一种以酰氯改性的氨基树脂为载体的固定化脂肪酶及其制备方法与应用

1.本发明属于生物化工与生物催化领域，具体涉及一种以酰氯改性的氨基树脂为载体的固定化脂肪酶及其制备方法与应用。


背景技术：

2.脂肪酶(e.c.3.1.1.3)是生物催化中最重要的酶类之一，它们在温和的反应条件下催化多种类型的反应，如水解、酯化、酯交换和氨解，具有高的化学、区域和立体选择性和特异性。因此，脂肪酶被广泛应用于多种行业，包括化学品、洗涤剂、食品、化妆品、制药、造纸工业和生物柴油生产。然而，它们的实际工业应用往往受到限制，游离脂肪酶对环境非常敏感，不稳定，在酸性、碱性、高温、有机溶剂等极端条件下很容易失活，同时游离酶与产物混合后难以分离回收，这将造成高额的生产成本。酶的固定化不仅可以有效地保持酶的催化活性和特异性，显著提高其操作稳定性、贮存和运输稳定性，而且允许其重复或连续使用，并易于从反应混合物中分离出来。
3.研究表明脂肪酶是一种界面酶，可以在不溶性亚基(油或脂肪)的液滴界面上发挥作用。该机制基于活性中心周围存在一个大的疏水囊，未催化时疏水囊被盖子覆盖呈“关闭”形式。起催化作用时，盖子移动，形成一个巨大的疏水口袋，将活性中心暴露在介质中，形成脂肪酶的“开放”形式。两种构象脂肪酶形式处于平衡状态，但在油滴存在的情况下，开放形式的脂肪酶吸附在油滴的疏水表面，使构象平衡向脂肪酶的开放形式转移，并允许油酯受到酶的攻击。故合适的表面亲疏水微环境对脂肪酶的催化活性发挥具有积极作用。
4.不同链长的酰氯具有不同的亲疏水性。因此，利用载体上的氨基与酰氯发生亲核取代反应，可以在载体上接枝不同链长的酰氯从而实现载体表面亲疏水性微环境的调控。该方法在不改变载体原有的孔道结构的基础上，得到了表面疏水的微环境与脂肪酶所需亲疏水性相匹配的载体，载体通过物理作用吸附脂肪酶，同时疏水界面的存在有利于脂肪酶活性位点的打开，可为酶分子提供一个稳定、适宜的催化微环境，在固定化后酶的催化活性和稳定性得以提高。但目前有关这方面的方法、技术均未见报道。
5.戊二醛(ga)是一种双醛功能团试剂，通过首尾两端的醛基与酶分子的游离氨基发生希夫碱反应，实现酶分子之间共价连接。戊二醛价格便宜，使用戊二醛交联虽然在一定程度上能提高固定化酶的稳定性，但是它的毒性较大，生物相容性差，在固定化过程中容易导致酶失去活性。京尼平(genipin)由栀子苷经β-葡萄糖苷酶水解后的形成，是一种优良的天然生物交联剂，在碱性环境下，京尼平受到-oh攻击开环形成单个醛基中间体，开环的京尼平单分子发生自聚合反应后形成稳定的长链结构，聚合物末端的醛基与酶分子的游离氨基发生希夫碱反应，形成一种可靠的交联网状结构。
6.1,3-甘油二酯(1,3-dag)作为食用油的一种次要成分，虽然在食品中的含量较低，但是在维持健康以及降低几种慢性病的风险因素方面具有非常大潜力或作用，能够抑制餐后高血脂症。与甘油三酯(tag)的结构不同，1,3-dag有不同于tag的代谢途径和营养特征，
当1,3-dag在小肠中消化时，形成1(3)单甘酯(1(3)-mag)而不是2-单甘酯(2-mag)。由于dag酰基转移酶和单甘酯(mag)酰基转移酶对1(3)-mag的亲和力较低，因此很难通过2-mag途径合成tag。因此，与摄入具有相同脂肪酸组成的tag相比，摄入1,3-dag，餐后血清中的tag含量维持在较低水平，1,3-dag不仅抑制了餐后tag的升高，还抑制了残余脂蛋白(rlp)的升高，可以增加餐后脂质氧化，从而减轻体重。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种以酰氯改性的氨基树脂为载体的固定化脂肪酶。
8.本发明还要解决的技术问题是提供上述以酰氯改性的氨基树脂为载体的固定化脂肪酶的制备方法。
9.本发明还要解决的技术问题是本提供上述以酰氯改性的氨基树脂为载体的固定化脂肪酶的应用。
