一株解淀粉芽孢杆菌新菌及其应用的制作方法

1.本发明涉及微生物菌种及其应用的技术领域，具体的涉及解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)c生防菌剂及其在制备防治梨火疫病菌药物中应用的技术领域。


背景技术：

2.中国是全球栽培梨的三大起源中心之一，也是全球主要的梨生产区域，梨种植面积和产量占世界梨栽培面积和总产量的69.1％和68.4％，出口量居世界第一。库尔勒香梨(简称香梨，pyrussinkian-gensis)已有1400年栽培历史，是一个地域性极强的地方特色品种。随着香梨生产的发展，种植规模不断扩大，各种病害相继发生，成为影响香梨生产的突出问题。梨火疫病于2020年被中国农业农村部列入《一类农作物病虫害名录》。
3.梨火疫病是由e.amylovora引起的。e.amylovora为直杆菌，外表附有荚膜，周生鞭毛，大小为0.9～1.8
×
0.6～1.5μm，多数单生。e.amylovora的最适生长温度28℃，湿度70％，ph为6。e.amylovora可以侵染寄主植物的花朵、果实、叶片、茎、活跃生长的嫩枝以及砧木等部位。植株被侵染之后，初期感染部位会出现浸水，然后会变成深绿色，枯萎，最后从褐色变到黑色，像是被火烧过，且在植株的感染部位会渗出类似琥珀色的粘稠液滴。由于e.amylovora的生存和迁移能力强，且易感品种及组织的多样性高，难以找到统一有效的根治靶标，导致梨火疫病的治理十分困难。目前，对于梨火疫病的预防和控制手段主要包括隔离检疫、施药，培育抗性品种和剪枝挖树等。鉴于易产生耐药性、海关对试剂残留物的管制以及人们对有机农产品的消费偏好等多方面因素，生物防控手段的重要性日益凸显。生物防治可有效解决农药残留问题，利用微生物防治病害不易使病原菌产生耐药性且对人体无害，不会造成环境污染。
4.花簇是最为感病的器官，花期发病会引发随后的嫩枝枯死，枝干发病。因此花期的防治是控制该病害最为关键的环节。梨火疫病菌首先在花的柱头定殖，蔷薇科植物花的柱头为典型的“湿柱头”，可为梨火疫病菌提供营养，病菌在柱头繁殖一定数量后，通过雨水进入蜜腺。通常情况下，蜜腺中的花蜜含有高浓度的蔗糖，抑制了梨火疫病菌的生长。发病的必要条件是蜜腺中的花蜜被水稀释，渗透压降低后梨火疫病菌生长繁殖，然后引起花腐。


技术实现要素：

5.针对现有梨火疫病防治难度大，且适用的菌株少，防治效果有待进一步提高的技术现状，本发明旨在于提供一株新菌解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)c及其生防菌剂和应用，本发明从新疆库尔勒香梨园香梨蜜腺上分离得到的解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)c，抑菌活性具有广谱性。对水稻白叶枯病菌pxo 99的抑制效果最好，抑菌圈直径为43.33mm，对芦蒿软腐病菌pcb、梨火疫病菌和甜瓜角斑病菌的抑菌圈直径分别为6mm、9.83mm和9.97mm；利用解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)c制备的生防菌剂，对葡萄座腔菌的抑菌率为71.3％，对草莓疫霉病菌和草莓疫霉病菌的抑
菌率分别为26.05％和27.85％；将其应用于制备防治香梨火疫病菌的药物中，菌株浓度不超过5％，添加蔗糖可以促进梨火疫病菌的生长；蔗糖浓度超过10％会抑制梨火疫病菌的生长，当蔗糖浓度超过25％，梨火疫病菌无法生长。对于梨火疫病菌病生物防治具有广泛的应用价值。
6.为了达到以上技术目的，本发明采用如下的技术方案：
7.一株新菌解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)c，所述菌株解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)c属于芽孢杆菌属中新菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为cgmcc no.22859。
8.本发明中，菌种解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)c分离筛选自新疆库尔勒香梨园香梨蜜腺上，并经过本领域熟知公认的菌种系统分子水平鉴定及菌种的生理生化系统试验验证，证实获得的芽孢杆菌(bacillus)范畴内属于一种典型的新菌种，该菌种解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)c已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号：cgmccno.22859，保藏日期2021年07月09日。
