaatgcggccccagaatttcattcgggagctggagcttaccaatgtggaa
[0302]
gactaccccaagcttagagagctcatacagaagaaggatgagattgtatctaattc
[0303]
tgcttctgcaccaatgtatctgaaaggcgacttgcatgaagttgagttatctcccga
[0304]
gttatttggaacaaagtttgatgttattcttgttgacccaccatgggaggaatatgt
[0305]
ccatagagctcctggtgtttctgatagtatggagtattggacatttgaggacattat
[0306]
caatctcaagattgaggcaatagctgacactccatccttcctcttcctctgggttggt
[0307]
gatggtgttgggcttgagcaagggcgccaatgcctgaaaaagtggggtttcagaag
[0308]
gtgtgaagacatttgctgggtgaaaaccaacaaaagtaatgcagcaccaacattgc
[0309]
gacatgattctcgtactgtgtttcagcgttccaaggagcactgcttgatggggataa
[0310]
agggtactgttcgacgtagcactgatggccatataatccatgctaacatcgacactg
[0311]
acgtaattattgctgaagagcctccttatggttcgactcagaagcctgaagatatgt
[0312]
ataggataatagagcattttgcacttggtcgccggaggcttgagcttttcggtgaag
[0313]
accacaatattcgagctggctggcttactgttggaaaaggcctttcgtcctcaaact
[0314]
ttgagccacaggcttatgtgaggaacttcgcagacaaggagggtaaagtgtggcta
[0315]
ggaggaggaggaagaaatccacctccagacgcaccgcatcttgttgtgactactcc
[0316]
cgatatagaatcgctgcggcccaaatcaccaatgaagaatcagcaacaacaagtcg
[0317]
actacccatacgatgttccagattacgcttatccctacgacgtgcctgattatgcat
[0318]
acccatatgatgtccccgactatgcctaa
[0319]
seq id no.8：》dcdm核酸序列
[0320]
[0321]
[0322]
[0323][0324]
注：加粗且有下划线的核酸碱基为1445位mta甲基转移酶点突变位点，为a-》c
[0325]
seq id no.9：》人源去甲基化酶alkbh5核苷酸序列
[0326]
atggcggccgccagcggctacacggacctgcgtgagaagctcaagtccatgacgtcccgggacaactataaggcgggcagccgggaggccgccgccgctgccgcagccgccgtagccgccgcagccgcagccgccgctgccgccgaaccttaccctgtgtccggggccaagcgcaagtatcaggaggactcggaccccgagcgcagcgactatgaggagcagcagctgcagaaggaggaggaggcgcgcaaggtgaagagcggcatccgccagatgcgcctcttcagccaggacgagtgcgccaagatcgaggcccgcattgacgaggtggtgtcccgcgctgagaagggcctgtacaacgagcacacggtggaccgggccccactgcgcaacaagtacttcttcggcgaaggctacacttacggcgcccagctgcagaagcgcgggcccggccaggagcgcctctacccgccgggcgacgtggacgagatccccgagtgggtgcaccagctggtgatccaaaagctggtggagcaccgcgtcatccccgagggcttcgtcaacagcgccgtcatcaacgactaccagcccggcggctgcatcgtgtctcacgtggaccccatccacatcttcgagcgccccatcgtgtccgtgtccttctttagcgactctgcgctgtgcttcggctgcaagttccagttcaagcctattcgggtgtcggaaccagtgctttccctgccggtgcgcaggggaagcgtgactgtgctcagtggatatgctgctgatgaaatcactcactgcatacggcctcaggacatcaaggagcgccgagcagtcatcatcctcaggaagacaagattagatgcaccccggttggaaacaaagtccctgagcagctccgtgttaccacccagctatgcttcagatcgcctgtcaggaaacaacagggaccctgctctgaaacccaagcggtcccaccgcaaggcagaccctgatgctgcccacaggccacggatcctggagatggacaaggaagagaaccggcgctcggtgctgctgcccacacaccggcggaggggtagcttcagctctgagaactactggcgcaagtcatacgagtcctcagaggactgctctgaggcagcaggcagccctgcccgaaaggtgaagatgcggcggcac
[0327]
seq id no.10：》dca
[0328]
atgggaaacctcttcggacacaagagatggtacgaggtgagggacaagaaggacttcaagatcaagcgtaaggtgaaggtgaagaggaactacgacgggaacaagtacatcctcaacatcaacgagaacaacaacaaagagaagatcgataacaacaagttcatccgtaagtacatcaactacaagaagaacgacaacatcctgaaagagttcacgaggaagttccacgccggaaacatcctcttcaagctcaagggaaaagaggggatcatcaggattgagaacaacgacgacttcctcgagactgaagaggtggtgctttacatcgaggcttacgggaagtctgagaagcttaaggctctcgggatcaccaagaagaagatcatcgacgaggctatcaggcagggaatcaccaaggatgacaagaagattgagatcaagaggcaagagaacgaggaagagatcgagatcgatatcagggacgagtacaccaacaa
[0329]
gaccctcaacgactgctctatcatcctccgtatcatcgagaacgacgagcttgagac
[0330]
taagaagtccatctacgagatcttcaagaacatcaacatgagcctctacaagattat
[0331]
cgagaaaattatcgaaaacgagactgagaaggtgttcgagaacaggtactacgag
[0332]
gaacacctccgtgagaagctcctcaaggacgataagatcgatgtgatcctcaccaa
[0333]
cttcatggaaattcgtgagaagatcaagtccaacctcgagatcctcggcttcgtgaa
[0334]
gttctaccttaacgttggcggggataagaagaagtcgaagaacaagaaaatgctgg
[0335]
tcgagaagatcttgaacattaacgtggacctcaccgtcgaggatatcgctgacttcg
[0336]
