一种高纯度NK细胞库构建方法与流程

hope.bioscitrends.2020 sep 6.
9.2.beatriz c
ó
zar et al，tumor-infiltrating natural killer cells，cancer discov.2021 january 01；11(1):34
–
44.
10.3.kiessling r,klein e,wigzell h.“natural”killer cells in the mouse.i.cytotoxic cells with specificity for mouse moloney leukemia cells.specificity and distribution according to genotype.eur j immunol.1975；5:112
–
7.
11.4.martha luevano et al,the unique profile ofcord blood natural killer cells balances incomplete maturation and effective killing function upon activation,human immunology 73(2012)248-257.
12.5.jacob a.myers,jeffrey s.miller；exploring the nk cell platform for cancer immunotherapy,nat rev clin oncol,2021february,18(2):85-100.
13.6.ying gong et al,chimeric antigen receptor natural killer(car-nk)cell design and engineering for cancer therapy,j hematol oncol(2021)14:73.


技术实现要素：

14.本发明的第一目的在于提供一种高纯度nk细胞库构建方法，解决nk细胞复苏后再次扩增难的问题。
15.本发明的第二目的在于提供一种优化的nk细胞冻存体系和复苏培养体系。
16.为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
17.本发明第一方面提供了用于冻存、复苏nk细胞的试剂盒，所述的试剂盒包括细胞冻存液、nk细胞扩增培养基，所述的nk细胞扩增培养基包括以下组分：
18.血清替代物、il-2、il-15、复合维生素。
19.nk细胞(自然杀伤细胞)：如本文所用，“自然杀伤细胞”或nk细胞是由其标记表达和功能/活性定义的淋巴样细胞。例如，在人中，nk细胞表达cd56。在另外的实施方案中，此类nk细胞可以表达cd56和cd16。在另一个实例中，此类nk细胞可以是cd56+/cd3-细胞。nk细胞可以表达可变水平的cd56。例如，nk细胞可以是“cd56high”，这意味着nk细胞表达高水平的cd56，如通过本领域的方法评估的，例如通过流式细胞术评估的。作为另一个实例，nk细胞可以是“cd56dim”，这意味着nk细胞表达低但可检测水平的cd56，如通过本领域的方法评估的，例如通过流式细胞术评估的。
20.如本文中所使用的，术语“培养基”是指用于支持细胞生长的液体物质。在一些实施方案中，所示培养既可以是基于液体(例如水)的培养基，也可以包含例如以下的物质的组合：盐、营养素、矿物质、维生素、氨基酸、核酸、蛋白质，例如细胞因子、生长因子和激素等。
21.进一步，所述的细胞冻存液包括以下组分:
22.dmso、右旋糖酐、人血白蛋白、复方电解质溶液。
23.根据本发明的实施例，人血白蛋白的来源不受特别的限制，只要能提供人白蛋白即可，即可以来源于市售人血清白蛋白，也可以来源于人体血浆。人单个核细胞对人源性的人血清白蛋白或血浆的排异作用小，有利于冻存细胞的恢复。
24.进一步，所述的复合维生素包含维生素a/视黄醇、维生素b2/维生素b6/维生素b12、维生素c/l-抗坏血酸中一种或者多种。在本发明的具体实施例中，所述的复合维生素为维生素c和维生素b2的复合物。作为一种优选的实施方式，所述的复合维生素中，维生素c：维生素b2＝1:9。
25.抗坏血酸或维生素c：如本文所用的“抗坏血酸”或“维生素c”是指l-抗坏血酸及其衍生物，并且“l-抗坏血酸衍生物”意指通过在活体中的酶促反应变成维生素c的衍生物。l-抗坏血酸衍生物的实例包括维生素c磷酸酯、抗坏血酸葡糖苷、抗坏血酸乙基酯、维生素c酯、抗坏血酸四己基癸酸酯、抗坏血酸硬脂酸酯和抗坏血酸2-磷酸酯6-棕榈酸酯。维生素c磷酸酯的实例包括l-抗坏血酸磷酸酯的盐，诸如l-抗坏血酸磷酸酯na和l-抗坏血酸磷酸酯mg。在一个实施方案中，维生素c可以是抗坏血酸2-磷酸酯。
26.在本发明中，术语“血清替代物”指在细胞培养中作为血清(例如fbs)的替代用于细胞的培养的试剂。血清替代物的示例包括knockouttmsr(knockouttm血清替代物或ksr；gibco)、stemsure血清替代物(ssr；wakopurechemicalindustries,ltd.)、n-2添加物(wakopurechemicalindustries,ltd.)、cts