9.上述解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)c的基因序列如seq id no:1、seq id no:2和seq id no:3所示。
10.本发明中，解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)c的分离纯化培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物6g，nacl 8g，琼脂17g，加蒸馏水至1.0l，ph值为7.0。
11.本发明中，解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)c的富集培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物6g，nacl 8g，加蒸馏水至1.0l，ph值为7.1。
12.同时，本发明提供一种新菌解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)c的生防菌剂，其制备方法具体包括如下步骤：将低温保存的解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)c在lb平板培养基上活化，挑取单菌落在lb斜面培养基上，于28℃培养箱培养3d，即得活化的解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)c；用无菌的接种环刮取一环活化的解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)c接种到lb液体培养基中，在28℃、摇床转速为220r/min的条件下震荡培养3d，6000rpm离心10min取上清，用0.22μm细菌过滤器过滤除菌，获得得解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)c种子液；将解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)c种子液，按照质量体积比为1％的接种量接入到lb液体培养基的三角瓶中进行摇瓶发酵，28℃，220r/min震荡培养3d，得解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)c发酵液；检测发酵液中菌体和芽孢数量，待发酵液中成熟芽孢占到芽孢和菌体总数的90％时停止发酵培养，根据需要制备获得解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)c生防菌剂。
13.本发明提供新菌解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)c生防菌剂在制备防治梨火疫病药物中的应用。
14.通过实施本发明提供的上述具体技术方案实施本发明内容，可以得到以下
15.有益效果：
16.(1)本发明提供一种新菌解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)c，经过本领域熟知公认的菌种系统分子水平鉴定及菌种的生理生化系统试验验证，证实获得的解淀粉芽孢杆菌范畴内菌种编号为c属于一种典型的新菌种，进而有必要进行按照法律要求的保藏。
17.(2)本发明从新疆库尔勒香梨园香梨蜜腺上分离得到的解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)c，抑菌活性具有广谱性；对水稻白叶枯病菌pxo 99的抑制效果最好，抑菌圈直径为43.33mm，对芦蒿软腐病菌pcb、梨火疫病菌和甜瓜角斑病菌的抑菌圈直径分别为6mm、9.83mm和9.97mm。
18.(3)本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)c生防菌剂，对葡萄座腔菌的抑菌率为71.3％，对草莓疫霉病菌和草莓疫霉病菌的抑菌率分别为26.05％和27.85％；将其应用于制备防治香梨火疫病菌的药物中，菌株浓度不超过5％，当蔗糖浓度超过25％，梨火疫病菌无法生长。对于梨火疫病菌病生物防治具有广泛的应用价值。
附图说明
19.图1为菌株c基于16s rdna序列构建系统发育树图。
20.图2为菌株c基于gyra基因序列构建系统发育树图。
21.图3为菌株c基于gyrb基因序列构建系统发育树图。
22.图4为菌株c的菌落形态图。
23.图5为菌株c梨火疫病菌对蔗糖浓度的耐受性图。
24.图6为菌株c和梨火疫病菌对蔗糖浓度的耐受性对比图。