10.为了解决上述第一个技术问题，本发明提供了一种以酰氯改性的氨基树脂为载体的固定化脂肪酶，将酰氯偶联在氨基树脂上，得到酰氯改性的氨基树脂；将脂肪酶通过物理相互作用吸附在所得酰氯改性的氨基树脂上，再通过交联剂使得脂肪酶分子间共价连接(图1)。
11.为了解决上述第二个技术问题，本发明提供了以酰氯改性的氨基树脂为载体的固定化脂肪酶的制备方法，包括以下步骤：
12.s1：将酰氯偶联在氨基树脂上，得到酰氯改性的氨基树脂；
13.s2：将脂肪酶通过物理相互作用吸附在所得酰氯改性的氨基树脂上；
14.s3：加入交联剂反应，即得。
15.在上述第一个技术方案和第二个技术方案中，相关技术特征参数如下：
16.(1)将酰氯偶联在氨基树脂上，得到酰氯改性的氨基树脂；通过在载体上接枝不同链长的酰氯，调节了载体的比表面能，实现载体表面亲疏水性微环境的调控，得到经酰氯改性的树脂载体。
17.具体为将有机溶剂、酰氯、碱和所述氨基树脂反应，即得；优选为先加入有机溶剂、酰氯，搅拌均匀后再加入碱，最后加入氨基树脂进行亲核取代反应；
18.其中，所述氨基树脂包括lx-1000ha氨基树脂，氨基含量0.8mmol/g。
19.其中，所述酰氯具有不同的碳链长度，例如己酰氯、辛酰氯、癸酰氯、十二酰氯、棕榈酰氯、硬脂酰氯(主链碳原子分别为6、8、10、12、16、18)；所述酰氯包括乙酰氯、丙酰氯、丁酰氯、戊酰氯、己酰氯、庚酰氯、辛酰氯、壬酰氯、癸酰氯、十二酰氯、棕榈酰氯、硬脂酰氯中的一种或多种物质，优选为癸酰氯、十二酰氯、棕榈酰氯、硬脂酰氯中的一种或多种物质，进一步优选为棕榈酰氯和/或硬脂酰氯，再进一步优选为棕榈酰氯。酰氯中的氯原子有吸电子效应，增强了碳的亲电性，使酰氯更容易受到亲核试剂的进攻，因此酰氯与氨基树脂上的氨基发生亲核酰基取代反应形成酰胺键。
20.其中，所述有机溶剂包括苯类化合物，优选为甲苯。
21.其中，所述氨基树脂先经饱和食盐水、1％-9％盐酸、0.5％-7.5％氢氧化钠溶液分别浸泡水洗至中性后再反应，优选为首先使用饱和食盐水，将树脂浸泡24h后放尽食盐水，再用大量去离子水反复冲洗树脂直至排出的水清澈、无杂质；接着用5％盐酸浸泡4h后放尽
酸液，用大量去离子水反复冲洗树脂直至排出水接近中性；然后用4％氢氧化钠溶液浸泡4h后放尽碱液，用大量去离子水反复冲洗树脂直至排出水接近中性，低温真空干燥待用。
22.其中，所述碱包括三乙胺。
23.其中，所述有机溶剂和酰氯的用量比为10ml:0.8-1.12mmol，优选为10ml:0.9-1.02mmol，进一步优选为10ml:0.96mmol。
24.其中，所述酰氯和碱的摩尔比为1:0.5-1.5，优选为1:0.9-1.3，进一步优选为1:1。
25.其中，所述氨基树脂的氨基含量与酰氯的摩尔比为1:0.6-2.5，优选为1:1-1.4，进一步优选为1:1.2。
26.其中，所述反应的温度为0-60℃，优选为25-45℃，进一步优选为30-40℃，更进一步优选为35℃。
27.其中，所述反应的时间为2-10h，优选为6h。
28.其中，所述反应结束后依次用n,n-二甲基甲酰胺、无水乙醇将树脂洗涤数遍，最后一次用无水乙醇洗涤，抽滤掉滤液，抽干后树脂于40℃真空干燥8h，即得。
29.(2)吸附固定化酶的制备：将脂肪酶通过物理相互作用吸附在所得酰氯改性的氨基树脂上具体为将脂肪酶溶液、酰氯改性的氨基树脂和缓冲液反应；
30.其中，所述脂肪酶包括米赫根毛霉脂肪酶(rml)。
31.其中，所述缓冲液为磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液，优选为0.1m ph 8.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液。
32.其中，所述酰氯改性的氨基树脂经异丙醇浸润后，经缓冲液清洗后再反应；优选地，所述缓冲液为磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液，优选为0.1m ph 8.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液。