tgatcaaagagcttgagttctggaacatcaccaagcgtatcgagaaggtgaaaaag
[0337]
gtgaacaacgagttccttgagaagaggcgtaacaggacctatatcaagagctacgt
[0338]
gctcctcgacaagcacgagaagtttaagatcgagcgtgagaacaaaaaggacaag
[0339]
atcgtcaagttcttcgtggaaaacatcaagaacaactccatcaaagagaaaattga
[0340]
gaagattctcgccgagttcaagattgacgagctgatcaagaagctcgagaaagagc
[0341]
tgaagaagggcaactgcgacactgagatcttcgggattttcaagaagcactacaag
[0342]
gtcaacttcgacagcaagaagttctccaagaagtccgacgaagagaaagagttgta
[0343]
caagatcatctaccgttacctcaaggggcgtatcgaaaagatccttgtgaacgagc
[0344]
agaaggtgaggctcaagaagatggaaaagattgaaatagagaaaatcctcaacga
[0345]
gagcatcctctcggagaagatccttaagagggtgaagcagtacaccctcgagcaca
[0346]
tcatgtacctcggaaagctcaggcacaacgacatcgatatgactaccgtgaacacg
[0347]
gacgacttctctaggctccatgccaaagaagagttggacctcgagcttatcaccttc
[0348]
ttcgccagcactaacatggaactcaacaagatattcagccgagagaatatcaacaa
[0349]
cgatgagaacatcgactttttcggcggcgaccgagagaagaactacgttctcgaca
[0350]
aaaagattctcaactctaagatcaagatcattagggacctcgacttcatcgacaaca
[0351]
agaacaatatcaccaacaacttcatcagaaagttcaccaagatcgggaccaacgag
[0352]
gcgaacagaatcctcgccgctatcagcaaagagagggatctccagggaacccagga
[0353]
cgactataacaaggtgatcaacatcatccagaacctgaagatcagtgacgaagagg
[0354]
tgagcaaggctctcaacctcgatgtggtgttcaaggataagaaaaacatcatcacg
[0355]
aagattaacgacatcaagatctccgaggaaaacaacaacgatatcaagtacctgcc
[0356]
gagcttcagcaaggttctccctgagattcttaacctctaccgtaacaacccgaagaa
[0357]
cgagcctttcgacactatcgagacagaaaagatcgtgctcaacgccctcatctacgt
[0358]
gaacaaagaactctacaaaaagctcatcttggaggacgaccttgaggaaaacgagt
[0359]
ccaagaacatattcctgcaagagcttaagaaaaccctcgggaacatcgatgagatc
[0360]
gacgagaacatcattgagaactattacaagaacgcccagatcagcgccagcaaggg
[0361]
aaacaacaaggccatcaagaagtaccagaaaaaggtcatcgagtgctacatcggct
[0362]
acctccgtaagaactatgaggaactgttcgacttcagcgatttcaagatgaacatcc
[0363]
aagagatcaaaaagcagatcaaggatatcaatgataacaagacctacgagcgtatt
[0364]
accgtcaagaccagcgataagaccatcgtcatcaacgatgacttcgagtacattatc
[0365]
tctatcttcgccctcctcaactccaacgcggtgattaacaagatccgtaaccgtttct
[0366]
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[0367]
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[0368]
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[0408]
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[0410]
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[0415]
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[0417]
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[0418]
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[0419]
tacccatatgatgtccccgactatgcctaa
[0420]
seq id no.11：》dcda核酸序列
[0421]
[0422]
[0423][0424]
注：加粗且有下划线的核酸碱基为610、611位alkbh5去甲基化酶点突变位点，为ca-》gcseq id no.12:》荧光素酶报告基因完整载体序列：
[0425]
actcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgaattcccatggagtcaaagattcaaatagaggacctaacagaactcgccgtaaagactggcgaacagttcatacagagtctcttacgactcaatgacaagaagaaaatcttcgtcaacatggtggagcacgacacgcttgtctactccaaaaatatcaaagatacagtctcagaagaccaaagggcaattgagacttttcaacaaagggtaatatccggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcactttattgtgaagatagtggaaaaggaaggtggctcctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggccatcgttgaagatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgatatctccactgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagaggacagggtaccatggaagacgccaaaaacataaagaaaggcccggcgccattctatcctctagaggatggaaccgctggagagcaactgcataaggctatgaagagatacgccctggttcctggaacaattgcttttacagatgcacatatcgaggtgaacatcacgtacgcggaatacttcgaaatgtccgttcggttggcagaagctatgaaacgatatgggctgaatacaaatcacagaatcgtcgtatgcagtgaaaactctcttcaattctttatgccggtgttgggcgcgttatttatcggagttgcagttgcgcccgcgaacgacatttataatgaacgtgaattgctcaacagtatgaacatttcgcagcctaccgtagtgtttgtttccaaaaaggggttgcaaaaaattttgaacgtgcaaaaaaaattaccaataatccagaaaattattatcatggattctaaaacggattaccagggatttcagtcgatgtacacgttcgtcacatctcatctacctcccggttttaatgaatacgattttgtaccagagtcctttgatcgtgacaaaacaattgcactgataatgaattcctctggatctactgggttacctaagggtgtggcccttccgcatagaactgcctgcgtcagattctcgcatgccagagatcctatttttggcaatcaaatcattccggatactgcgattttaagtgttgttccattccatcacggttttggaatgtttactacactcggatatttgatatgtggatttcgagtcgtcttaa