tm
免疫细胞血清替代物。
27.进一步，在nk细胞扩增培养基中，所述的血清替代物为cts
tm
免疫细胞血清替代物。
28.进一步，在nk细胞扩增培养基中，血清替代物的浓度为3％-10％、il-2的浓度为1000-10000iu/ml、il-15的的浓度为50-2000iu/ml、复合维生素的浓度为100-1000ng/ml。在本发明的具体实施例中，血清替代物的浓度为5％、il-2的浓度为1000iu/ml、il-15的的浓度为300iu/ml、复合维生素的浓度为100ng/ml。
29.进一步，所述的nk细胞扩增培养基的基础培养基选自nk macs,x-vivo15，gt-t551h3，cellgrowscgm，aim-v。在本发明的具体实施例中，所述的nk细胞扩增培养基的基础培养基为nkmacs。
30.进一步，在冻存液中，dmso的浓度为10％，右旋糖酐的浓度为0-10％，人血白蛋白的浓度为40％-50％，复方电解质溶液的浓度为40％-50％。在本发明的具体实施例中，人血白蛋白的浓度为40％，右旋糖酐的浓度为10％，复方电解质溶液的浓度为40％。
31.进一步，所述的人血白蛋白可以替换为自体血浆。进一步，在冻存液中，自体血浆的浓度为40％-50％，优选的，自体血浆的浓度为40％。
32.在本文中所使用的术语“自体血浆”是指与待诱导扩增和冻存的细胞具有同一来源的血浆。换言之，即该血浆与待诱导扩增的单个核细胞取自同一个体。由此，对自体的免疫细胞排异作用小，有利于冻存细胞的保护。
33.进一步，所述的复方电解质溶液可以替换为氯化钠注射液。进一步，在冻存液中，氯化钠注射液的浓度为40％-50％，优选的，氯化钠注射液的浓度为40％。
34.本发明第二方面提供了一种保存nk细胞的方法，所述的方法包括：
35.将待保存的nk细胞与细胞冻存液混合后进行冻存。其中，所述的细胞冻存液如本发明第一方面中所定义。
36.本发明第三方面提供了一种nk细胞复苏后扩增培养的方法，所述的方法包括：
37.将待复苏的nk细胞进行解冻，将解冻后的nk细胞与nk细胞扩增培养基混合后进行培养。其中，所述的nk细胞扩增培养基如本发明第一方面中所定义。
38.本发明第四方面提供了一种构建nk细胞库的方法，所述的方法包括：
39.(1)用包被液预处理细胞培养容器；
40.(2)获取单个核细胞；
41.(3)在1)获得的细胞培养容器中，将激活培养基用于2)中的单个核细胞的活化，所述的激活培养基包括血清替代物，il-2、il-15、il-21、cd137抗体、cd3抗体、复合维生素；
42.(4)补充第一扩增培养基，所述的第一扩增培养基包括血清替代物、il-2、il-15、il-21、复合维生素；
43.(5)补充nk细胞扩增培养基，所述的nk细胞扩增培养基如权利要求1中所定义，获得扩增的单个核细胞；
44.(6)使用磁珠对5)中获得的扩增的单个核细胞进行分选，获得nk细胞。
45.进一步，所述的包被液包括cd137抗体，cd28抗体，cd3抗体。在本发明的具体实施例中，cd137抗体的浓度为8μg/ml，cd28抗体的浓度为8μg/ml，cd3抗体的浓度为8μg/ml；
46.进一步，所述的激活培养基中，il-2的浓度为1000-10000iu/ml、il-15的浓度为50-2000iu/ml、il-21的浓度为0.1-5iu/ml、cd3抗体的浓度为5-15μg/ml、cd137抗体的浓度为5-15μg/ml、复合维生素的浓度为0-1000ng/ml、血清替代物的浓度为3-10％。在本发明的具体实施中，所述的激活培养基中，il-2的浓度为1000iu/ml、il-15的浓度为300iu/ml、il-21的浓度为0.2iu/ml、cd3抗体的浓度为5μg/ml、cd137抗体的浓度为5μg/ml、复合维生素的浓度为100ng/ml、血清替代物的浓度为5％；
47.进一步，所述的第一扩增培养基中，il-2的浓度为1000-10000iu/ml、il-15的浓度为50-2000iu/ml、il-21的浓度为0.1-5iu/ml、复合维生素的浓度为0-1000ng/ml、血清替代物的浓度为3-10％。在本发明的具体实施例中，所述的第一扩增培养基中，血清替代物的浓度为5％、il-2的浓度为1000iu/ml、il-15的浓度为300iu/ml、il-21的浓度为0.2iu/ml、复合维生素的浓度为100ng/ml。
48.进一步，所述的激活培养基、第一扩增培养基中的复合维生素各自独立地包含维生素a/视黄醇、维生素b2/维生素b6/维生素b12、维生素c/l-抗坏血酸中一种或者多种。在本发明的具体实施例中，所述的复合维生素为维生素c和维生素b2的复合物。作为一种优选的实施方式，所述的复合维生素中，维生素c：维生素b2＝1:9。
49.进一步，所述的激活培养基、第一扩增培养基中的血清替代物各自独立地为cts