33.其中，脂肪酶溶液、酰氯改性的氨基树脂和缓冲液的用量比为1-5ml:1g:20-30ml，优选为2-4ml:1g:23-27ml，进一步优选为3ml:1g:25ml。
34.其中，脂肪酶溶液的浓度为0.1mg/ml；对于每克干重的载体，脂肪酶溶液的用量为3ml。
35.其中，所述反应的温度为20-40℃，优选为25-35℃，进一步优选为30℃。
36.其中，所述反应的时间为4-12h，优选为6-10h，进一步优选为8h。
37.(3)加入交联剂反应；
38.其中，所述交联剂包括戊二醛和/或京尼平，优选为京尼平；
39.其中，所述交联剂在反应体系中的终浓度为0.05-0.25wt％，优选为0.05％-0.15wt％，进一步优选为0.1wt％。
40.其中，所述反应的温度为20-40℃，优选为25-35℃，进一步优选为30℃。
41.其中，所述反应的时间为0.5-3.5h，优选为1-3h，进一步优选为2h。
42.为了解决上述第三个技术问题，本发明公开了上述述固定化脂肪酶在制备1,3-甘油二酯中的应用。
43.其中，所述应用为催化油酸和甘油发生酯化反应制备1,3-甘油二酯中的应用。
44.其中，所述油酸和甘油的摩尔比为1.8-2.6:1，优选为2.2-2.6:1，进一步优选为2.4:1。
45.其中，所述固定化脂肪酶的质量为油酸和甘油总质量的5-11％，优选为7％-11％，
进一步优选为9％。
46.其中，所述酯化反应的温度为55-75℃，优选为60-70℃，进一步优选为65℃。
47.综上，本发明提供了一种精细化调控氨基树脂表面亲疏水微环境的方法和基于该改性树脂通过吸附-交联法制备固定化脂肪酶，以脂肪酶为目标酶，以氨基树脂为载体，利用酰氯与树脂上的氨基发生亲核取代反应形成酰胺键从而偶联在树脂上。通过在载体表面上接枝不同链长的酰氯，实现载体表面亲疏水性微环境的调控，从而在载体表面形成一种稳定、适宜的疏水性环境，获得一种表面环境相对疏水的功能性载体，即经酰氯改性的疏水氨基树脂载体。在固定化酶的过程中，利用脂肪酶在疏水界面的活化作用，使固定化脂肪酶的活性显著提高，再利用天然的天然生物交联剂京尼平，对脂肪酶分子之间进行共价连接。
48.有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优势：
49.(1)本发明所提供的固定化脂肪酶的酶活回收率较高，最终得到的固定化酶的酶活回收率为未改性树脂直接吸附固定化脂肪酶的近9倍。
50.(2)本发明所提供的固定化脂肪酶在催化油酸和甘油合成1,3-甘油二酯的应用中具有催化效率高、可重复利用性强等优点，在60min后1,3-甘油二酯的含量就达到最大值64％，在重复使用10次之后，1,3-甘油二酯的含量的仍保持初始值的89％左右，拥有优异的可重复利用性能。
51.(3)本发明所提供的固定化脂肪酶还具备良好的耐热性、操作稳定性、保存稳定性。
附图说明
52.图1是氨基树脂改性和固定化脂肪酶制备的过程示意图。
53.图2为使用不同碳链长度酰氯改性的树脂与水接触角关系曲线图。
54.图3为使用不同碳链长度酰氯改性的树脂固定化酶与酶活回收率/固定化效率关系曲线图。
55.图4固定化脂肪酶ha-rm、m-16-ha-rm-genipin，以及游离酶rml热稳定性的表征。
56.图5固定化脂肪酶ha-rm、m-16-ha-rm-genipin，以及游离酶rml ph稳定性的表征。
57.图6固定化脂肪酶ha-rm、m-16-ha-rm-genipin有机溶剂耐受性的表征。
58.图7固定化脂肪酶ha-rm、m-16-ha-rm-genipin，以及游离酶rml的储存稳定性的表征。
59.图8在最优催化条件下，固定化脂肪酶m-16-ha-rm-genipin催化油酸和甘油合成1,3-甘油二酯的可重复利用性的表征。
具体实施方式
60.根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
