采用微流控芯片与多重免疫荧光探针技术的基于SCLC分子分型的CTC的检测试剂盒及其鉴定方法与流程

采用微流控芯片与多重免疫荧光探针技术的基于sclc分子分型的ctc的检测试剂盒及其鉴定方法
【技术领域】
1.本发明涉及小细胞肺癌(sclc)分子分型的技术领域，特别是采用基于微流控芯片与多重免疫荧光探针技术的基于sclc分子分型的ctc(循环肿瘤细胞)的检测试剂盒及其鉴定方法的技术领域。


背景技术：

2.小细胞肺癌(sclc)是一种具有早期转移和不良预后的侵袭性神经内分泌肿瘤(byers and rudin,2015)，占所有肺癌类型的13-17％。由于sclc恶化程度高，早期易发生远处转移，确诊时多为晚期，预后极差。化疗和放疗是小细胞肺癌的目前最传统的治疗手段。近年来免疫治疗进展迅速，美国fda已经批准阿特珠单抗(atezolizumab)或度伐单抗(durvalumab)联合依托泊苷+铂类一线治疗广泛期小细胞肺癌，纳武单抗(nivolumab)
±
伊匹单抗(ipilimumab)和帕博利珠单抗(pembrolizumab)用于治疗既往接受过铂类为基础的化疗和至少一种其它疗法后疾病进展的小细胞肺癌。尽管在以铂为基础的一线化疗中增加了免疫治疗，但无进展生存期(pfs)和总生存期(os)在sclc患者中延长并不明显(chung et al.,2020；paz-ares et al.,2019)。20世纪70年代和80年代，sclc对铂类为基础的化疗方案的高反应性，包括完全缓解，导致人们相信sclc很快能够治愈。四十年后，由于固有的或最常见的获得性治疗耐药性，sclc患者的5年生存率仍保持在5％。小细胞肺癌的靶向药物治疗也有一些进展，譬如替莫唑胺(temozolomide)联合parp抑制剂奥拉帕尼(olaparib)治疗复发性小细胞肺癌，而安罗替尼在中国已被批准用于复发性小细胞肺癌的三线治疗。pharmamar公司的海鞘素衍生物lurbinectedin(rna聚合酶ⅱ抑制剂)基于二期研究结果，已提交上市申请，可用于复发性小细胞肺癌的二线治疗。但是，不同于非小细胞肺癌(nsclc)，其针对靶向治疗和免疫治疗的生物标记物选择显著改变了传统治疗模式(zimmermann et al.,2018)，小细胞肺癌的临床靶向治疗研究主要集中在未经选择的人群，研究结果普遍令人失望，自顺铂和依托泊苷问世以来一直没有重大进展。从放化疗敏感到化疗耐药、快速进展过程中，小细胞肺癌内在的驱动因素仍尚不清楚。所以，对sclc的分子分型以及亚型特征进行更清晰精准定义，以确定对靶向治疗和免疫治疗的精准选择与疗效评估，是目前急需解决的问题。
3.2019至2020年，众多研究者汇编了来自细胞系、患者来源的异种移植物(pdx)数据和小鼠转基因模型(gemms)数据并进行了全面sclc基因组研究，从而提出了基于mrna表达谱分化程序控制的异质性sclc分子亚型分类。即根据sclc中普遍存在的神经内分泌(ne)现象将sclc亚型分为神经内分泌(ne)和非神经内分泌(non-ne)型，增加了以前未曾发现的sclc非ne簇状细胞变体亚型，又补充了转录因子pou2f3定义的sclc亚型。此外，由于仍有许多患者不属于这三种亚型，人们又将转录因子yap1驱动的第四种亚型为这部分未分类肿瘤提供了部分解决方案。最近的共识建议将sclc分为五个亚型：ascl1高表达(sclc-a)、neurod1高表达(sclc-n)、ascl1与neurod1共表达(sclc-a/n)、pou2f3高表达(sclc-p)和