[0426]
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[0477]
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[0480]
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[0481]
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[0482]
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[0483]
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[0485]
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[0487]
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[0489]
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[0493]
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[0520]
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[0529]
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[0540]
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[0541]
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ccgatattaccctttgttgaaaagtctcaatagccctttggtcttctgagactgtatctttgatattcttggagtagacgagagtgtcgtgctccac
[0545]
catgttatcacatcaatccacttgctttgaagacgtggttggaacgtcttctttttccacgatgctcctcgtgggtgggggtccatctttgggacc
[0546]
actgtcggcagaggcatcttgaacgatagcctttcctttatcgcaatgatggcatttgtaggtgccaccttccttttctactgtccttttgatgaagt
[0547]
gacagatagctgggcaatggaatccgaggaggtttcccgatattaccctttgttgaaaagtctcaatagccctttggtcttctgagactgtatctt
[0548]
tgatattcttggagtagacgagagtgtcgtgctccaccatgttggcaagctgctctagccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggcc
[0549]
gattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctc
[0550]
》grna靶点引物序列，f为上游引物，r为下游引物：
[0551]
seq id no.13：grna t1-f：aaactccaaactatcctgcggcctctactctg
[0552]
seq id no.14：grna t1-r：aaaacagagtagaggccgcaggatagtttgga
[0553]
seq id no.15：grna t2-f：aaaccttcttggcctttatgaggatctctctg
[0554]
seq id no.16：grna t2-r：aaaacagagagatcctcataaaggccaagaag
[0555]
》qpcr引物序列，f为上游引物，r为下游引物：
[0556]
seq id no.17：qluc-f：ggcggaaagtccaaattgt
[0557]
seq id no.18：qluc-r：cgtcatcgtccttgtaatcg
[0558]
》grna靶点引物序列，f为上游引物，r为下游引物：
[0559]
seq id no.19：grna shr-f：aaacccacttggcattggctgagaagtcgaaggaseq id no.20：grna shr-r：aaaatccttcgacttctcagccaatgccaagtgg
[0560]
》qpcr检测shr转录本rna修饰引物序列，f为上游引物，r为下游引物：
[0561]
seq id no.21：qshr-f：tcatcaaccccttcctccac
[0562]
seq id no.22：qshr-r：aaggacggaggagtttgagg
[0563]
seq id no.23：p1300质粒载体完整序列：
[0564]
aattcgagctcggtacccggggatcctctagagtcgacctgcaggcatgcaagcttggcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatgctagagcagcttgagcttggatcagattgtcgtttcccgccttcagtttaaactatcagtgtttgacaggatatattggcgggtaaacctaagagaaaagagcgtttattagaataacggatatttaaaagggcgtgaaaaggtttatccgttcgtccatttgtatgtgcatgccaaccacagggttcccctcgggatcaaagtactttgatccaacccctccgctgctatagtgcagtcggcttctgacgttcagtgcagccgtcttctgaaaacgacatgtcgcacaagtcctaagttacgcgacaggctgccgccctgcccttttcctggcgttttcttgtcgcgtgttttagtcgcataaagtagaatacttgcgactagaaccggagacattacgccatgaacaagagcgccgccgctggcctgctgggctatgcccgcgtcagcaccgacgaccaggacttgaccaaccaacgggccgaactgcacgcggccggctgcaccaagctgttttccgagaagatcaccggcaccaggcgcgaccgcccggagctggccaggatgcttgaccacctacgccctggcgacgttgtgacagtgaccaggctagaccgcctggcccgcagcacccgcgacctactggacattgccgagcgcatccaggaggccggcgcgggcctgcgtagcctggcagagccgtgggccgacaccaccacgccggccggccgcatggtgttgaccgtgttcgccggcattgccgagttcgagcgttccctaatcatcgaccgcacccggagcgggcgcgaggccgccaaggcccgaggcgtgaagtttggcccccgccctaccctcaccccggcacagatcgcgcacgcccgcgagctgatcgaccaggaaggccgcaccgtgaaagaggcggctgcactgcttggcgtgcatcgctcgaccctgtaccgcgcacttgagcgcagcgaggaagtgacgcccaccgaggccaggcggcgcggtgccttccgtgaggacgcattgaccgaggccgacgccctggcggccgccgagaatgaacgccaagaggaacaagcatgaaaccgcaccaggacggccaggacgaaccgtttttcattaccgaagagatcgaggcggagatgatcgcggccgggtacgtgttcgagccgcccgcgcacgtctcaaccgtgcggctgcatgaaatcctggccggtttgtctgatgccaagctggcggcctggccggccagcttggccgctgaagaaaccgagcgccgccgtctaaaaaggtgatgtgtatttgagtaaaacagcttgcgtcatgcggtcgctgcgtatatgatgcgatgagtaaataaacaaatacgcaaggggaacgcatgaaggttatcgctgtacttaaccagaaaggcgggtcaggcaagacgaccatcgcaacccatctagcccgcgccctgcaactcgccggggccgatgttctgttagtcgattccgatccccagggcagtgcccgcgattgggcggccgtgcgggaagatcaaccgctaaccgttgtcggcatcgaccgcccgacgattgaccgcgacgtgaaggccatcggccggcgcgacttcgtagtgatcgacggagcgcccca
[0565]
ggcggcggacttggctgtgtccgcgatcaaggcagccgacttcgtgctgattccggt
[0566]
gcagccaagcccttacgacatatgggccaccgccgacctggtggagctggttaagc
[0567]
agcgcattgaggtcacggatggaaggctacaagcggcctttgtcgtgtcgcgggcg
[0568]
atcaaaggcacgcgcatcggcggtgaggttgccgaggcgctggccgggtacgagct
[0569]
gcccattcttgagtcccgtatcacgcagcgcgtgagctacccaggcactgccgccgc
[0570]
cggcacaaccgttcttgaatcagaacccgagggcgacgctgcccgcgaggtccagg
[0571]
cgctggccgctgaaattaaatcaaaactcatttgagttaatgaggtaaagagaaaa
[0572]
tgagcaaaagcacaaacacgctaagtgccggccgtccgagcgcacgcagcagcaa
[0573]
ggctgcaacgttggccagcctggcagacacgccagccatgaagcgggtcaactttc
[0574]
agttgccggcggaggatcacaccaagctgaagatgtacgcggtacgccaaggcaag
[0575]
accattaccgagctgctatctgaatacatcgcgcagctaccagagtaaatgagcaa
[0576]
atgaataaatgagtagatgaattttagcggctaaaggaggcggcatggaaaatcaa
[0577]
gaacaaccaggcaccgacgccgtggaatgccccatgtgtggaggaacgggcggttg
[0578]
gccaggcgtaagcggctgggttgtctgccggccctgcaatggcactggaaccccca
[0579]
agcccgaggaatcggcgtgagcggtcgcaaaccatccggcccggtacaaatcggcg
[0580]
cggcgctgggtgatgacctggtggagaagttgaaggccgcgcaggccgcccagcgg
[0581]
caacgcatcgaggcagaagcacgccccggtgaatcgtggcaagcggccgctgatcg
[0582]
aatccgcaaagaatcccggcaaccgccggcagccggtgcgccgtcgattaggaagc
[0583]
cgcccaagggcgacgagcaaccagattttttcgttccgatgctctatgacgtgggca
[0584]
cccgcgatagtcgcagcatcatggacgtggccgttttccgtctgtcgaagcgtgacc
[0585]
gacgagctggcgaggtgatccgctacgagcttccagacgggcacgtagaggtttcc
[0586]
gcagggccggccggcatggccagtgtgtgggattacgacctggtactgatggcggt
[0587]
ttcccatctaaccgaatccatgaaccgataccgggaagggaagggagacaagcccg
[0588]
gccgcgtgttccgtccacacgttgcggacgtactcaagttctgccggcgagccgatg
[0589]
gcggaaagcagaaagacgacctggtagaaacctgcattcggttaaacaccacgcac
[0590]
gttgccatgcagcgtacgaagaaggccaagaacggccgcctggtgacggtatccga
[0591]
gggtgaagccttgattagccgctacaagatcgtaaagagcgaaaccgggcggccgg
[0592]
agtacatcgagatcgagctagctgattggatgtaccgcgagatcacagaaggcaag
[0593]
aacccggacgtgctgacggttcaccccgattactttttgatcgatcccggcatcggc
[0594]
cgttttctctaccgcctggcacgccgcgccgcaggcaaggcagaagccagatggtt
[0595]
gttcaagacgatctacgaacgcagtggcagcgccggagagttcaagaagttctgtt
[0596]
tcaccgtgcgcaagctgatcgggtcaaatgacctgccggagtacgatttgaaggag
[0597]
gaggcggggcaggctggcccgatcctagtcatgcgctaccgcaacctgatcgaggg
[0598]
cgaagcatccgccggttcctaatgtacggagcagatgctagggcaaattgccctag
[0599]
caggggaaaaaggtcgaaaaggtctctttcctgtggatagcacgtacattgggaac
[0600]
ccaaagccgtacattgggaaccggaacccgtacattgggaacccaaagccgtacat
[0601]
tgggaaccggtcacacatgtaagtgactgatataaaagagaaaaaaggcgattttt
[0602]
ccgcctaaaactctttaaaacttattaaaactcttaaaacccgcctggcctgtgcat
[0603]
aactgtctggccagcgcacagccgaagagctgcaaaaagcgcctacccttcggtcg
[0604]