25.图7为菌株c cgmcc no.22859的发酵液对不同病原细菌的拮抗作用图，其中，a：梨火疫病菌b：亚洲梨火疫病菌l2；c：水稻白叶枯病菌pxo99；d：土壤杆菌；e：烟草青枯病菌rs-sc2；f：番茄细菌性溃疡病菌；g：瓜类细菌性果斑病菌xjl12；h:泛菌dcss1；i：丁香假单胞番茄致病变种pst dc3000；j：梨锈水病菌js-5；k:甜瓜角斑病菌；l：芦蒿软腐病菌pcb。
26.图8为菌株c cgmcc no.22859的发酵液对不同病原真菌的拮抗作用图，其中，a：葡萄座腔菌；b：水稻纹枯病菌；c：茶拟盘多毛孢；d：扁桃拟茎点病菌yh-13；e：链格孢霉菌；f：瓜炭疽病菌；g：瓜蔓枯病菌；h：茎点霉；i：瓜枯萎病菌；j：草莓疫霉病菌。
27.图9为菌株c cgmcc no.22859对梨火疫病菌的抑制效果图，其中，a为在距离平板中心处分别等距离点接5μl菌液；b为在距离平板中心处等距离放置3个牛津杯，每个牛津杯中加入200μl无菌发酵液。
具体实施方式
28.下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。本发明中选用的所有原辅材料，以及选用的菌种培养方法都为本领域熟知选用的，本发明中涉及到的％都为重量百分比，除非特别指出除外。
29.解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)c的分离纯化培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物6g，nacl 8g，琼脂17g，加蒸馏水至1.0l，ph值为7.0。
30.解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)c的富集液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物6g，nacl 8g，加蒸馏水至1.0l，ph值为7.1。
31.实施例1：解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)c的分离、筛选及鉴定
32.(一)分离、纯化
33.香梨花2020年4月22日采自新疆库尔勒市阿瓦提农场香梨园，盛花期香梨园随机摘取50簇完全开放的香梨花簇，放入洁净的自封袋，立即冷链寄送实验室分离培养。用无菌
镊子夹住花柄，花瓣朝下，移液器吸取1毫升无菌水冲洗花外部，重复3次；用无菌剪刀先沿花萼顶部剪去花瓣、花丝和柱头，然后剪去花柄，只保留花萼部分；花萼部分用5毫升无菌水浸泡40min，间隔10min手工震荡一次约15s；吸取浸泡液100μl均匀涂布lb平板，25℃培养48h；观察lb平板上菌落特征，挑取表征类似芽孢杆菌的菌落，在lb平板上三区划线，挑选单菌落保存；利用梨火疫病菌作为靶标菌，筛选具有明显拮抗作用的菌株。
34.(二)分类、鉴定
35.解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)c(以下简称为“菌株c”)16sr rna、gyra和gyrb基因的序列测定与分析：
36.(1)pcr模板dna的提取
37.将菌株c接种于lb培养基中，转速180r/min，30℃震荡培养10h，离心收集菌体，采用新型植物基因组dna快速提取试剂盒进行基因组dna提取。
38.(2)pcr扩增
39.16sr dna的pcr扩增引物：
40.27f：5
’‑
agagtttgatcctggctcag-3’；
41.1492r：5
’‑
ggttaccttgttacgactt-3’。
42.gyra基因的pcr扩增引物：
43.gyra-f：5
’‑
cagtcaggaaatgcgtacgtcctt-3’；
44.gyra-r：5
’‑
caaggtaatgctccaggcattgct-3’。
45.gyrb基因的pcr扩增引物：
46.gyrb-f：5
’‑
gaagtcatcatgaccgttctgcaygcnggnggnaarttyga-3’47.gyrb-r：5
’‑
agcagggtacggatgtgcgagccrtcnacrtcngcrtcngtcat-3’48.反应体系：
49.组成体积/μl2
×
taqplusmastermixⅱ(dyeplus)12.510μm的正引物0.3 10μm的反引物0.310ng/μldna1ddh20补足
50.16s rdna基因pcr扩增条件为：预变性94℃，3min；变性94℃，30s；退火56℃，30s；延伸72℃，90s；30个循环；延伸72℃，5min，4℃保存；gyr a基因pcr扩增条件为：预变性94℃，3min；变性94℃，30s；退火56℃，30s；延伸72℃，60s；30个循环；延伸72℃，5min，4℃保存；gyr b基因pcr扩增条件为：预变性94℃，3min；变性94℃，30s；退火56℃，30s；延伸72℃，2min；30个循环；延伸72℃，5min，4℃保存。