yap1高表达(sclc-i)。根据中国人群sclc的分子特征以及组织样本和细胞系表达谱关联分析，发现sclc不同的分子亚型对不同药物的敏感性差异。其中，sclc-a型占41％，对bcl-2抑制剂或parp抑制剂联合免疫检查点抑制剂敏感；sclc-n型占8％，对非间质和非上皮类的aurora激酶抑制剂敏感；sclc-a/n亚型占37％；sclc-p型占7％，对parp抑制剂和核苷类似物敏感；sclc-i型占7％，对免疫检查点抑制剂敏感。目前的临床实验研究正在探索不同的sclc分子亚型与免疫生物学的关系。sclc临床治疗面临的挑战是如何用最优的策略选择合适的标志物，从而精准识别获益人群，sclc分子亚型精准鉴定有助于为患者提供个性化的精准治疗方案。
4.sclc是一种侵袭性极高的疾病，现有的可选治疗方案的有限。虽然患者最初对治疗有反应，但很快就会复发。到目前为止，针对sclc还没有批准的靶向药物以及或指导治疗的生物标志物。替莫唑胺(temozolomide)在复发性sclc有一定的疗效。小细胞肺癌患者很少接受手术，通常可用的组织样本不足以进行生物标记物分析。大多数sclc患者(约70％)在诊断时即表现为广泛期sclc(es-sclc)，其余30％为局限期sclc(ls-sclc)。小细胞肺癌的预后很差，es-sclc患者的中位总生存期(os)为10个月，ls-sclc患者的中位总生存期可达4年。铂类化疗联合依托泊苷或伊立替康是sclc标准的一线治疗。最近，免疫检查点抑制剂(icis)单独或联合化疗被批准用于sclc的治疗。尽管大多数患者最初对化疗(单独或联合icis)有较高的疗效反应，但经常很快发生复发与转移，且预后不良。唯一经批准的二线药物拓扑替康具有较低的应答率和较短的生存期。与非小细胞肺癌(nsclc)和其他癌症类型不同，小细胞肺癌几乎没有其他治疗方式的选择，也没有针对性的靶向治疗方案选择可用于晚期患者的治疗。sclc高度侵袭性和缺乏有效积极治疗的现实，指出目前迫切需要针对性的生物标志物分析与鉴定，而这些标志物可以帮助sclc个体化治疗方案的选择与靶向药物的开发。
5.外周血中的非侵入性生物标记物，包括循环肿瘤细胞(ctc)或循环肿瘤dna(ctdna)，可以提供肿瘤的预后和/或预测信息、研究耐药机制和发现治疗新靶点。尽管ctdna检测是目前临床肿瘤早期辅助检测中比较常用的方法，但在sclc中大量研究仍然集中在ctc。循环肿瘤细胞(circulating tumor cell,ctc)是原发灶与转移灶肿瘤脱落并进入外周血循环系统的肿瘤细胞统称(每106
–
107个白细胞一个ctc)，是导致癌症发生与转移的主要原因。2021年版本的csco指南指出，ctc作为一种代表原发肿瘤的“液体活检样本”，可实时、动态性且无创性的对肿瘤患者病情进行监测。研究证实sclc细胞分裂周期短、增值快、易进入血液循环而发生远处转移，而ctc在sclc人群中的检出率为67～86％。检测ctc有助于正确判断疾病临床分期，以便选择合适的临床方案、指导sclc患者的个体化治疗、监测肿瘤复发与转移、判断治疗疗效及预测预后生存，同时也是分析耐药分子机制及解决肿瘤异质性的一种手段。以往的研究也表明，与nsclc患者相比，sclc患者的ctc数量相对较高，广泛期sclc(es-sclc)患者的ctc数量比局限期(ls-sclc)sclc患者相对较多。近几年，ctc分离方法的技术进步以及单个ctc分子表征研究的可能性，有助于评估ctc作为sclc疗效检测与监测疾病进展的生物标记物的潜在作用，以便研究肿瘤异质性和治疗的耐药机制。此外，ctc衍生异种移植物(cdx)模型的研究还可以为基因组分析和ctc计数提供了有关治疗敏感性/抗性机制的补充信息，在cdx活体内研究肿瘤异质性和耐药机制。
6.目前，市场现有的ctc检测方法主要有膜过滤法、免疫磁珠技术以及微流控芯片检
测法。其中，膜过滤法可利用细胞大小的区别以分离ctc，但往往过滤纯度低；免疫磁珠主要利用磁珠和抗体结合，再通过与ctc表面的抗原相结合来捕获细胞，通常会破坏细胞活性，无法进一步实现细胞培养等后续；采用cellsearch系统检测到的ctc数量(表达上皮型标志物epcam和细胞角蛋白ck8/18/19)在sclc中具有独立的预后意义。但是小细胞肺癌发病机制从sclc-a亚型至sclc-i亚型的演变是肿瘤细胞从上皮型向间质型emt的转化过程，所以单纯采用基于上皮型标志物epcam捕捉为基础的ctc检测鉴定方法，无法进行sclc五类分子亚型的精准分类与鉴定，从而也无法准确辅助临床医生为sclc患者提供精准的病理分类与制定个性化治疗策略。