tm
免疫细胞血清替代物。
50.进一步，所述的激活培养基、第一扩增培养基各自独立地选自下述基础培养基：nk macs,x-vivo15,gt-t551h3,cellgrowscgm,aim-v。优选的，所述的激活培养基、第一扩增培养基的基础培养基各自独立地为nkmacs。
51.进一步，所述的单个核细胞获自外周血、单采血、脐血或骨髓样本，优选的，所述的单个核细胞获自外周血。
52.进一步，获取单个核细胞的方法为密度梯度法，优选的，所述的密度梯度法的分离液为ficoll。
53.进一步，所述的磁珠包括cd3、cd14、cd19。
54.进一步，磁珠的用量为20μl/107细胞。
55.进一步，所述的方法还包括将本发明第一方面所述的试剂盒用于nk细胞的冻存、复苏。
56.本发明第五方面提供了一种产品，所述的产品包含由本发明第三方面、或本发明第四方面所述的方法获得的nk细胞。
57.进一步，所述的nk细胞的纯度在95％、96％、97％、98％、或99％以上。
58.本发明第六方面提供了本发明第五方面所述的产品在制备杀伤肿瘤细胞的制剂中的应用。在本发明的具体实施例中，所述的肿瘤细胞为k562-luc。
59.本发明第七方面提供了本发明第五方面所述的产品在制备细胞治疗的药物、制备抗病毒感染的药物、制备治疗癌症或自身免疫性疾病的药物中的用途；
60.所述用途还包括与抗体药物、核酸药物、小分子药物、溶瘤病毒药物和细胞药物联合治疗中的应用；在nk细胞与放射治疗、化疗药物、干细胞移植手术、介入治疗、消融治疗等治疗手段联合中的应用；
61.优选的，所述癌症包括急性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、肾上腺皮质癌、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎样/横纹肌样肿瘤、胆管癌、肝外膀胱癌、骨癌、脑干神经胶质瘤、脑癌、乳腺癌、支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤、类癌瘤、心脏肿瘤、中枢神经系统癌症、子宫颈癌、脊索瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性骨髓增生性病症、结肠癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、皮肤t细胞淋巴瘤、胆管癌、胚胎肿瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、鼻腔神经胶质瘤、尤文氏肉瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼癌、骨纤维组织细胞瘤、胆囊癌、胃癌、生殖细胞肿瘤、妊娠滋养细胞疾病、神经胶质瘤、头颈癌、心脏癌、肝细胞癌、组织细胞增多病、朗格汉斯细胞、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞肿瘤、胰腺神经内分泌肿瘤、卡波西肉瘤、肾癌、朗格汉斯细胞组织细胞增多病、喉癌、、唇癌和口腔癌、肝癌、小叶原位癌、肺癌、淋巴瘤、黑素瘤、间皮瘤、隐匿性原发性转移性鳞状颈部癌症、口癌、儿童多发性内分泌瘤形成综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞赘瘤、蕈样真菌病、骨髓发育不良综合征、骨髓发育不良/骨髓增生性赘瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生性病症、鼻腔和副鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口腔癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、胰腺神经内分泌肿瘤、乳头状瘤病、副神经节瘤、副鼻窦和鼻腔癌、副甲状腺癌、阴茎癌、咽癌、垂体肿瘤、浆细胞赘瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺胚细胞瘤、妊娠和乳腺癌、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、塞扎里综合征、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、隐匿性原发性转移性鳞状颈部癌症、胃癌、t细胞淋巴瘤、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、尿道癌、子宫癌、子宫内膜、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌韦尔姆斯氏瘤。
[0062]“治疗”疾病或病况是指执行方案，其可包括向患者施用一种或多种药物或细胞疗法产物，以努力减轻疾病的迹象或症状。所需的治疗效果包括降低疾病进展速率、改善或减轻疾病状态和缓解或改良预后。减轻可在疾病或病况的迹象或症状出现之前以及在它们出现之后发生。因此，“治疗”可以包括“预防”疾病或非所需的病况。另外，“治疗”不需要完全减轻迹象或症状，不需要治愈，且特别包括仅对患者具有边际效应的方案。
[0063]“自身免疫性疾病”是指其中免疫系统针对作为正常宿主的一部分的抗原(即，自体抗原)产生免疫反应(例如b细胞或t细胞反应)并且随后对组织有损伤的疾病。自体抗原可来源于宿主细胞，或可来源于共生生物体，诸如通常定殖在粘膜表面的微生物体(称为共生生物体)。
[0064]
优选的，所述自身免疫疾病包括阿狄森氏疾病、斑秃、强直性脊柱炎、自身免疫肝炎、自身免疫腮腺炎、克罗恩氏疾病、1型糖尿病、营养不良性大疱性表皮松解症、附睾炎、肾小球性肾炎、格雷夫斯氏疾病、吉兰-巴雷综合征、桥本氏疾病、溶血性贫血、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、重症肌无力、寻常型天疱疮、牛皮癣、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、斯耶格伦氏综合征、脊椎关节病变、甲状腺炎、血管炎、白癜风、粘液性水肿、恶性贫血、溃疡性结肠炎等等。
[0065]
有益效果
[0066]
本发明提供的nk细胞培养方法，可获得的nk细胞纯度在99％以上。本发明可有效解决高纯度nk细胞难获得的问题，为外周血分离培养的nk细胞的异体使用提供了可能。本发明可以实现构建人nk细胞库，将人健康的或者年轻的nk细胞通过一定方法建库，是充分保存和利用现有nk细胞资源的有效方法，它为存储自体或者异体在需要采用免疫细胞治疗技术时提供有力的支持，具有重要的意义。
附图说明
[0067]
图1为nk细胞培养至13天的增殖曲线；
[0068]
图2为第13天磁珠分选前后nk细胞流式结果，其中图a是分选前nk细胞流式结果，图b是分选后nk细胞流式结果；
[0069]
图3为冻存前后nk细胞对k562细胞的杀伤作用统计图；
[0070]
图4为复苏后第0天nk细胞流式结果图；
[0071]
图5为复苏培养23天nk细胞扩增能力统计图；
[0072]
图6为复苏培养23天nk细胞流式结果图；
[0073]
图7为复苏培养23天nk细胞对k562细胞的杀伤作用统计图；
[0074]
图8为cs10和jd-cf1冻存的nk细胞复苏后对k562细胞杀伤作用的比较结果图；
[0075]
图9为cs10和jd-cf1冻存的nk细胞复苏后扩增能力比较结果图；
[0076]
图10为cs10和jd-cf1冻存的nk细胞复苏后活率比较结果图；
[0077]
图11为nk细胞复苏后不同培养工艺扩增能力比较结果图；
[0078]
图12为nk细胞复苏后不同培养工艺细胞活率比较结果图。
具体实施方式
[0079]
下面将结合实施例及附图对本发明进行详细描述，以便于本领域技术人员理解和实施本发明，并进一步认识本发明的优点。
[0080]
除非在本发明说明书中另有定义，否则在此所有的技术术语都是根据本领域一般技术人员所通常使用和理解的惯用定义来使用。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0081]
实施例1nk细胞的扩增、冻存与复苏
[0082]
一、nk细胞的扩增、冻存工艺
[0083]
实验方法：
[0084]
1.细胞培养瓶的预处理
[0085]
将6.5ml含cd137单抗为8μg/ml，cd28单抗为8μg/ml，cd3单抗为8μg/ml的生理盐水
溶液，加入到75cm2底面积的细胞培养瓶中，并使液体充分在瓶底分散，4℃平放过夜。
[0086]
2.外周血单个核细胞(pbmc)的分离
[0087]
40ml外周血为例，如血量不同，可按此操作做相应调整。将经平皿检菌后无菌的40ml患者外周血在室温下差速离心水平低速心机中进行，离心30分钟，升9降7，使血浆和血细胞分离。
[0088]
将上层血浆转入离心管，56℃灭活30min之后，2000rpm离心10min，取上清4℃备用。
[0089]
将血细胞沉淀用等体积的生理盐水混匀，通过ficoll密度梯度离心分离外周血单个核细胞(pbmc)。具体的，将上述混合物小心加到含ficoll层的50ml离心管中，室温差速离心20分钟。吸取pbmc层，尽量吸尽两液面交界处的细胞层，加生理盐水吹打混匀，室温1500rpm离心10分钟。利用生理盐水再次洗涤细胞。
[0090]
弃去上清后，用10mlbuffer重悬细胞，定容到20ml。吸取少量细胞计数。
[0091]
3.接种
[0092]
按照2.0
×
106个/ml的细胞浓度，将步骤2获得的pbmc细胞接种到含用含5％血清替代物(cts
tm
免疫细胞血清替代物)，il-21000iu/ml、il-15300iu/ml、il-210.2iu/ml、cd1375μg/ml、cd35μg/ml、复合维生素(维生素c：维生素b2＝1:9)100ng/ml的12mlnk macs(miltenyi)培养基的步骤1获得的包被培养瓶中。在培养箱中(37℃，co2浓度为5％，湿度：45％-55％)培养。