51.(3)序列测定
52.pcr扩增产物经电泳检测和纯化后测序，对菌株c的16s rrna、gyra和gyrb序列进行测序，通过dnastar软件拼接得到其16s rrna、gyra和gyrb的部分有序序列，长度分别为1430bp、943bp和1122bp，其序列如seq id no:1、seq id no:2和seq id no:3所示，分别于gen bank进行blast同源序列检索，利用本领域常见采用的mega 5.0软件通过neighbor-joining方法建立系统进化树(重复抽样1000次)，结果见附图1-3。经比对分析发现，菌株c
的16sr rna基因序列与bacillus amyloliquefaciens cpo的同源性最高，相似性为99.93％，菌株c的gyra基因序列与bacillus amyloliquefaciens ima11(mk457749.1)的同源性最高，相似性为99.89％，菌株c的gyrb基因序列与bacillus amyloliquefaciens g10的同源性最高，相似性为99.91％；以16sr rna基因序列构建的系统发育树中，菌株c的16sr rna序列与bacillus amyloliquefaciens cpo(登录号为：om280101.1)的亲缘关系最近，置信度为99；菌株c的gyra序列与bacillus amyloliquefaciens ima11(mk457749.1)的亲缘关系最近，置信度为99；以gyrb基因序列构建的系统发育树中，菌株c的gyrb序列同样与bacillus amyloliquefaciens g10(登录号为：cp072612.1)的亲缘关系最近，置信度为100。仅使用16s rrna序列构建发育树，分枝自展值低，且无法确定菌株c的种名；单独使用gyra和gyrb构建系统发育树的结果与将16srrna、gyra与gyrb序列进行拼接后构建系统发育树结果一致，菌株c与解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)聚合在一枝，且置信度高，表明建树群中16s rrna的差异较小，不足以影响分类结构，菌株c可能为解淀粉芽孢杆菌。通过菌种的相似性和同源性的综合判定，经过本领域熟知公认的菌种系统分子水平鉴定，证实获得的芽孢杆菌(bacillus)属范畴内菌种编号为c属于一种典型的新菌种。
53.基于以上生物学特征，将上述菌株c鉴定为解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)分支中新菌种。该菌株已保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，保藏日期：2021年07月09日，保藏号为cgmcc no.22859。
54.(二)解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)cgmcc no.22859生理生化特性测定
55.1.菌株c的菌落形态特性
56.将-80℃保存的菌株c在lb固体平板上活化，28℃培养3d。用接种环挑取单菌落，用三区划线法在固体lb平板上划线，28℃培养3d后观察菌落形态，待菌落长满整个平板观察菌落特征记录并拍照保存，结果参见附图4所示。
57.由附图4结果可知，菌株c在lb固体平板上培养初期菌落表面光滑，边缘整齐，后期表面有褶皱，中间有凸起，边缘略不整齐，不透明。
58.基于以上生物学特征，将上述链霉菌c鉴定为芽孢杆菌属，解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)中新菌。该菌株已保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号：cgmcc no.22859，保藏日期为2021年07月09日。
59.2.菌株c的理化特性
60.将-80℃保存的菌株在lb固体平板上活化，28℃培养3d。挑取单菌落接种至lb培养基中，28℃过夜培养，将菌液的浓度调整为od
600
＝0.3，吸取10μl接种至5ml蔗糖浓度分别为1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％和40％的lb培养基中，28℃培养10h，以不含蔗糖的lb培养基为对照，测定菌液的od
600
值，具体结果参见附图5-6所示。
61.由附图5-6数据可知，低浓度蔗糖可以促进菌株c和梨火疫病菌的生长，随着蔗糖浓度的增加，菌株的生长会受到抑制；与对照相比，当蔗糖浓度不超过10％，添加蔗糖有助于菌株c的生长，且浓度为1％的蔗糖能显著促进菌株生长；浓度为10％的蔗糖对菌株c的生