技术实现要素：

7.本发明的目的就是解决现有技术中的问题，提出采用微流控芯片与多重免疫荧光探针技术的基于sclc分子分型的ctc的检测试剂盒及其鉴定方法。本技术采用sclc五个分子亚型鉴定的关键标志物荧光探针设计组合(sclc-a亚型，ascl1-alexa647与panck488；sclc-n亚型，neurod1-alexa647与myc-488；sclc-a/n亚型，ascl1-alexa647与neurod1-alexa647；sclc-p亚型，pou2f3-alexa647与avil-488；sclc-i亚型yap1-alexa647与csv-fitc或vim-488)，同时追加辅助于白细胞鉴定标记物cd45-pe，可针对同一患者平分成五份的外周血样本(1～2ml/份)进行基于微流控芯片富集的ctc多重免疫荧光探针组合鉴定与分析，能够无创、及早与灵敏动态的检测出患者所处的sclc分子亚型时期。本技术针对sclc的a、n、a/n、p与i的五个分子亚型特征分子标志物(ascl1、neurod1、pou2f3和yap1)，设计了高效微流控ctc富集芯片以及相应的ctc捕捉试剂与五种sclc分子亚型鉴定的多重免疫荧光探针组合，可利用现有的ctc检测系统平台，在国际上率先开发与临床治疗密切相关的sclc循环肿瘤细胞鉴定与检测试剂盒与方法，用于辅助临床sclc的分子分型鉴定，临床疗效预测、疾病复发预警以及临床药物筛选等，达到填补国内外的空白。
8.为实现上述目的，本发明提出了采用微流控芯片与多重免疫荧光探针技术的基于sclc分子分型的ctc的检测试剂盒，包括微流控芯片、生物素标记的捕捉剂、平衡盐溶液、组织细胞固定液、特异性杂交阻断液、活性核染液和稀释液，还包括由不同荧光素基团标记的sclc的亚型关键标志物、sclc相关marker检测抗体和白细胞辅助鉴定标记物或者由不同荧光素基团标记的sclc的亚型关键标志物和白细胞辅助鉴定标记物所构成的检测剂；
9.所述sclc的亚型关键标志物包括ascl1、neurod1、pou2f3和yap1中的至少一种；
10.所述sclc相关marker检测抗体包括panck、myc、avil、csv和vim中的至少一种。
11.作为优选，所述微流控芯片之中设有若干条带有呈双排人字形的鲱鱼骨结构的流段的分流泳道。
12.更进一步的，所述微流控芯片之中设有8条带有呈双排人字形鲱鱼骨结构的凹槽微流控阵列单元按特定角度错落有致串联的分流流道。
13.作为优选，所述分流泳道内依次偶联修饰硅烷剂、双功能交联剂和链霉亲和素。
14.作为优选，微流控芯片的制备方式为：
①
微流控流道pdms基片的制作：将等离子体清洗后的硅片上匀涂光刻胶，加热烘干之后依次进行曝光、加热和显影得到光刻胶纳米阵列，再以光刻胶纳米阵列为基础浇筑pdms胶，打孔割胶后进行等离子清洗，键合后得到pdms基片；
②
功能化探针负载的载玻片制作：在氧等离子体处理后的载玻片表面用3-氨基丙基
三乙氧基进行硅烷化处理，再依次分别结合双功能胺-巯基交联剂与链霉亲和素(sa)；
③
键合：将微流控流道pdms基片与功能化探针负载的功能化载玻片氧等离子处理后，进行四周非流道边缘区域的键合。
15.作为优选，所述生物素标记的捕捉剂按sclc分子分型分为sclc-a亚型捕捉剂、sclc-n亚型捕捉剂、sclc-a/n亚型捕捉剂、sclc-p亚型捕捉剂和sclc-i亚型捕捉剂；
16.所述sclc-a亚型捕捉剂为生物素化的上皮型肿瘤标志物epcam；