ctgcgctccctacgccccgccgcttcgcgtcggcctatcgcggccgctggccgctca
[0605]
aaaatggctggcctacggccaggcaatctaccagggcgcggacaagccgcgccgtc
[0606]
gccactcgaccgccggcgcccacatcaaggcaccctgcctcgcgcgtttcggtgatg
[0607]
acggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaa
[0608]
gcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtg
[0609]
tcggggcgcagccatgacccagtcacgtagcgatagcggagtgtatactggcttaa
[0610]
ctatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaatac
[0611]
cgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctca
[0612]
ctgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaagg
[0613]
cggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagca
[0614]
aaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttcca
[0615]
taggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggc
[0616]
gaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtg
[0617]
cgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgg
[0618]
gaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcg
[0619]
ttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgcct
[0620]
tatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactgg
[0621]
cagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagag
[0622]
ttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgc
[0623]
gctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaa
[0624]
caaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcaga
[0625]
aaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtgg
[0626]
aacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgcattctaggtactaaaacaattca
[0627]
tccagtaaaatataatattttattttctcccaatcaggcttgatccccagtaagtcaa
[0628]
aaaatagctcgacatactgttcttccccgatatcctccctgatcgaccggacgcaga
[0629]
aggcaatgtcataccacttgtccgccctgccgcttctcccaagatcaataaagccac
[0630]
ttactttgccatctttcacaaagatgttgctgtctcccaggtcgccgtgggaaaaga
[0631]
caagttcctcttcgggcttttccgtctttaaaaaatcatacagctcgcgcggatcttt
[0632]
aaatggagtgtcttcttcccagttttcgcaatccacatcggccagatcgttattcagt
[0633]
aagtaatccaattcggctaagcggctgtctaagctattcgtatagggacaatccgat
[0634]
atgtcgatggagtgaaagagcctgatgcactccgcatacagctcgataatcttttca
[0635]
gggctttgttcatcttcatactcttccgagcaaaggacgccatcggcctcactcatg
[0636]
agcagattgctccagccatcatgccgttcaaagtgcaggacctttggaacaggcag
[0637]
ctttccttccagccatagcatcatgtccttttcccgttccacatcataggtggtccct
[0638]
ttataccggctgtccgtcatttttaaatataggttttcattttctcccaccagcttat
[0639]
ataccttagcaggagacattccttccgtatcttttacgcagcggtatttttcgatcag
[0640]
ttttttcaattccggtgatattctcattttagccatttattatttccttcctcttttcta
[0641]
cagtatttaaagataccccaagaagctaattataacaagacgaactccaattcact
[0642]
gttccttgcattctaaaaccttaaataccagaaaacagctttttcaaagttgttttca
[0643]
aagttggcgtataacatagtatcgacggagccgattttgaaaccgcggtgatcaca
[0644]
ggcagcaacgctctgtcatcgttacaatcaacatgctaccctccgcgagatcatccg
[0645]
tgtttcaaacccggcagcttagttgccgttcttccgaatagcatcggtaacatgagc
[0646]
aaagtctgccgccttacaacggctctcccgctgacgccgtcccggactgatgggctg
[0647]
cctgtatcgagtggtgattttgtgccgagctgccggtcggggagctgttggctggct
[0648]
ggtggcaggatatattgtggtgtaaacaaattgacgcttagacaacttaataacac
[0649]
attgcggacgtttttaatgtactgaattaacgccgaattaattcgggggatctggat
[0650]
tttagtactggattttggttttaggaattagaaattttattgatagaagtattttaca
[0651]
aatacaaatacatactaagggtttcttatatgctcaacacatgagcgaaaccctata
[0652]
ggaaccctaattcccttatctgggaactactcacacattattatggagaaactcgag
[0653]
cttgtcgatcgacagatccggtcggcatctactctatttctttgccctcggacgagtg
[0654]
ctggggcgtcggtttccactatcggcgagtacttctacacagccatcggtccagacg
[0655]
gccgcgcttctgcgggcgatttgtgtacgcccgacagtcccggctccggatcggacg
[0656]
attgcgtcgcatcgaccctgcgcccaagctgcatcatcgaaattgccgtcaaccaag