长无显著影响；当蔗糖的浓度超过10％，会对菌株c的生长产生抑制作用，且随着蔗糖浓度的增加对菌株的抑制效果越强，蔗糖浓度超过35％，菌株c无法生长；与菌株c相比，梨火疫病菌对蔗糖浓度的变化更加敏感。菌株浓度低于5％，添加蔗糖可以促进梨火疫病菌的生长；蔗糖浓度超过10％会抑制梨火疫病菌的生长，当蔗糖浓度超过25％，梨火疫病菌无法生长。
62.通过对菌株c生理生化性质的测试，根据《芽孢杆菌属》和《微生物分类学》以及《常见细菌系统鉴定手册》，将菌株c鉴定为解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)新种。
63.综合16s rdna、gyra和gyrb基因序列和同源性对比分析以及生理化试验对比的结果，本发明提供的菌株c与常见的解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)同属范围内菌种具有鲜明的区别，具有解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)同属内新菌种的特性。
64.实施例3：解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)生防菌剂的制备
65.本实施例在实施例1-2的基础上，解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)生防菌剂的制备方法，具体包括如下步骤：将低温保存的解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)在lb平板培养基上活化，挑取单菌落在lb斜面培养基上，于28℃培养箱培养3d，即得活化的解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)；用无菌的接种环刮取一环活化的解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)接种到lb液体培养基中，在28℃、摇床转速为220r/min的条件下震荡培养3d，6000rpm离心10min取上清，用0.22μm细菌过滤器过滤除菌，获得得解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)种子液；将解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)种子液，按照质量体积比为1％的接种量接入到lb液体培养基的三角瓶中进行摇瓶发酵，28℃，220r/min震荡培养3d，得解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)发酵液；检测发酵液中菌体和芽孢数量，待发酵液中成熟芽孢占到芽孢和菌体总数的90％时停止发酵培养，根据需要制备获得解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)生防菌剂。
66.实施例3：解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)c微生物菌剂在梨火疫病菌防治中的应用
67.1.解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)c发酵液对不同病原细菌的拮抗试验
68.生防菌：菌株c；
69.病原细菌：梨火疫病菌、亚洲梨火疫病菌l2、水稻白叶枯病菌pxo99、土壤杆菌、烟草青枯病菌rs-sc2、番茄细菌性溃疡病菌、瓜类细菌性果斑病菌xjl12、泛菌dcss1、丁香假单胞番茄致病变种pst dc3000、梨锈水病菌js-5、甜瓜角斑病菌、芦蒿软腐病菌pcb；
70.病原真菌：葡萄座腔菌、水稻纹枯病菌、茶拟盘多毛孢、扁桃拟茎点病菌yh-13、链格孢霉菌、瓜炭疽病菌、瓜蔓枯病菌、茎点霉、瓜枯萎病菌、草莓疫霉病菌。
71.(1)菌株c发酵液对不同病原细菌的抑菌活性
72.采用牛津杯法测定菌株c cgmcc no.22859发酵液对病原真菌的抑制效果。将芽孢杆菌(菌株c cgmcc no.22859)接种到lb液体培养基中28℃、220r/min条件下培养3d，6000rpm离心10min取上清，用0.22μm细菌过滤器过滤除菌获得无菌发酵液。挑取病原细菌
单菌落于lb培养基中，28℃过夜培养，将菌液浓度调整至od
600
＝0.3，按照1％比例加到lb固体培养基中，制作含菌平板。培养基在在培养皿中凝固后，在距离培养皿中心处，等距离放置3个牛津杯，每个牛津杯中加入200μl无菌发酵液。以不加无菌发酵液的含菌平板为对照，28℃培养3d，测量抑菌圈直径，具体结果参见附图7和表1所示。
73.表1：菌株c发酵液对不同病原细菌的拮抗作用
74.病原细菌抑菌圈直径(mm)梨火疫病菌9.83