[0093]
4.第一次补液
[0094]
在细胞接种后的第3天进行补液，补液体积为12ml。此时，补加的培养基为含有5％血清替代物、il-21000iu/ml、il-15300iu/ml、il-210.2iu/ml、复合维生素(维生素c：维生素b2＝1:9)100ng/ml的扩增培养基1(基础培养基为nk macs)。
[0095]
5.第二次补液
[0096]
在培养的第5天进行第二次补液，补液体积为12ml。此时，补加的培养基为含有5％的血清替代物、il-21000iu/ml、il-15300iu/ml、复合维生素100ng/ml的扩增培养基2(基础培养基为nk macs)。
[0097]
6.第三次补液
[0098]
在培养的第5天进行第二次补液，补液体积为12ml。此时，补加的培养基为含有5％的血清替代物、il-21000iu/ml、il-15300iu/ml、复合维生素100ng/ml的扩增培养基2(基础培养基为nk macs)。
[0099]
7.第四次补液
[0100]
第7天，检测细胞密度，按1
×
106个/ml细胞密度补充扩增培养基2，将细胞培养瓶放入培养箱中继续培养。
[0101]
8.第五次补液
[0102]
第9天，检测细胞密度，按1
×
106个/ml细胞密度补充扩增培养基2，将细胞培养瓶放入培养箱中继续培养。
[0103]
9.第六次补液
[0104]
第11天，检测细胞密度，按1
×
106个/ml细胞密度补充扩增培养基2，将细胞培养瓶放入培养箱中继续培养。
[0105]
10.nk细胞分选
[0106]
细胞培养第13天，将细胞悬液用70μm的细胞筛网过滤去除细胞团，取样计数，根据计数结果计算出macs-buffer和磁珠的用量，进行cd3、cd14、cd19的磁珠阴选，磁珠用量为20μl/107细胞。
[0107]
11.nk细胞冻存
[0108]
冻存液命名为jd-cf1，配方为10％dmso+10％右旋糖酐+40％人血白蛋白+40％复方电解质溶液。
[0109]
(1)收集细胞悬液，400g，10min、室温离心收集细胞；
[0110]
(2)生理盐水，400g，10min、室温离心清洗细胞沉淀；
[0111]
(3)生理盐水重悬细胞沉淀，70μm细胞筛网过滤；400g、10min室温离心收集细胞；
[0112]
(4)去除上清液，尽可能多地移除上清，以降低冻存液稀释程度；
[0113]
(5)取适量预冷(2-8℃)的jd-cf1冻存液重悬细胞，aopi染色并细胞计数，按5
×
107cells/ml冻存密度加入预冷的(2-8℃)jd-cf1冻存液；
[0114]
(6)将细胞/冻存液混合悬液分装到冻存管中并立即放入到(2-8℃)预冷的异丙醇梯度降温盒中；
[0115]
(7)-80℃条件下异丙醇降温盒放置18-24小时后，将冻存细胞取出并尽快转移到液氮中保存。
[0116]
实验结果
[0117]
细胞培养第13天，细胞密度为2.76
×
106，细胞扩增倍数25倍(如图1所示)。
[0118]
分选后获得的nk细胞纯度为99％(如图2所示)。
[0119]
二、nk细胞复苏后扩增培养工艺：
[0120]
实验方法
[0121]
1.nk细胞复苏
[0122]
从液氮罐中取出细胞，将冻存管快速浸入37℃恒温水浴中，令其尽快解冻。待完全解冻后，将混匀的细胞悬液快速转移至已加入10ml扩增培养基2的15ml离心管中，400g，10min室温离心。离心后去除上清，加入10ml扩增培养基2重悬细胞。
[0123]
2.nk细胞接种
[0124]
细胞接种密度为1.0
×
106个/ml，使用扩增培养基2进行接种。
[0125]
扩增培养基2为含5％血清替代物、il-21000iu/ml、il-15300iu/ml、复合维生素100ng/ml的nk macs(miltenyi)培养基。
[0126]
3.补液
[0127]
在细胞接种后的第3天进行第一次补液，调整细胞密度为1.0
×
106个/ml。之后隔天进行计数补液，保证细胞密度为1.0
×
106个/ml。补加的培养基为扩增培养基2。
[0128]
实验结果
[0129]
细胞接种后第23天，细胞扩增倍数为52倍。
[0130]
冻存前后nk细胞对k562细胞的杀伤作用如图3所示。
[0131]
复苏后第0天nk细胞流式结果如图4所示。
[0132]
复苏培养23天nk细胞扩增能力如图5所示。
[0133]
复苏培养23天nk细胞流式结果如图6所示。
[0134]
实施例2nk细胞复苏后细胞杀伤活性检测
[0135]
实验方法
[0136]
1.calcein-am工作液配制：用dmso将检测液配制成浓度为1μg/ml的工作液。
[0137]
2.靶细胞准备：
[0138]
(1)收集靶细胞k562-luc，400g，5min，室温离心收集细胞；
[0139]
(2)采用nk基础培养基(平衡至室温)重悬细胞，将靶细胞密度调整为1
×
106cells/ml；
[0140]
(3)每1
×
106个细胞加7.5μlcalcein-am工作液，放入37℃培养箱孵育30min，中途混匀1～2次；
[0141]
(4)染色结束后，400g，5min，室温离心收集细胞，用pbs(平衡至室温)洗涤细胞2次；
[0142]
(5)采用nk基础培养基(平衡至室温)重悬细胞，将靶细胞密度调整成2
×
105cells/ml。
[0143]
3.效应细胞准备
[0144]
(1)从2.4取适量的nk细胞，室温离心收集细胞；
[0145]
(2)采用nk基础培养基(平衡至室温)重悬细胞；
[0146]
(3)将效应细胞密度调整成2
×
106cells/ml。
[0147]
4.按照以下要求将效应细胞和靶细胞加入到96孔细胞培养板：
[0148]
自发孔：100μl培养基+100μl靶细胞
[0149]
最大孔：100μl靶细胞+50μlnk基础培养基
[0150]
实验孔：100μl靶细胞+100μl效应细胞
[0151]
5.将细胞放入37℃培养箱避光孵育4个小时。孵育结束，取出细胞培养板，最大释放孔加入50μl0.4％triton@。
[0152]
6.400g，室温离心5min，将150μl上清转移至酶标板中，上机检测。
[0153]
实验结果：
[0154]
复苏培养23天nk细胞对k562细胞的杀伤作用如图7所示。
[0155]
实施例3比较两种冻存工艺
[0156]
测试例(即实施例1)培养的nk细胞经冻存液jd-cf1冻存后，以对比例1中冻存液cs10作为对照，通过评价细胞冻存前后细胞数和细胞活率、体外杀伤活性以及复苏后扩增能力，比较两种冻存液对nk细胞冻存后活性的影响。
[0157]
对比例1nk细胞的培养与冻存工艺，与测试例的区别仅在于使用的冻存液不同。本对比例使用的冻存液为：临床级即用型冻存液cs10。
[0158]
结果显示：
[0159]
不同冻存液冻存的细胞复苏后，细胞的活率均出现轻微下降，无明显差异。细胞数都有所损失，细胞回收率jd-cf1组比cs10组更为稳定(如表1所示)。
[0160]
表1冻存前后nk细胞活率比较
[0161][0162]
复苏后，体外杀伤活性，如图8所示，jd-cf1组杀伤活性明显高于cs10组。
[0163]
细胞复苏后，进行体外扩增培养，结果显示，jd-cf1组细胞的扩增能力和活率明显优于cs10组(如图9-10所示)。
[0164]
本发明的nk细胞的培养与冻存工艺优于对比例工艺。
[0165]
实施例4比较不同工艺对复苏后nk细胞活性的影响
[0166]
nk细胞复苏后，以对比例2复苏后培养工艺作为对照，比较不同培养工艺对复苏后nk细胞活性的影响。
[0167]
测试例nk细胞复苏后扩增培养工艺：
[0168]
1.nk细胞复苏
[0169]
从液氮罐中取出细胞，将冻存管快速浸入37℃恒温水浴中，令其尽快解冻。待完全解冻后，将混匀的细胞悬液快速转移至已加入10ml扩增培养基2的15ml离心管中，400g，10min室温离心。离心后去除上清，加入10ml扩增培养基2重悬细胞。
[0170]
2.nk细胞接种
[0171]
细胞接种密度为1.0
×
106个/ml，使用扩增培养基2进行接种。
[0172]
扩增培养基2为含5％血清替代物、il-21000iu/ml、il-15300iu/ml、复合维生素100ng/ml的nk macs(miltenyi)培养基。
[0173]
3.补液
[0174]
在细胞接种后的第3天进行第一次补液，调整细胞密度为1.0
×
106个/ml。之后隔天进行计数补液，保证细胞密度为1.0
×
106个/ml。补加的培养基为扩增培养基2。
[0175]
对比例2nk细胞复苏后扩增培养工艺：
[0176]
本对比例提供的nk细胞复苏后培养工艺与测试例的区别仅在于使用的扩增培养基不同。本对比例使用的扩增培养基的配方：含5％血清替代物、il-21000iu/ml、il-1510ng/ml、il-21100ng/ml的nk macs(miltenyi)培养基。
[0177]
结果显示：如图11、12所示，本发明的nk细胞复苏后扩增培养工艺的扩增能力明显优于对比例工艺。
[0178]
尽管本发明已经参照附图和优选实施例进行了说明，但是，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。本发明的各种更改、变化、和等同物由所附的权利要求书的内容涵盖。

技术特征：