[0657]
ctctgatagagttggtcaagaccaatgcggagcatatacgcccggagtcgtggcga
[0658]
tcctgcaagctccggatgcctccgctcgaagtagcgcgtctgctgctccatacaagc
[0659]
caaccacggcctccagaagaagatgttggcgacctcgtattgggaatccccgaaca
[0660]
tcgcctcgctccagtcaatgaccgctgttatgcggccattgtccgtcaggacattgt
[0661]
tggagccgaaatccgcgtgcacgaggtgccggacttcggggcagtcctcggcccaa
[0662]
agcatcagctcatcgagagcctgcgcgacggacgcactgacggtgtcgtccatcac
[0663]
agtttgccagtgatacacatggggatcagcaatcgcgcatatgaaatcacgccatg
[0664]
tagtgtattgaccgattccttgcggtccgaatgggccgaacccgctcgtctggctaa
[0665]
gatcggccgcagcgatcgcatccatagcctccgcgaccggttgtagaacagcgggc
[0666]
agttcggtttcaggcaggtcttgcaacgtgacaccctgtgcacggcgggagatgca
[0667]
ataggtcaggctctcgctaaactccccaatgtcaagcacttccggaatcgggagcgc
[0668]
ggccgatgcaaagtgccgataaacataacgatctttgtagaaaccatcggcgcagc
[0669]
tatttacccgcaggacatatccacgccctcctacatcgaagctgaaagcacgagatt
[0670]
cttcgccctccgagagctgcatcaggtcggagacgctgtcgaacttttcgatcagaa
[0671]
acttctcgacagacgtcgcggtgagttcaggctttttcatatctcattgccccccgg
[0672]
gatctgcgaaagctcgagagagatagatttgtagagagagactggtgatttcagcg
[0673]
tgtcctctccaaatgaaatgaacttccttatatagaggaaggtcttgcgaaggatag
[0674]
tgggattgtgcgtcatcccttacgtcagtggagatatcacatcaatccacttgcttt
[0675]
gaagacgtggttggaacgtcttctttttccacgatgctcctcgtgggtgggggtcca
[0676]
tctttgggaccactgtcggcagaggcatcttgaacgatagcctttcctttatcgcaa
[0677]
tgatggcatttgtaggtgccaccttccttttctactgtccttttgatgaagtgacaga
[0678]
tagctgggcaatggaatccgaggaggtttcccgatattaccctttgttgaaaagtct
[0679]
caatagccctttggtcttctgagactgtatctttgatattcttggagtagacgagag
[0680]
tgtcgtgctccaccatgttatcacatcaatccacttgctttgaagacgtggttggaa
[0681]
cgtcttctttttccacgatgctcctcgtgggtgggggtccatctttgggaccactgtc
[0682]
ggcagaggcatcttgaacgatagcctttcctttatcgcaatgatggcatttgtaggt
[0683]
gccaccttccttttctactgtccttttgatgaagtgacagatagctgggcaatggaa
[0684]
tccgaggaggtttcccgatattaccctttgttgaaaagtctcaatagccctttggtct
[0685]
tctgagactgtatctttgatattcttggagtagacgagagtgtcgtgctccaccatg
[0686]
ttggcaagctgctctagccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattc
[0687]
attaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaac
[0688]
gcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttc
[0689]
cggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagct
[0690]
atgaccatgattacg
[0691]
本发明提供的植物rna甲基化和去甲基化编辑方法及其应用中所用原料及试剂均可由市场购得。
[0692]
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0693]
实施例1：
[0694]
1、dcm植物rna甲基化编辑工具载体的构建
[0695]
(1)lshcas13a来源于原核生物纤毛菌(所述核苷酸序列如seq id no.1)，申请人前期研究发现原始lshcas13a无法在植物细胞中正常表达(图1所示的e)，因此，首先需要对原始lshcas13a序列进行植物密码子优化，并进行酶活中心点突变，获得dcas13a(所述核苷酸序列如seq id no.2)。
[0696]
(2)通过pcr扩增拟南芥植物甲基转移酶mta及mtb编码基因核心功能域序列——δmta
446-667
(所述核苷酸序列如seq id no.3)和δmtb
562-876
(所述核苷酸序列如seq id no.4)。
[0697]
(3)人工合成nes-(sggs)
2-xten-(sggs)2linker连接序列(所述核苷酸序列如seq id no.5)和(ggs)
10
linker连接序列(所述核苷酸序列如seq id no.6)。
[0698]
(4)将以上序列按如下顺序
[0699]
dcas13a-nes-(sggs)
2-xten-(sggs)
2-δmta
446-667-(ggs)
10-δmtb
562-876
拼接，并在末端加上ha标签序列以方便实验检测，从而获得dcas13a-mta-mtb甲基化编辑融合蛋白，简称dcm(图1所示的a、b)(所述核苷酸序列如seq id no.7)。
[0700]
(5)将以上核苷酸连接序列插入到p1300载体骨架且该骨架包含atu6启动子驱动的crispr引导序列和卡那霉素、潮霉素抗性基因，获得完整的植物rna甲基化编辑质粒载体p1300-dcm。
[0701]
(6)另外，基于dcm，构建甲基转移酶活中心点突变的融合蛋白质粒载体p1300-dcdm(其中dcdm的核苷酸序列如seq id no.8，p1300的核苷酸序列如seq id no.23)以及只包含dcas13a而无甲基转移酶序列的质粒载体p1300-dcas13a，作为阴性对照(图1所示的a、b)。
[0702]
2、dca植物rna去甲基化编辑工具载体的构建
[0703]
(1)pcr扩增人源去甲基化酶alkbh5基因序列(所述核苷酸序列如seq id no.9)。
[0704]
(2)将序列按如下顺序dcas13a-nes-(sggs)
2-xten-(sggs)
2-alkbh5-3
×
ha拼接，获得dcas13a-alkbh5去甲基化编辑融合蛋白，简称dca(图1所示的c、d)(所述核苷酸序列如seq id no.10)。
[0705]
(3)将dca核酸连接序列插入到p1300载体骨架中，获得完整的植物rna去甲基化编辑质粒载体p1300-dca。