61.下述实施例中所述脂肪酶原液若无特殊说明，均为诺维信palatase 20000l(米赫根毛霉脂肪酶rml)。
62.实施例中酶活力检测方法如下：
63.酶活定义：以棕榈酸对硝基苯酯(p-npp)为底物，在40℃、ph 7.5的条件下，1min内水解产生1μmol对硝基苯酚所需的酶量定义为一个酶活力位(u)；酶活回收率：固定化酶的活性/等量游离酶活性
×
100％；固定化效率＝固定的酶量/固定化时加入的酶量
×
100％。
64.测定方法：量取0.3ml 3mg/ml p-npp的异丙醇溶液与2.7ml含1％wt曲拉通的ph 7.5缓冲液在反应管中混合，于40℃摇床预热5min后，再加入适量的固定化酶，200rpm/min振荡反应10min。待反应完成后，立即向反应管中加入5ml去离子水进行稀释，通过注射器及滤头过滤得到1ml经稀释的反应液，并立即放入冰浴中防止反应进一步进行，在410nm下测定吸光度。
65.实施例中1,3甘油二酯的检测方法如下：
66.反应开始后，每间隔一定时间，吸取10μl的混合液体，加入2ml的二氯甲烷震荡数次，待充分混合均匀后，用滤膜过滤，所得溶液即可使用液相打样检测。通过高效液相色谱-蒸发光散射检测器，分析混合液体的组成，包括产物和未反应完的油酸，根据油酸在甘油上的接入情况，产物可分为mag、1,3-dag、1,2-dag、tag。液相检测条件：柱温设置为30℃，蒸发光和雾化温度设置为60℃，氮气流速设置为1.7l/min，进样量设置为5μl，其他参数默认，乙腈-乙酸(乙酸占比为0.5％)和二氯甲烷作为流动相，流速分别为1ml/min和0.1ml/min。
67.实施例1：不同链长的酰氯改性的氨基树脂载体制备
68.树脂的预处理，具体操作为首先使用饱和食盐水，将树脂(lx-1000ha氨基树脂(氨基含量0.8mmol/g))浸泡24h后放尽食盐水，再用大量去离子水反复冲洗树脂直至排出的水清澈、无杂质；接着用5％盐酸浸泡4h后放尽酸液，用大量去离子水反复冲洗树脂直至排出水接近中性；然后用4％氢氧化钠溶液浸泡4h后放尽碱液，用大量去离子水反复冲洗树脂直至排出水接近中性，低温真空干燥待用。
69.在圆底烧瓶中依次加入10ml甲苯、0.96mmol改性剂(己酰氯、辛酰氯、癸酰氯、十二酰氯、棕榈酰氯、硬脂酰氯(主链碳原子分别为6、8、10、12、16、18))，待搅拌均匀后再加入1.06mmol三乙胺，最后加入1g上述待用的氨基树脂，然后35℃下引发亲核取代反应6h。
70.用n,n-二甲基甲酰胺、无水乙醇将树脂洗涤3遍，最后一次用无水乙醇洗涤，抽滤掉滤液，抽干后树脂于50℃真空干燥8h，即得所需的改性载体，改性前树脂命名为ha，改性后命名为m-x-ha(其中x为改性所用酰氯主链上所含的碳原子数)；链长不同的酰氯改性后树脂载体的水接触角测试如图2所示，经过接触角仪表征，改性后的树脂疏水性显著增强。
71.实施例2：氨基树脂吸附固定化脂肪酶(ha-rm)的制备
72.称取1g干燥的未经修饰的氨基树脂，先用异丙醇充分浸润，再用0.1m ph 8.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液清洗3遍，然后依次将上述清洗的未经修饰的氨基树脂、25ml磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液和3ml脂肪酶原液加入100ml的反应管中，30℃摇床振荡反应8h进行脂肪酶的固定化，待固定化完后通过砂芯管将酶液滤出，用磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液淋洗3遍，冷冻干燥后即可得ha-rm。
73.实施例3：酰氯改性树脂吸附-交联固定化脂肪酶(m-x-ha-rm-genipin，x＝6、8、10、12、16、18)的制备