17.所述sclc-n亚型捕捉剂为生物素化的上皮型肿瘤标志物epcam与间质型肿瘤标志物波形蛋白csv或者为生物素化的上皮型肿瘤标志物epcam与间质型肿瘤标志物波形蛋白vim；
18.所述sclc-a/n亚型捕捉剂为生物素化的上皮型肿瘤标志物epcam与间质型肿瘤标志物波形蛋白csv或者为生物素化的上皮型肿瘤标志物epcam与间质型肿瘤标志物波形蛋白vim；
19.所述sclc-p亚型捕捉剂为生物素化的上皮型肿瘤标志物epcam与小细胞肺癌p亚型特征性标志物pou2f3；
20.所述sclc-i亚型捕捉剂为生物素化的间质型肿瘤标志物波形蛋白csv与小细胞肺癌i亚型高表达的肿瘤标志物受体酪氨酸激酶axl。
21.作为优选，所述平衡盐溶液为pbs缓冲液；所述组织细胞固定液为pfa固定液；所述特异性杂交阻断液为fc受体阻断液；所述活性核染液为hoechst33342dna荧光染液；所述稀释液为1
×
adb抗体稀释缓冲液。
22.作为优选，所述检测剂按鉴定物种类和sclc分子分型分为sclc-a亚型荧光探针检测剂、sclc-n亚型荧光探针检测剂、sclc-a/n亚型荧光探针检测剂、sclc-p亚型荧光探针检测剂、sclc-i亚型荧光探针检测剂和白细胞荧光探针检测剂；
23.所述sclc-a亚型荧光探针检测剂为ascl1一抗、alexa647荧光素标记的igg二抗和488荧光素标记的panck；
24.所述sclc-n亚型荧光探针检测剂为neurod1一抗、alexa647荧光素标记的igg二抗和488荧光素标记的myc；
25.所述sclc-a/n亚型荧光探针检测组为ascl1一抗、alexa647荧光素标记的igg二抗、neurod1一抗和alexa647荧光素标记的igg二抗；
26.所述sclc-p亚型荧光探针检测剂为pou2f3一抗、alexa647荧光素标记的igg二抗和488荧光素标记的avil；
27.所述sclc-i亚型荧光探针检测剂为yap1一抗、alexa647荧光素标记的igg二抗和fitc荧光素标记的csv或者为yap1一抗、alexa647荧光素标记的igg二抗和488荧光素标记的vim；
28.所述白细胞荧光探针检测剂为cd45-pe。
29.上述五组sclc分子亚型的标志物探针可针对同一患者平分成五份的外周血样本(1～2ml/份)同时进行多重免疫荧光探针组合鉴定。
30.针对sclc五个分子亚型一次性ctc富集分离与鉴定的生物素标记的捕捉剂组合与检测剂组合参考下表1：
[0031][0032][0033]
表1sclc五个分子亚型一次性ctc富集分离与鉴定的生物素标记的捕捉剂组合与检测剂组
[0034]
其中，多重免疫检测剂探针的荧光素标记特征各自标记了针对sclc分子亚型鉴定可相互区别的不同发射波长的荧光素：ascl1、neurod1、pou2f3与yap1均采用一抗与对应的alexa fluor 647红色荧光素标记的系列igg二抗；panck、myc、avil和csv(或vim)均采用了fitc(异硫氰酸)或488绿色荧光素标记；cd45采用了pe(藻红蛋白)橘色荧光素标记。本发明通过采用的不同荧光素标记的多重免疫荧光探针组合鉴定的sclc五个分子分型的ctc细胞，可以通过荧光显微镜在不同的滤光片下可以完全区分开。
[0035]
采用微流控芯片与多重免疫荧光探针技术的基于sclc分子分型的ctc的检测试剂盒的鉴定方法，包括如下步骤：
[0036]
a)微流控芯片的生物素标记的捕捉剂的包被与封闭：将生物素标记的捕捉剂经平衡盐溶液稀释后从芯片入口注入分流泳道内并进行孵育，在利用平衡盐溶液清洗微流控芯片后注入组织细胞固定液并进行固定，再在利用平衡盐溶液清洗微流控芯片后注入经稀释液稀释过的特异性杂交阻断液并进行孵育；
[0037]
b)sclc患者的外周血单核细胞pbmc分离：抽取sclc患者的血液并采用人外周血淋巴细胞分离液进行密度梯度离心法分离出sclc患者的外周血单核细胞pbmc；
[0038]