[0706]
(4)基于dca，构建去甲基转移酶活中心点突变的融合蛋白质粒载体p1300-dcda(其中dcda的核苷酸序列如seq id no.11)，作为阴性对照(图1所示的c、d)。
[0707]
3、烟草叶片中表达rna编辑工具蛋白
[0708]
(1)用含p1300-dcm/dcdm、p1300-dca/dcda和p1300-dcas13a质粒的农杆菌侵染本氏烟草叶片。
[0709]
(2)提取烟草蛋白，用ha抗体进行western blot检测，根据dcm的氨基酸序列计算蛋白的分子量应为237.58kda，dca的蛋白分子量应为218.16kda，单独的dcas13a蛋白分子量在166.3kda，可以看出dcm和dcdm在180kda以上的目标位置出现，dca和dcda也在180kda以上的目标位置出现，而dcas13a蛋白在130～180kda区间的目标位置出现(图1所示的f、
g)，表明甲基化编辑工具dcm和去甲基化编辑工具dca在植物中成功表达出蛋白。
[0710]
实施例2：
[0711]
1、烟草叶片中对外源基因进行编辑
[0712]
(1)在荧光素酶基因序列终止密码子后设计多个m6a识别基序作为报告基因(所述核苷酸序列如seq id no.12)(图2所示的a)。
[0713]
(2)载体构建：合成编辑靶点grna t1和t2引物序列(所述核苷酸序列如seq id no.13～16)，通过退火形成核苷酸二聚体结构，使用bsai内切酶切开
[0714]
p1300-dcm/dcdm/dca/dcda载体质粒环，利用t4 dna连接酶分别将靶点grna t1序列、t2序列退火形成核苷酸二聚体与p1300-dcm、p1300-dcdm和p1300-dca、p1300-dcda质粒载体片段进行连接反应，从而构建靶向编辑报告基因的rna甲基化质粒载体p1300-dcm-grna t1、p1300-dcdm-grna t1、p1300-dcm-grna t2、p1300-dcdm-grna t2和去甲基化质粒载体p1300-dca-grna t1、p1300-dcda-grna t1、p1300-dca-grna t2、p1300-dcda-grna t2，以及无插入grna t1序列和t2序列靶点的p1300-dcm-nontarget和p1300-dca-nontarget，作为阴性对照组。
[0715]
(3)农杆菌培养和活化：将构建好的报告基因载体及p1300-dcm-grna t1、p1300-dcdm-grna t1、p1300-dcm-grna t2、p1300-dcdm-grna t2和去甲基化质粒载体p1300-dca-grna t1、p1300-dcda-grna t1、p1300-dca-grna t2、p1300-dcda-grna t2编辑载体，以及阴性对照p1300-dcm-nontarget和p1300-dca-nontarget分别转化农杆菌gv3101，使用50mg/ml卡那霉素和50mg/ml利福平抗生素培养基进行抗性筛选和培养。用活化液(10mmol/l mes ph 5.6，10mmol/lmgcl2，and 150μmol/l acetosyringone)将菌体浓度调至od
600
＝1。
[0716]
(4)烟草叶片侵染：用l ml无菌注射器将活化过的农杆菌菌液注射到4周龄生长健康的叶片中，通过农杆菌侵染将报告基因载体及p1300-dcm-grna t1、p1300-dcm-grna t2和去甲基化质粒载体p1300-dca-grna t1、p1300-dca-grna t2编辑载体，以及阴性对照p1300-dcm-nontarget和p1300-dca-nontarget载体分别共转入本氏烟草叶片细胞中，从而实现对植物外源rna的甲基化和去甲基化编辑。2天后，对注射部位叶片进行取样。
[0717]
(5)m6a抗体ip：提取烟草叶片样品rna，吸取2μg总rna添加到300μl ip缓冲液(150mmol/lnacl、10mmol/l tris hcl[ph 7.5]、0.1％igepal ca-630，溶于无rna酶的水中)中，与1μgm6a抗体孵育，并在4℃下孵育2小时，得反应混合物。然后，将反应混合物与蛋白a/g磁珠在4℃下孵育1小时。然后用ip缓冲液洗涤反应混合物两次，用低盐ip缓冲液(50mmol/lnacl、10mmol/l tris-hcl[ph 7.5]、0.1％igepal ca-630，溶于无rna酶的水中)洗涤反应混合物二次，用高盐ip缓冲液(500mmol/lnacl，10mmol/l tris-hcl[ph 7.5]，0.1％igepal ca-630，溶于无rna酶的水中)洗涤反应混合物二次。广泛洗涤后，用trizol试剂纯化富集的m6a rna。
[0718]
(6)merip-qpcr检测：使用反转录试剂将所有纯化的m6a rna和作为input的1μg总rna进行反转录，获得cdna。合成qpcr检测引物(所述核苷酸序列如seq id no.17～18)，使用qpcr试剂进行实时定量pcr。计算m6a修饰相对含量：δct＝ip样本中靶基因的ct-input样本中靶蛋白的ct，δδct＝处理样本的δct
–
对照样本的δc t，m6a相对含量＝2-δδct
。
[0719]
(7)通过以上检测，可发现使用dcm rna甲基化编辑工具编辑靶点t1和t2后，相较
于对照dcm-nontarget和甲基转移酶活点突变(dcdm),dcm可以使报告基因转录本rna上m6a甲基化修饰水平发生显著上调(图2所示的b，表1)，表明dcm在烟草细胞中具有rna甲基化编辑活性。而使用dca rna去甲基化编辑工具编辑靶点t1和t2，相较于对照可以使报告基因转录本rna上m6a甲基化修饰水平发生显著下调，表明dca具有去甲基化编辑活性(图2所示的c，表2)。
[0720]
表1
[0721][0722]
表2
[0723][0724]
2、对拟南芥植物内源基因进行编辑
[0725]
(1)对拟南芥内源基因如shr基因，确定shr转录本rna上可发生m6a甲基化修饰的序列区间(图2所示的d)。
[0726]
(2)载体构建：合成shr基因转录本上编辑位点核苷酸引物序列(所述核苷酸序列如seq id no.19～20)，通过退火形成核苷酸二聚体结构，使用bsai内切酶切开p1300-dcm、p1300-dcdm和p1300-dca、p1300-dcda载体质粒环，利用t4 dna连接酶分别将靶点grna shr序列退火形成核苷酸二聚体与p1300-dcm、p1300-dcdm和p1300-dca、p1300-dcda质粒载体片段进行连接反应，构建靶向编辑植物内源基因rna甲基化质粒载体p1300-dcm-shr、p1300-dcdm-shr和p1300-dca-shr、p1300-dcda-shr，以及无编辑靶点的p1300-dcm-nontarget和p1300-dca-nontarget，作为阴性对照组。
[0727]
(3)转化农杆菌培养和活化：分别将质粒载体p1300-dcm-shr、p1300-dcdm-shr和p1300-dca-shr、p1300-dcda-shr，以及无编辑靶点的p1300-dcm-nontarget和p1300-dca-nontarget转化农杆菌gv3101，使用含50mg/ml的卡那霉素和50mg/ml利福平抗生素培养基进行抗性筛选和培养，用5％蔗糖溶液将菌体浓度调至od
600
＝1。
[0728]
(4)花侵染法转化拟南芥：在农杆菌侵染液中加入0.06％silwet l-77，将培养4～5周的拟南芥植株花序浸入侵染液，1分钟后取出。将侵染植株水平放置，暗培养1天后再正置正常光照培养。培养8周左右收获拟南芥种子。通过农杆菌花侵染法将编辑载体p1300-dcm-shr、p1300-dcdm-shr和p1300-dca-shr、p1300-dcda-shr，以及无编辑靶点的p1300-dcm-nontarget和p1300-dca-nontarget转入拟南芥中，获得转基因植株。