±
0.17亚洲梨火疫病菌l216.67
±
0.21水稻白叶枯病菌pxo9943.33
±
0.21土壤杆菌30.33
±
0.36烟草青枯病菌rs-sc224.33
±
0.21番茄细菌性溃疡病菌24.17
±
0.17瓜类细菌性果斑病菌xjl1222.50
±
0.22泛菌dcss121.17
±
0.31丁香假单胞番茄致病变种pstdc300015.33
±
0.33梨锈水病菌js-511.17
±
0.31甜瓜角斑病菌9.97
±
0.03芦蒿软腐病菌pcb6.00
±
0.00
75.由附图7和表1数据可知，28℃培养3d后，平板内的病原细菌的生长受到菌株c cgmcc no.22859发酵液的显著影响，平板上出现了明显的抑菌圈；由表1的数据统计可知，菌株c发酵液对供试的病原细菌均存在不同程度的抑制，其中，对水稻白叶枯病菌pxo 99的抑制效果最好，抑菌圈直径为43.33mm，对芦蒿软腐病菌pcb、梨火疫病菌和甜瓜角斑病菌的抑菌圈直径分别为6mm、9.83mm和9.97mm。
76.采用牛津杯法测定菌株c发酵液对病原真菌的抑制效果。将芽孢杆菌(菌株c gmcc no.22859)接种到lb液体培养基中28℃、220r/min条件下培养3d，6000rpm离心10min取上清，用0.22μm细菌过滤器过滤除菌获得无菌发酵液。用6mm打孔器沿病原菌菌落边缘打孔，将直径为6mm的菌碟转接到pda平板中央，在距离菌碟2.5cm处等距离放置3个牛津杯，每个牛津杯中加入200μl无菌发酵液。以只接种病原真菌的pda平板为对照，25℃培养3d，测量病原菌直径，计算抑菌率，具体结果参见附图8和表2所示。
[0077][0078]
表2：菌株c发酵液对不同病原真菌的拮抗作用
[0079]
病原真菌抑菌率(％)树木溃疡病病菌71.30
±
1.15水稻纹枯病病菌64.29
±
0.33茶轮斑病病菌57.69
±
0.67桃缢缩溃疡病病菌53.21
±
2.00链格孢马褂树叶斑病病菌47.57
±
0.00
瓜类炭疽病病菌46.43
±
1.15瓜蔓枯病病菌45.61
±
0.67瓜枯萎病病菌27.85
±
0.67
[0080]
由附图8及表2数据可知，菌株c发酵液可有效地抑制供试病原真菌的生长；其中，对树木溃疡病病菌的抑制效果最好，抑菌率为71.3％；同时也能显著抑制水稻纹枯病病菌、茶轮斑病病菌、桃缢缩溃疡病病菌、链格孢马褂树叶斑病病菌、瓜类炭疽病病菌和瓜蔓枯病病菌的生长，抑菌率分别为64.29％、57.69％、53.21％、47.57％、46.43％和45.61％；对瓜枯萎病菌的抑制效果相对较弱，抑菌率为27.85％；上述数据结果表明本发明提供的菌株c可以通过产生具有抑菌活性的次级代谢产物抑制病原菌真菌的生长，具有抑菌广谱性活性。
[0081]
(2)菌株c发酵液在制备梨火疫病菌防治药物中的应用
[0082]
将-80℃保存的梨火疫病菌在lb固体平板上活化，28℃培养3d。挑取单菌落接种至lb培养基中，28℃过夜培养，将菌液的浓度调整为od
600
＝0.3后稀释100倍，按照1％比例加到lb固体培养基中，制作含菌平板。培养基在在培养皿中凝固后，分别用点接菌液和牛津杯法测定菌株c及其发酵液对梨火疫病菌的抑制效果。28℃培养3d，测量抑菌圈直径，具体结果参见附图9和表3所示。
[0083]
表3：菌株c对梨火疫病菌的抑制效果
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由附图9及表3数据可知，在含菌平板上点接5μl菌株c菌液，28℃培养3d后，在平板上出现了明显的抑菌圈，抑菌圈直径为16.17mm；同时用牛津杯法测定了菌株c发酵液对梨火疫病菌的抑制效果，平板上产生了直径为24mm的抑菌圈，表明菌株c产生了具有抑菌效果的次生代谢物质，从而抑制了梨火疫病菌的生长。
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以上试验表明，本发明通过分离筛选自新疆库尔勒香梨园梨树花的解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)c，菌株c及其生防菌剂具有显著的梨火疫病菌生物防治能力，菌株c抑菌活性具有广谱性。对水稻白叶枯病菌pxo 99的抑制效果最好，抑菌圈直径为43.33mm，对芦蒿软腐病菌pcb、梨火疫病菌和甜瓜角斑病菌的抑菌圈直径分别为6mm、9.83mm和9.97mm；利用解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)c制备的生防菌剂，对树木溃疡病病菌的抑制效果最好，抑菌率为71.3％，同时也能显著抑制水稻纹枯病病菌、茶轮斑病病菌、桃缢缩溃疡病病菌、链格孢马褂树叶斑病病菌、瓜类炭疽病病菌和瓜蔓枯病病菌的生长；将其应用于制备防治香梨火疫病菌的药物中，菌株浓度不超过5％，添加蔗糖可以促进梨火疫病菌的生长；蔗糖浓度超过10％会抑制梨火疫病菌的生长，当蔗糖浓度超过25％，梨火疫病菌无法生长。对于梨火疫病菌病生物防治具有广泛的应用价值。