c)ctc细胞的微流控芯片的富集捕获：将sclc患者的外周血单核细胞pbmc注入微流控芯片内以富集捕获ctc细胞；
[0039]
d)ctc细胞的多重荧光免疫原位探针杂交：将检测剂中除alexa647荧光素标记系列igg二抗以外的试剂经稀释后注入微流控芯片内并进行孵育，再在利用平衡盐溶液清洗微流控芯片后加入经稀释液稀释过的alexa647荧光素标记的igg二抗并进行孵育；
[0040]
e)ctc细胞的活性核染色：在利用平衡盐溶液清洗微流控芯片后注入经稀释剂稀
释过的活性核染液并进行孵育；
[0041]
f)ctc细胞的扫描与判读分析：采用四色通道自动化荧光扫描系统对ctc细胞进行扫描、鉴定与分析。
[0042]
作为优选，在步骤a)中，所述生物素标记的捕捉剂稀释50～100倍并于室温下孵育0.5～2h；所述组织细胞固定液在室温下的固定时间为5～15min；所述特异性杂交阻断液稀释200～400倍并于室温下孵育10～30min。
[0043]
作为优选，在步骤d)中，所述检测剂稀释50～200倍并于室温下孵化0.5～1.5h。
[0044]
作为优选，在步骤e)中，所述活性核染液在室温下的孵育时间为5～15min。
[0045]
本发明的有益效果：
[0046]
1)本发明设计与开发了一种基于凹槽人字形双排鲱鱼骨结构的微流控矩阵ctc富集芯片，该几何结构设计有效增强了ctc表面抗原与捕捉剂接触的几率，并进一步通过调整微流体流速与剪切力方向与大小，在保持患者血液样本用量少的情况下(0.2～1ml)，实现了高效与特异性ctc富集，不但极大提高了患者外周血、脑脊液、胸腹腔脊液以及尿液等体液中的ctc细胞的捕捉效率，保持了富集的ctc细胞形态的完整性，同时又降低了白细胞(wbc)截留，极大提高了该微流控芯片ctc富集的纯度。
[0047]
2)本发明通过对微流控芯片内腔的基底层依次进行硅烷化、双功能蛋白交联剂、链霉亲和素(sa)偶联修饰以及生物素化的抗体捕捉剂包被，实现了基于链霉亲和素与生物素级联信号放大反应的ctc免疫富集，相比于其他微流控芯片而言，极大提高了患者外周血以及其他体液的ctc富集捕捉效率。
[0048]
3)本发明通过针对sclc分子分型(a、n、a/n、p与i亚型)，设计了五个sclc亚型分型的ctc生物素标记的多重捕捉剂组合(sclc-a亚型捕捉剂、sclc-n亚型捕捉剂、sclc-a/n亚型捕捉剂、sclc-p亚型捕捉剂与sclc-i亚型捕捉剂)，能够一次性高效特异性富集捕捉到sclc患者血液样本与胸腔脊液中所有分子亚型的ctc细胞。
[0049]
4)本发明通过针对sclc分子分型(a、n、a/n、p与i亚型)，设计了针对sclc五个分子亚型鉴定的特征性标志物的多重荧光探针组合(sclc-a亚型荧光探针检测剂、sclc-n亚型荧光探针检测剂、sclc-a/n亚型荧光探针检测剂、sclc-p亚型荧光探针检测剂以及sclc-i亚型荧光探针检测剂)，能够一次性无创、及早与灵敏动态的检测出患者所处的sclc分子亚型时期，从而在国际上率先开发与临床治疗密切相关的sclc循环肿瘤细胞鉴定与检测试剂盒与方法，用于辅助临床sclc的分子分型鉴定，临床疗效预测、疾病复发预警、以及临床药物筛选等，达到填补国内外的空白。
[0050]
5)本发明通过基于微流控芯片与多重免疫荧光探针技术的sclc分子分型的循环肿瘤细胞的鉴别与检测方法，可比临床影像学fdg-pet/ct和pet/mri以及核标记影像学pet/ct更早发现与确诊sclc及其分子分型，也避免了肿瘤患者组织ihc检测的对取样要求较高(必须以肿瘤组织进行ihc检测鉴定)、存在一定主观性与异质性、受检测抗体质量和检测过程(固定和染色)等因素影响而导致的各中心的检测准确率高低不一的局限性，从而能够辅助临床医生及早介入肿瘤患者的用药指导与个体化精准治疗方案制定，也能精准的对术后复发转移期的肿瘤患者进行无创的辅助动态疗效监测与预后评估。
[0051]