[0729]
(5)拟南芥转基因植株的筛选。将收获的拟南芥种子经75％乙醇浸泡1分钟后，于30％次氯酸钠溶液中消毒10分钟，然后播种于含50mg/ml潮霉素抗生素的1/2ms固体培养基上。培养两周后，转基因苗由于存在抗性基因能够正常生长，而非转基因苗由于不存在抗性基因无法正常生长。随后正常生长的转基因苗移入网室或人工气候室盆土栽培。
[0730]
(6)m6a抗体ip：提取转基因阳性植株花组织总rna，通过本实施例中1(5)的方法进行m6a ip，富集m6a修饰rna。
[0731]
(7)merip-qpcr检测：使用反转录试剂将所有纯化的m6a rna和作为input的1μg总rna进行反转录，获得cdna。合成shr转录本rna检测引物(所述核苷酸序列如seq id no.21～22)。
[0732]
(8)结果分析：通过merip-qpcr检测可发现内源基因shr转录本m6a甲基化水平在dcm-shr转基因中相对于对照组dcdm-shr和dcm-nontarget发生了显著上调(图2所示的e，表3)，表明dcm rna甲基化编辑工具可以成功甲基化编辑植物内源基因转录本rna。内源基因shr转录本m6a甲基化水平在dca-shr转基因中相对于对照组dca-nontarget发生了显著下调(图2所示的f，表4)，表明dca rna甲基化编辑工具可以成功去甲基化编辑植物内源基因转录本rna。
[0733]
表3
[0734][0735]
表4
[0736][0737]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.dcas13a，其特征在于，其突变位点包括：(ⅰ)、第1789、1790位的碱基ag突变为gc；和/或(ⅱ)、第1804、1805位的碱基ca突变为gc；和/或(ⅲ)、第3832、3833位的碱基cg突变为gc；和/或(ⅳ)、第3847、3848位的碱基ca突变为gc。2.如权利要求1所述的dcas13a，其特征在于，其具有(ⅰ)、如seq id no.2所示的核苷酸序列；或(ⅱ)、与(ⅰ)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(ⅰ)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或(ⅲ)、与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或(ⅳ)、与(ⅰ)～(ⅲ)任一项所述核苷酸序列具有至少80％序列同源性的核苷酸序列。3.如权利要求1或2所述的dcas13a在植物表达和/或基因编辑中的应用；所述基因编辑包括甲基化和/或去甲基化。4.表达元件，其特征在于，包括如下任意项：(ⅰ)、如权利要求1或2所述的dcas13a；和/或(ⅱ)、dcas13a、δmta
446-667
和δmtb
562-876
；和/或(ⅲ)、dcas13a和alkbh5；所述δmta
446-667
具有：(ⅰ)、如seq id no.3所示的核苷酸序列；或(ⅱ)、与(ⅰ)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(ⅰ)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或(ⅲ)、与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或(ⅳ)、与(ⅰ)～(ⅲ)任一项所述核苷酸序列具有至少80％序列同源性的核苷酸序列；所述δmtb
562-876
具有：(ⅰ)、如seq id no.4所示的核苷酸序列；或(ⅱ)、与(ⅰ)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(ⅰ)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或(ⅲ)、与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或(ⅳ)、与(ⅰ)～(ⅲ)任一项所述核苷酸序列具有至少80％序列同源性的核苷酸序列；所述alkbh5具有：(ⅰ)、如seq id no.9所示的核苷酸序列；或(ⅱ)、与(ⅰ)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(ⅰ)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或(ⅲ)、与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或(ⅳ)、与(ⅰ)～(ⅲ)任一项所述核苷酸序列具有至少80％序列同源性的核苷酸序列。
5.如权利要求4所述的表达元件，其特征在于，还包括nes-(sggs)
2-xten-(sggs)2linker和/或(ggs)
10
linker。6.如权利要求4或5所述的表达元件，其特征在于，包括如下任意项：(ⅰ)、依次包括dcas13a、nes-(sggs)
2-xten-(sggs)2、δmta
446-667
、(ggs)
10
和δmtb
562-876
；和/或(ⅱ)、依次包括dcas13a、nes-(sggs)
2-xten-(sggs)2和alkbh5；所述nes-(sggs)
2-xten-(sggs)2具有：(ⅰ)、如seq id no.5所示的核苷酸序列；或(ⅱ)、与(ⅰ)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(ⅰ)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或(ⅲ)、与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或(ⅳ)、与(ⅰ)～(ⅲ)任一项所述核苷酸序列具有至少80％序列同源性的核苷酸序列；所述(ggs)
10
具有：(ⅰ)、如seq id no.6所示的核苷酸序列；或(ⅱ)、与(ⅰ)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(ⅰ)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或(ⅲ)、与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或(ⅳ)、与(ⅰ)～(ⅲ)任一项所述核苷酸序列具有至少80％序列同源性的核苷酸序列。7.表达载体，其特征在于，包括如权利要求4至6任一项所述的表达元件。8.宿主，其特征在于，包括如下任意项：(ⅰ)、转染如权利要求4至6任一项所述的表达元件；和/或(ⅱ)、转染如权利要求7所述的表达载体。9.如下任意项在植物rna甲基化和/或去甲基化编辑中的应用：(ⅰ)、如权利要求4至6任一项所述的表达元件；和/或(ⅱ)、如权利要求7所述的表达载体；和/或(ⅲ)、如权利要求8所述的宿主。10.植物rna甲基化和/或去甲基化编辑方法，其特征在于，基于如下任意项编辑：(ⅰ)、如权利要求4至6任一项所述的表达元件；和/或(ⅱ)、如权利要求7所述的表达载体；和/或(ⅲ)、如权利要求8所述的宿主。

技术总结
本发明涉及植物基因编辑技术领域，植物RNA甲基化和去甲基化编辑方法及其应用。本发明基于CRISPR/LshCas13a系统特异性识别并结合RNA的功能，将植物RNA甲基转移酶复合体核心功能域MTA-MTB与无切割活性的dCas13a(deadCas13a)融合，获得dCas13a-MTA-MTB融合的RNA甲基化编辑工具。将RNA去甲基化酶ALKBH5与dCas13a融合，获得dCas13a-ALKBH5融合的RNA去甲基化编辑工具，该工具能够实现对特定基因进行m6A甲基化和去甲基化编辑。A甲基化和去甲基化编辑。


技术研发人员：施传琳 邹文莉 商连光
受保护的技术使用者：中国农业科学院农业基因组研究所
技术研发日：2023.04.17
技术公布日：2023/7/25