1.用于冻存、复苏nk细胞的试剂盒，所述的试剂盒包括细胞冻存液、nk细胞扩增培养基，其特征在于，所述的nk细胞扩增培养基包括以下组分：血清替代物、il-2、il-15、复合维生素；优选的，所述的细胞冻存液包括以下组分:dmso、右旋糖酐、人血白蛋白、复方电解质溶液；优选的，所述的复合维生素包含维生素a/视黄醇、维生素b2/维生素b6/维生素b12、维生素c/l-抗坏血酸中一种或者多种，优选的，所述的复合维生素为维生素c和维生素b2的复合物；优选的，在nk细胞扩增培养基中，所述的血清替代物为ctstm免疫细胞血清替代物。优选的，在nk细胞扩增培养基中，血清替代物的浓度为3％-10％、il-2的浓度为1000-10000iu/ml、il-15的的浓度为50-2000iu/ml、复合维生素的浓度为0-1000ng/ml，更为优选的，血清替代物的浓度为5％、il-2的浓度为1000iu/ml、il-15的的浓度为300iu/ml、复合维生素的浓度为100ng/ml；优选的，所述的nk细胞扩增培养基的基础培养基选自nk macs,x-vivo15,gt-t551h3,cellgrowscgm,aim-v，优选的，所述的nk细胞扩增培养基的基础培养基为nkmacs；优选的，在冻存液中，dmso的浓度为10％，右旋糖酐的浓度为0-10％，人血白蛋白的浓度为40％-50％，复方电解质溶液的浓度为40％-50％，更为优选的，人血白蛋白的浓度为40％，右旋糖酐的浓度为10％，复方电解质溶液的浓度为40％；优选的，所述的人血白蛋白可以替换为自体血浆，优选的，在冻存液中，自体血浆的浓度为40％-50％，更为优选的，自体血浆的浓度为40％，优选的，所述的复方电解质溶液可以替换为氯化钠注射液，优选的，在冻存液中，氯化钠注射液的浓度为40％-50％，更为优选的，氯化钠注射液的浓度为40％。2.一种保存nk细胞的方法，其特征在于，所述的方法包括：将待保存的nk细胞与细胞冻存液混合后进行冻存；其中，所述的细胞冻存液如权利要求1中所定义。3.一种nk细胞复苏后扩增培养的方法，其特征在于，所述的方法包括：将待复苏的nk细胞进行解冻，将解冻后的nk细胞与nk细胞扩增培养基混合后进行培养；其中，所述的nk细胞扩增培养基如权利要求1中所定义。4.一种构建nk细胞库的方法，其特征在于，所述的方法包括：(1)用包被液预处理细胞培养容器；(2)获取单个核细胞；(3)在1)获得的细胞培养容器中，将激活培养基用于2)中的单个核细胞的活化，所述的激活培养基包括血清替代物，il-2、il-15、il-21、cd137抗体、cd3抗体、复合维生素；(4)补充第一扩增培养基，所述的第一扩增培养基包括血清替代物、il-2、il-15、il-21、复合维生素；(5)补充nk细胞扩增培养基，所述的nk细胞扩增培养基如权利要求1中所定义，获得扩增的单个核细胞；(6)使用磁珠对5)中获得的扩增的单个核细胞进行分选，获得nk细胞；
优选的，所述的包被液包括cd137抗体，cd28抗体，cd3抗体，优选的，cd137抗体的浓度为8μg/ml，cd28抗体的浓度为8μg/ml，cd3抗体的浓度为8μg/ml；优选的，所述的激活培养基中，il-2的浓度为1000-10000iu/ml、il-15的浓度为50-2000iu/ml、il-21的浓度为0.1-5iu/ml、cd3抗体的浓度为5-15μg/ml、cd137抗体的浓度为5-15μg/ml、复合维生素的浓度为0-1000ng/ml、血清替代物的浓度为3-10％，更为优选的，所述的激活培养基中，il-2的浓度为1000iu/ml、il-15的浓度为300iu/ml、il-21的浓度为0.2iu/ml、cd3抗体的浓度为5μg/ml、cd137抗体的浓度为5μg/ml、复合维生素的浓度为100ng/ml、血清替代物的浓度为5％；优选的，所述的第一扩增培养基中，il-2的浓度为1000-10000iu/ml、il-15的浓度为50-2000iu/ml、il-21的浓度为0.1-5iu/ml、复合维生素的浓度为0-1000ng/ml、血清替代物的浓度为3-10％，更为优选的，所述的第一扩增培养基中，血清替代物的浓度为5％、il-2的浓度为1000iu/ml、il-15的浓度为300iu/ml、il-21的浓度为0.2iu/ml、复合维生素的浓度为100ng/ml；优选的，所述的激活培养基、第一扩增培养基中的复合维生素各自独立地包含维生素a/视黄醇、维生素b2/维生素b6/维生素b12、维生素c/l-抗坏血酸中一种或者多种，优选的，所述的复合维生素为维生素c和维生素b2的复合物；优选的，所述的激活培养基、第一扩增培养基中的血清替代物各自独立地为ctstm免疫细胞血清替代物；优选的，所述的激活培养基、第一扩增培养基各自独立地选自下述基础培养基：nk macs,x-vivo15,gt-t551h3,cellgrowscgm,aim-v,优选的，所述的激活培养基、第一扩增培养基的基础培养基各自独立地为nk macs。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的单个核细胞获自外周血、单采血、脐血或骨髓样本，优选的，所述的单个核细胞获自外周血，优选的，获取单个核细胞的方法为密度梯度法，优选的，所述的密度梯度法的分离液为ficoll。6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的磁珠包括cd3、cd14、cd19，优选的，磁珠的用量为20μl/107细胞。7.根据权利要求4-6任一项所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括将权利要求1所述的试剂盒用于nk细胞的冻存、复苏。8.一种产品，其特征在于，所述的产品包含由权利要求3、或权利要求4-7任一项所述的方法获得的nk细胞，优选的，所述的nk细胞的纯度在95％、96％、97％、98％、或99％以上。9.权利要求8所述的产品在制备杀伤肿瘤细胞的制剂中的应用，优选的，所述的肿瘤细胞为k562-luc。10.权利要求8所述的产品在制备细胞治疗的药物、制备抗病毒感染的药物、制备治疗癌症或自身免疫性疾病的药物中的用途；所述用途还包括与抗体药物、核酸药物、小分子药物、溶瘤病毒药物和细胞药物联合治疗中的应用；在nk细胞与放射治疗、化疗药物、干细胞移植手术、介入治疗、消融治疗等治疗手段联合中的应用；