本发明的特征及优点将通过实施例结合附图进行详细说明。
【附图说明】
[0052]
图1是实施例一中五个采用微流控技术的基于sclc分子分型的循环肿瘤细胞的鉴别与检测试剂盒的鉴定结果；
[0053]
图2是实施例一的微流控芯片的微流控设计概图；
[0054]
图3是实施例一的微流控芯片的进出口结构设计图；
[0055]
图4是实施例一的微流控芯片的分流泳道的呈双人字形的鲱鱼骨结构的流段的放大示意图；
[0056]
图5是实施例二中质控细胞mcf7梯度稀释的ctc微流控芯片捕捉率图。
【具体实施方式】
[0057]
参阅下表2，取五个采用微流控芯片与多重免疫荧光探针技术的基于sclc分子分型的ctc的检测试剂盒并分别进行鉴定，具体操作步骤如下：
[0058]
a)微流控芯片的生物素标记的捕捉剂的包被与封闭：
①
分别取表2中的生物素标记的捕捉剂，加入pbs缓冲液至60μl体系，再在混匀后从芯片入口注入微流控芯片的分流泳道内并室温孵育1.5h；
②
采用100μl的pbs缓冲液分别清洗微流控芯片两次；
③
采用100ul的2％的pfa固定液室温固定10min；
④
采用100μl的pbs缓冲液分别清洗微流控芯片两次；
⑤
取12μl的fc受体阻断液，加入48μl的1
×
adb抗体稀释缓冲液，再在混匀后注入微流控芯片内并室温孵育20min；
[0059]
b)sclc患者的外周血单核细胞pbmc分离：抽取sclc患者的血液并采用人外周血淋巴细胞分离液进行密度梯度离心法分离出sclc患者的外周血单核细胞pbmc；
[0060]
c)ctc细胞的微流控芯片的富集捕获：将sclc患者的外周血单核细胞pbmc注入微流控芯片内以富集捕获ctc细胞；
[0061]
d)ctc细胞的荧光免疫原位杂交：
①
分别取表2中对应类型和用量的检测剂，加入1
×
adb抗体稀释缓冲液至60μl体系，再在混匀后注入微流控芯片内并室温孵育1h；
②
采用100μl的pbs缓冲液分别清洗微流控芯片两次；
③
取荧光探针(各种检测抗体和sclc分子的亚型关键标志物分别采用不同荧光素进行标记)，加入1
×
adb抗体稀释缓冲液至60μl体系，再在混匀后注入微流控芯片内并室温孵育1h；
[0062]
e)ctc细胞的活性核染色：
①
采用100μl的pbs缓冲液分别清洗微流控芯片两次；
②
采用200μl的30μg/ml的hoechst 33342dna荧光染液孵育10min；
[0063]
f)ctc细胞的扫描与判读分析：采用四色通道自动化荧光扫描系统对ctc细胞进行扫描、鉴定与分析。
[0064]
其中，微流控芯片的制备方法包括以下步骤：
[0065]
a)pdms纳米衬底的制备：在经等离子清洗过的硅片上匀涂su-8光刻胶，依次经前烘、紫外曝光、后烘和显影得到光刻胶纳米阵列，以光刻胶纳米阵列为基础先后浇筑两次pdms胶，再在打孔割胶(形状参阅图2～4)后进行等离子清洗，得到pdms纳米衬底；
[0066]
b)制备功能化基团修饰玻片：在经氧等离子体处理后的载玻片表面用3-羟丙基三甲氧基硅烷(3-mpts)进行硅烷化处理，依次结合马来酰亚胺-peg2-生物素、链霉亲和素(sa)和生物素化单克隆抗体，得到功能化基团修饰玻片；
[0067]
c)组合：将pdms纳米衬底与功能化基团修饰玻片相键合。
[0068][0069][0070]
表2五个采用微流控技术的基于sclc分子分型的循环肿瘤细胞的鉴别与检测试剂盒的主要参数
[0071]
此外，五个采用微流控技术的基于sclc分子分型的循环肿瘤细胞的鉴别与检测试剂盒所针对的细胞系和作用如下表3所示：
[0072]
sclc亚型分类细胞系名称作用sclc-adms153人sclc-a阳性检测质控品sclc-nncih524人sclc-n阳性检测质控品sclc-a/ncorl279人sclc-a/n阳性检测质控品sclc-pncih526人sclc-p阳性检测质控品sclc-isw1271人sclc-i阳性检测质控品