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上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所延伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

技术特征：
1.一株新菌解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)c，其特征在于，所述菌株解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)c属于芽孢杆菌属中新菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为cgmccno.22859。2.如权利要求1所述的一株新菌解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)c，其特征在于，所述菌株解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)c的基因序列如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：3所示。3.如权利要求1所述的新菌解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)c的生防菌剂，其特征在于，该生防菌剂的制备方法具体包括如下步骤：将低温保存的解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)c在lb平板培养基上活化，挑取单菌落在lb斜面培养基上，于28℃培养箱培养3d，即得活化的解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)c；用无菌的接种环刮取一环活化的解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)c接种到lb液体培养基中，在25℃、摇床转速为220r/min的条件下震荡培养3d，6000rpm离心10min取上清，用0.22μm细菌过滤器过滤除菌，获得得解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)c种子液；将解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)c种子液，按照质量体积比为1％的接种量接入到lb液体培养基的三角瓶中进行摇瓶发酵，25℃，220r/min震荡培养3d，得解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)c发酵液；检测发酵液中菌体和芽孢数量，待发酵液中成熟芽孢占到芽孢和菌体总数的90％时停止发酵培养，根据需要制备获得解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)c生防菌剂。4.如权利要求1所述新菌解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)c生防菌剂在制备防治梨火疫病药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)C生防菌剂及其应用，本发明从新疆库尔勒香梨园香梨蜜腺上分离得到的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)C，菌株C及其生防菌剂具有显著的梨火疫病菌生物防治能力，菌株C抑菌活性具有广谱性。对水稻白叶枯病菌的抑制效果最好，抑菌圈直径为43.33mm；利用其制备的生防菌剂，对树木溃疡病病菌的抑制效果最好，抑菌率为71.3％，同时也能显著抑制水稻纹枯病病菌、茶轮斑病病菌等病菌的生长；将其应用于制备防治香梨火疫病菌的药物中，菌株浓度不超过5％，添加蔗糖可以促进梨火疫病菌的生长；蔗糖浓度超过10％会抑制梨火疫病菌的生长，当蔗糖浓度超过25％，梨火疫病菌无法生长，对梨火疫病菌病生物防治具有应用价值。对梨火疫病菌病生物防治具有应用价值。对梨火疫病菌病生物防治具有应用价值。


技术研发人员：巴音克西克 王俊 高建诚 周先进 吴莉莉 侯宏 马建军 王京梁 胡白石 潘洪生 王强
受保护的技术使用者：巴州加木农业科技有限公司
技术研发日：2023.04.28
技术公布日：2023/7/25