74.将所获得的酰氯改性氨基树脂载体应用于脂肪酶的固定化中。称取实施例1中干燥的1g酰氯改性氨基树脂(m-x-ha)，先用异丙醇充分浸润，再用0.1m ph 8.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液清洗3遍，然后依次将上述清洗的改性树脂、25ml磷酸二氢钠-磷酸氢
二钠缓冲液和3ml脂肪酶原液加入100ml的反应管中，30℃摇床振荡反应8h，再加入京尼平(终浓度为0.1％wt)继续振荡反应2h，待固定化完后通过砂芯管将酶液滤出，用磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液淋洗3遍，冷冻干燥后即可得m-x-ha-rm-genipin(x＝6、8、10、12、16、18)。
75.实施例4：氨基树脂-脂肪酶(ha-rm)、酰氯改性氨基树脂-脂肪酶(m-x-ha-rm-genipin，x＝6、8、10、12、16、18)的活性的表征
76.分别取10mg的氨基树脂-脂肪酶(ha-rm)、酰氯改性氨基树脂-脂肪酶(m-x-ha-rm-genipin，x＝6、8、10、12、16、18)，按照具体实施方式中的酶活检测方法检测固定化脂肪酶的活性，具体为：加入装有0.3ml 3mg/ml p-npp的异丙醇溶液与2.7ml含1％wt曲拉通的ph 7.5缓冲液的反应管中混合，于40℃摇床预热5min后，再加入10mg固定化酶(ha-rm或m-x-ha-rm-genipin，x＝6、8、10、12、16、18)，200rpm/min振荡反应10min。待反应完成后，立即向反应管中加入5ml去离子水进行稀释，通过注射器及滤头过滤得到1ml经稀释的反应液，并立即放入冰浴中防止反应进一步进行，在410nm下测定吸光度。测试结果如图3所示，经酰氯疏水改性后的树脂吸附-交联固定化酶的活性明显增加，其中以棕榈酰氯改性的树脂吸附-交联固定化酶m-16-ha-rm-genipin的酶活回收率最高，达到176％，故后面实验均采用棕榈酰氯改性的树脂来吸附-交联固定化酶。
77.实施例5：固定化脂肪酶ha-rm、m-16-ha-rm-genipin，以及游离酶米赫根毛霉脂肪酶(rml)热稳定性的表征
78.参考实施例4的方法进行酶活检测。
79.将1ml游离酶与0.2g固定化酶分别在40-60℃(间隔5℃)水浴条件下放置2h后，参考实施例4的方式测定酶活。结果见图4。图4显示固定化脂肪酶ha-rm、m-16-ha-rm-genipin的随温度升高活性下降的速度远低于游离酶，其中m-16-ha-rm在60℃孵育2h后仍保留63％酶活，而ha-rm仅维持41％酶活，游离酶rm则几乎完全失去活性，说明经改性后的树脂固定化酶的热稳定性得以提高。
80.实施例6：固定化脂肪酶ha-rm、m-16-ha-rm-genipin，以及游离酶rml ph稳定性的表征
81.游离酶：利用ph(2.0-11.0)的缓冲液配置酶液，4℃保存2h；固定化脂肪酶：称取适量固定化酶，分别利用ph(2.0-11.0)的磷酸缓冲液浸泡2h后取出固定化酶，并参考实施例4的方式测定酶活。结果见图5。图5显示固定化脂肪酶m-16-ha-rm-genipin在ph 2.0-11.0的宽ph范围内中，酶活呈先升后降的趋势，酶活维持总体很稳定，即使在强酸强碱的环境中也仍保留70％以上酶活，ha-rm在强酸强碱的环境中表现更差仅为50％左右酶活，游离酶rml在强酸强碱的环境中活性损失巨大甚至完全失活，说明经改性后的树脂固定化酶的热稳定性得以提高。
82.实施例7：固定化脂肪酶ha-rm、m-16-ha-rm-genipin有机溶剂耐受性的表征
83.称取适量固定化酶，分别在水(water)、丙酮(acetone)、乙腈(acetonitrile)、甲苯(toluene)、乙醇(ethanol)中孵育2h后取出固定化酶，并参考实施例4的方式测定酶活。结果见图6。图6显示固定化脂肪酶m-16-ha-rm-genipin相比ha-rm在多种有机溶剂中的孵育稳定性更佳，其中在丙酮(acetone)、乙腈(acetonitrile)、甲苯(toluene)孵育2h仍维持70％以上酶活，这就为固定化脂肪酶在有机体系的应用提供了基础。