[0073]
表3五个采用微流控技术的基于sclc分子分型的循环肿瘤细胞的鉴别与检测试剂盒所针对的细胞系和作用
[0074]
五个采用微流控芯片与多重免疫荧光探针技术的基于sclc分子分型的ctc的检测试剂盒的鉴定结果如图1所示。此外，采用所制备的微流控芯片对质控细胞mcf7进行捕捉测试，而测试结果如图5所示。
[0075]
上述实施例是对本发明的说明，不是对本发明的限定，任何对本发明简单变换后的方案均属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.采用微流控芯片与多重免疫荧光探针技术的基于sclc分子分型的ctc的检测试剂盒，其特征在于：包括微流控芯片、生物素标记的捕捉剂、平衡盐溶液、组织细胞固定液、特异性杂交阻断液、活性核染液和稀释液，还包括由不同荧光素基团标记的sclc的亚型关键标志物、sclc相关marker检测抗体和白细胞辅助鉴定标记物或者由不同荧光素基团标记的sclc的亚型关键标志物和白细胞辅助鉴定标记物所构成的检测剂；所述sclc的亚型关键标志物包括ascl1、neurod1、pou2f3和yap1中的至少一种；所述sclc相关marker检测抗体包括panck、myc、avil、csv和vim中的至少一种。2.权利要求1所述的采用微流控芯片与多重免疫荧光探针技术的基于sclc分子分型的ctc的检测试剂盒，其特征在于：所述微流控芯片之中设有若干条带有呈双排人字形的鲱鱼骨结构的流段的分流泳道。3.权利要求2所述的采用微流控芯片与多重免疫荧光探针技术的基于sclc分子分型的ctc的检测试剂盒，其特征在于：所述分流泳道内依次偶联修饰硅烷剂、双功能交联剂和链霉亲和素。4.权利要求1所述的采用微流控芯片与多重免疫荧光探针技术的基于sclc分子分型的ctc的检测试剂盒，其特征在于：所述生物素标记的捕捉剂按sclc分子分型分为sclc-a亚型捕捉剂、sclc-n亚型捕捉剂、sclc-a/n亚型捕捉剂、sclc-p亚型捕捉剂和sclc-i亚型捕捉剂；所述sclc-a亚型捕捉剂为生物素化的上皮型肿瘤标志物epcam；所述sclc-n亚型捕捉剂为生物素化的上皮型肿瘤标志物epcam与间质型肿瘤标志物波形蛋白csv或者为生物素化的上皮型肿瘤标志物epcam与间质型肿瘤标志物波形蛋白vim；所述sclc-a/n亚型捕捉剂为生物素化的上皮型肿瘤标志物epcam与间质型肿瘤标志物波形蛋白csv或者为生物素化的上皮型肿瘤标志物epcam与间质型肿瘤标志物波形蛋白vim；所述sclc-p亚型捕捉剂为生物素化的上皮型肿瘤标志物epcam与小细胞肺癌p亚型特征性标志物pou2f3；所述sclc-i亚型捕捉剂为生物素化的间质型肿瘤标志物波形蛋白csv与小细胞肺癌i亚型高表达的肿瘤标志物受体酪氨酸激酶axl。5.权利要求1所述的采用微流控芯片与多重免疫荧光探针技术的基于sclc分子分型的ctc的检测试剂盒，其特征在于：所述平衡盐溶液为pbs缓冲液；所述组织细胞固定液为pfa固定液；所述特异性杂交阻断液为fc受体阻断液；所述活性核染液为hoechst 33342dna荧光染液；所述稀释液为1
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adb抗体稀释缓冲液。6.权利要求1所述的采用微流控芯片与多重免疫荧光探针技术的基于sclc分子分型的ctc的检测试剂盒，其特征在于：所述检测剂按鉴定物种类和sclc分子分型分为sclc-a亚型荧光探针检测剂、sclc-n亚型荧光探针检测剂、sclc-a/n亚型荧光探针检测剂、sclc-p亚型荧光探针检测剂、sclc-i亚型荧光探针检测剂和白细胞荧光探针检测剂；