优选的，所述癌症包括急性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、肾上腺皮质癌、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎样/横纹肌样肿瘤、胆管癌、肝外膀胱癌、骨癌、脑干神经胶质瘤、脑癌、乳腺癌、支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤、类癌瘤、心脏肿瘤、中枢神经系统癌症、子宫颈癌、脊索瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性骨髓增生性病症、结肠癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、皮肤t细胞淋巴瘤、胆管癌、胚胎肿瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、鼻腔神经胶质瘤、尤文氏肉瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼癌、骨纤维组织细胞瘤、胆囊癌、胃癌、生殖细胞肿瘤、妊娠滋养细胞疾病、神经胶质瘤、头颈癌、心脏癌、肝细胞癌、组织细胞增多病、朗格汉斯细胞、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞肿瘤、胰腺神经内分泌肿瘤、卡波西肉瘤、肾癌、朗格汉斯细胞组织细胞增多病、喉癌、、唇癌和口腔癌、肝癌、小叶原位癌、肺癌、淋巴瘤、黑素瘤、间皮瘤、隐匿性原发性转移性鳞状颈部癌症、口癌、儿童多发性内分泌瘤形成综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞赘瘤、蕈样真菌病、骨髓发育不良综合征、骨髓发育不良/骨髓增生性赘瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生性病症、鼻腔和副鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口腔癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、胰腺神经内分泌肿瘤、乳头状瘤病、副神经节瘤、副鼻窦和鼻腔癌、副甲状腺癌、阴茎癌、咽癌、垂体肿瘤、浆细胞赘瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺胚细胞瘤、妊娠和乳腺癌、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、塞扎里综合征、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、隐匿性原发性转移性鳞状颈部癌症、胃癌、t细胞淋巴瘤、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、尿道癌、子宫癌、子宫内膜、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌韦尔姆斯氏瘤；优选的，所述自身免疫疾病包括阿狄森氏疾病、斑秃、强直性脊柱炎、自身免疫肝炎、自身免疫腮腺炎、克罗恩氏疾病、1型糖尿病、营养不良性大疱性表皮松解症、附睾炎、肾小球性肾炎、格雷夫斯氏疾病、吉兰-巴雷综合征、桥本氏疾病、溶血性贫血、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、重症肌无力、寻常型天疱疮、牛皮癣、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、斯耶格伦氏综合征、脊椎关节病变、甲状腺炎、血管炎、白癜风、粘液性水肿、恶性贫血、溃疡性结肠炎等等。

技术总结
本发明提供了一种高纯度NK细胞库构建方法，所述的方法包括NK细胞的体外扩增、NK细胞磁珠分选、NK细胞的冻存、NK细胞冻存后扩增培养。本发明的技术方案增强了NK细胞复苏后再次扩增能力，具有应用前景。具有应用前景。具有应用前景。


技术研发人员：吕学燕 王静宜 黄园园 杨月峰 王立燕 郭雷鸣
受保护的技术使用者：北京景达生物科技有限公司
技术研发日：2023.04.21
技术公布日：2023/7/25