84.实施例8：固定化脂肪酶ha-rm、m-16-ha-rm-genipin，以及游离酶rml储存稳定性的表征
85.分别将固定化脂肪酶ha-rm、m-16-ha-rm-genipin，以及游离酶rml，保存于4℃，每隔一段时间测定一次酶活，酶活的测定方式参考实施例4。以第一天的酶活为100％。结果见图7。图7显示固定化脂肪酶m-16-ha-rm-genipin在4℃保存30d酶活仍然保留95％高于固定化脂肪酶ha-rm的91％和游离酶的87％。说明经酰氯改性后的树脂固定化酶的储存稳定性更强，有利于长期储存。
86.实施例9：固定化脂肪酶m-16-ha-rm-genipin可重复利用性的表征
87.在反应温度为65℃，油酸和甘油的摩尔比为2.4:1，加酶量为油酸和甘油总质量的9％的反应条件下，进行固定化脂肪酶m-16-ha-rm-genipin催化油酸和甘油合成1,3-甘油二酯的反应，首次反应60min后，所得反应物中1,3-甘油二酯的含量达到最大值为64％，mag、1,2-dag、tag的含量分别为23％、2％、11％。每次反应结束后，使用吸管将大部分油液吸出，再加入适量的正己烷溶解剩余的油液，离心分离得到固定化酶。然后重复上述操作10次，每次反应60min，以首次反应1,3-dag的含量为100％，分别计算各重复次数下1,3-dag的相对含量。结果见图8。图8显示m-16-ha-rm-genipin在重复使用10次时，1,3-甘油二酯的含量仍维持初始值的89％左右，表明固定化脂肪酶具有很高的可重复利用性。
88.综上，本发明以脂肪酶为目标酶，以氨基树脂为载体，通过载体上的氨基与酰氯发生亲核取代反应，可以在载体上接枝不同链长的酰氯从而实现载体表面亲疏水性微环境的调控，从而在载体表面形成一种稳定、适宜的疏水性环境，获得一种表面环境相对疏水的功能性载体；先通过物理吸附将脂肪酶结合于经改性的氨基树脂上，载体的疏水表面与脂肪酶相互作用，起到了界面活化的效果，再使用天然的生物交联剂京尼平进行交联，得到的固定化脂肪酶的酶活回收率达176％，是未改性树脂吸附固定化脂肪酶的近9倍。经酶学性质测定发现，与游离脂肪酶比较，本发明制得的固定化脂肪酶m-16-ha-rm-genipin在活性明显提升的同时，拥有更加优异的热稳定性、ph稳定性、有机溶剂耐受性和储存稳定性。将m-16-ha-rm-genipin应用于催化油酸和甘油合成1,3-甘油二酯，在60min后1,3-甘油二酯的含量就达到最大值64％，在重复使用10次之后，1,3-甘油二酯的含量的仍保持初始值的89％左右。这表明该方法制备的固定化酶具有高活性和高稳定性的特点，拥有极大的实际应用前景，同时为固定化脂肪酶开拓了新方向，具有及其重要的研究和实用价值。
89.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：
1.一种以酰氯改性的氨基树脂为载体的固定化脂肪酶，其特征在于，将酰氯偶联在氨基树脂上，得到酰氯改性的氨基树脂；将脂肪酶通过物理相互作用吸附在所得酰氯改性的氨基树脂上，再通过交联剂使得脂肪酶分子间共价连接。2.权利要求1所述以酰氯改性的氨基树脂为载体的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1：将酰氯偶联在氨基树脂上，得到酰氯改性的氨基树脂；s2：将脂肪酶通过物理相互作用吸附在所得酰氯改性的氨基树脂上；s3：加入交联剂反应，即得。3.根据权利要求1所述固定化脂肪酶或权利要求2所述方法，其特征在于，所述氨基树脂包括lx-1000ha氨基树脂，氨基含量0.8mmol/g；优选地，所述酰氯为乙酰氯、丙酰氯、丁酰氯、戊酰氯、己酰氯、庚酰氯、辛酰氯、壬酰氯、癸酰氯、十二酰氯、棕榈酰氯、硬脂酰氯中的一种或多种物质，优选为癸酰氯、十二酰氯、棕榈酰氯、硬脂酰氯中的一种或多种物质，进一步优选为棕榈酰氯和/或硬脂酰氯。