所述sclc-a亚型荧光探针检测剂为ascl1一抗、alexa647荧光素标记的igg二抗和488荧光素标记的panck；所述sclc-n亚型荧光探针检测剂为neurod1一抗、alexa647荧光素标记的igg二抗和488荧光素标记的myc；所述sclc-a/n亚型荧光探针检测组为ascl1一抗、alexa647荧光素标记的igg二抗、neurod1一抗和alexa647荧光素标记的igg二抗；所述sclc-p亚型荧光探针检测剂为pou2f3一抗、alexa647荧光素标记的igg二抗和488荧光素标记的avil；所述sclc-i亚型荧光探针检测剂为yap1一抗、alexa647荧光素标记的igg二抗和fitc荧光素标记的csv或者为yap1一抗、alexa647荧光素标记的igg二抗和488荧光素标记的vim；所述白细胞荧光探针检测剂为cd45-pe。7.采用如权利要求6所述的采用微流控芯片与多重免疫荧光探针技术的基于sclc分子分型的ctc的检测试剂盒的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：a)微流控芯片的生物素标记的捕捉剂的包被与封闭：将生物素标记的捕捉剂经平衡盐溶液稀释后从芯片入口注入分流泳道内并进行孵育，在利用平衡盐溶液清洗微流控芯片后注入组织细胞固定液并进行固定，再在利用平衡盐溶液清洗微流控芯片后注入经稀释液稀释过的特异性杂交阻断液并进行孵育；b)sclc患者的外周血单核细胞pbmc分离：抽取sclc患者的血液并采用人外周血淋巴细胞分离液进行密度梯度离心法分离出sclc患者的外周血单核细胞pbmc；c)ctc细胞的微流控芯片的富集捕获：将sclc患者的外周血单核细胞pbmc注入微流控芯片内以富集捕获ctc细胞；d)ctc细胞的多重荧光免疫原位探针杂交：将检测剂中除alexa647荧光素标记系列igg二抗以外的试剂经稀释后注入微流控芯片内并进行孵育，再在利用平衡盐溶液清洗微流控芯片后加入经稀释液稀释过的alexa647荧光素标记的igg二抗并进行孵育；e)ctc细胞的活性核染色：在利用平衡盐溶液清洗微流控芯片后注入经稀释剂稀释过的活性核染液并进行孵育；f)ctc细胞的扫描与判读分析：采用四色通道自动化荧光扫描系统对ctc细胞进行扫描、鉴定与分析。8.如权利要求7所述的采用微流控芯片与多重免疫荧光探针技术的基于sclc分子分型的ctc的检测试剂盒的鉴定方法，其特征在于：在步骤a)中，所述生物素标记的捕捉剂稀释50～100倍并于室温下孵育0.5～2h；所述组织细胞固定液在室温下的固定时间为5～15min；所述特异性杂交阻断液稀释200～400倍并于室温下孵育10～30min。9.如权利要求7所述的采用微流控芯片与多重免疫荧光探针技术的基于sclc分子分型的ctc的检测试剂盒的鉴定方法，其特征在于：在步骤d)中，所述检测剂稀释50～200倍并于室温下孵化0.5～1.5h。10.如权利要求7所述的采用微流控芯片与多重免疫荧光探针技术的基于sclc分子分型的ctc的检测试剂盒的鉴定方法，其特征在于：在步骤e)中，所述活性核染液在室温下的孵育时间为5～15min。

技术总结
本发明公开了采用微流控芯片与多重免疫荧光探针技术的基于SCLC分子分型的CTC的检测试剂盒及其鉴定方法，包括微流控芯片、生物素标记的捕捉剂、平衡盐溶液、组织细胞固定液、特异性杂交阻断液、活性核染液和稀释液，还包括由不同荧光素基团标记的SCLC的亚型关键标志物、SCLC相关marker检测抗体和白细胞辅助鉴定标记物或者由不同荧光素基团标记的SCLC的亚型关键标志物和白细胞辅助鉴定标记物所构成的检测剂。本申请能够无创、及早与灵敏地检测分析患者外周血中CTC所涉及的ASCL1、NEUROD1、POU2F3和YAP1四种免疫标志物表达，适合用于肿瘤早筛，还能进行泛癌的免疫用药指导以及免疫疗效监测与预后评估。疗效监测与预后评估。疗效监测与预后评估。


技术研发人员：张开山 于杰 田华
受保护的技术使用者：杭州华得森生物技术有限公司
技术研发日：2023.04.27
技术公布日：2023/7/25