4.根据权利要求1所述固定化脂肪酶或权利要求2所述方法，其特征在于，所述将酰氯偶联在氨基树脂上具体为将有机溶剂、酰氯、碱和所述氨基树脂反应，即得；优选地，所述有机溶剂包括苯类化合物，优选为甲苯；优选地，所述氨基树脂先经饱和食盐水、1％-9％盐酸、0.5％-7.5％氢氧化钠溶液分别浸泡水洗至中性后再反应；优选地，所述碱包括三乙胺。5.根据权利要求4所述固定化脂肪酶或方法，其特征在于，所述有机溶剂和酰氯的用量比为10ml:0.8-1.12mmol，优选为10ml:0.9-1.02mmol，进一步优选为10ml:0.96mmol；优选地，所述酰氯和碱的摩尔比为1:0.5-1.5，优选为1:0.9-1.3，进一步优选为1:1；优选地，所述氨基树脂的氨基含量与酰氯的摩尔比为1:0.6-2.5，优选为1:1-1.4，进一步优选为1:1.2；优选地，所述反应的温度为0-60℃，优选为25-45℃，进一步优选为30-40℃；优选地，所述反应的时间为2-10h。6.根据权利要求1所述固定化脂肪酶或权利要求2所述方法，其特征在于，所述将脂肪酶通过物理相互作用吸附在所得酰氯改性的氨基树脂上具体为将脂肪酶、酰氯改性的氨基树脂和缓冲液反应；优选地，所述脂肪酶包括米赫根毛霉脂肪酶；优选地，所述缓冲液为磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液，优选为0.1m ph 8.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液；优选地，所述酰氯改性的氨基树脂经异丙醇浸润后，经缓冲液清洗后再反应；优选地，所述缓冲液为磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液，优选为0.1m ph 8.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液。7.根据权利要求6所述固定化脂肪酶或方法，其特征在于，脂肪酶、酰氯改性的氨基树脂和缓冲液的用量比为1-5ml:1g:20-30ml，优选为2-4ml:1g:23-27ml，进一步优选为3ml:1g:25ml；优选地，所述反应的温度为20-40℃，优选为25-35℃，进一步优选为30℃；
优选地，所述反应的时间为4-12h，优选为6-10h，进一步优选为8h。8.根据权利要求1所述固定化脂肪酶或权利要求2所述方法，其特征在于，所述交联剂包括戊二醛和/或京尼平，优选为京尼平；优选地，所述交联剂的终浓度为0.05-0.25wt％，优选为0.05％-0.15wt％，进一步优选为0.1wt％。9.权利要求1所述固定化脂肪酶在制备1,3-甘油二酯中的应用；优选地，所述应用为催化油酸和甘油发生酯化反应制备1,3-甘油二酯中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述油酸和甘油的摩尔比为1.8-2.6:1，优选为2.2-2.6:1，进一步优选为2.4:1；优选地，所述固定化脂肪酶的质量为油酸和甘油总质量的5-11％，优选为7％-11％，进一步优选为9％；优选地，所述酯化反应的温度为55-75℃，优选为60-70℃，进一步优选为65℃。

技术总结
本发明提供了一种以酰氯改性的氨基树脂为载体的固定化脂肪酶及其制备方法与应用。所述固定化脂肪酶通过将酰氯偶联在氨基树脂上，得到酰氯改性的氨基树脂；将脂肪酶通过物理相互作用吸附在所得酰氯改性的氨基树脂上，再通过交联剂使得脂肪酶分子间共价连接。本发明所提供的固定化脂肪酶的酶活回收率较高，其还具备良好的耐热性、操作稳定性、保存稳定性等优势，在催化油酸和甘油合成1,3-甘油二酯的应用中具有催化效率高、可重复利用性强等优点。可重复利用性强等优点。可重复利用性强等优点。


技术研发人员：庄伟 刘鹏飞 白亚含 王志 饶远 刘金乐 应汉杰
受保护的技术使用者：郑州大学
技术研发日：2023.04.27
技术公布日：2023/7/25