一种纯化沙漠小球藻的方法与流程

1.本发明涉及沙漠微藻纯化领域，具体为一种纯化沙漠小球藻的方法。


背景技术：

2.微藻在自然界分布广泛并且种类繁多，一般在采集过来的各种样品中多种微藻混合存在，同时还有原生动物和菌类，所以必须先将单个藻细胞分离纯化出来，获得单细胞克隆，才能够保存和培养，进行深入研究。因此如何快速、高效的从沙土样品中获得单克隆藻种是微藻培养和应用的基础和关键环节。
3.众所周知，小球藻是食品，药品，饲料领域中已经大量开发利用的藻种，具有重要的经济作用。而沙漠小球藻是来自于沙漠，沙漠所特有的干旱、高温，强紫外辐射等极端环境让沙漠小球藻拥有更特殊的遗传特征以及潜在的生物活性。因此，沙漠小球藻的漠藻分离、纯化对于沙漠藻开发利用具有重要的意义。在藻种大量培养过程中，细菌，真菌等微生物是影响藻种生长繁殖的主要的限制因素之一。
4.目前，沙漠小球藻纯方法有各种各样，但是这些用方法进行纯化沙漠小球藻成功率很低，而且后期还会出现微生物污染。物理涂布、划线是获得纯培养物的经典方法，所获得的藻株虽然比较纯，不过会有细菌的污染，因为有些细菌会附在藻细胞表面或者在细胞的胶质鞘内，很难去除，还有些藻类运动能力强，在固体培养基上运动，沾连杂菌等情况。化学方法纯化藻种主要是指利用抗生素无菌化，微藻对抗生素的耐受力大于杂菌，选择性地使用一种或多种抗生素进无菌处理则较容易获得无菌藻系。


技术实现要素：

5.鉴于现有技术中所存在的问题，本发明公开了一种纯化沙漠小球藻的方法，采用的技术方案是，包括以下步骤：步骤1，采集沙漠土壤样品；步骤2，激活沙漠土壤样品中藻细胞，得藻液；步骤3，观察藻液中的沙漠藻细胞；步骤4，分离沙漠小球藻，得藻悬浮液；步骤5，纯化沙漠小球藻；步骤6，对沙漠小球藻进行无菌检测。
6.作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤1中，用无藻铲采集沙样表层及其以下至10cm深，收集于无菌密封袋。每次采样后用75％酒精擦拭采样工具，以防交叉污染。
7.作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤2中，在实验室称取100g采集的沙样置于灭菌的装有300ml培养液的500ml激活容器，充分混匀，置于光照培养架，光照强度为5000lux，光暗周期为14h/10h，温度为30℃的条件下培养15天，随时观察杂菌污染情况。
8.作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤3中，显微镜观察时用微量加样枪吸取10ul,滴加至酒精消毒处理并干燥洁净的载玻片上；轻轻盖上盖玻片，吸水纸诱吸至均匀无
气泡；20x或40x放大倍数下观察并记录。
9.作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤4中，采用平板法稀释法与划线法分离上述混合培养的藻液，分离过程中定期镜检培养藻液，直到观察的微藻形态一致即分离成功，得藻悬浮液。
10.作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤5中，将氨苄青霉素和卡那霉素过滤除菌后添加到灭菌的固体培养基平板，制作抗生素平板，然后将欲分离的藻悬浮液涂布到抗生素平板上，在30℃、5000lux光照下培养15天获得纯的藻种，若肉眼观察无细菌污染则纯化完成。
11.氨苄青霉素是通过抑制细菌细胞壁合成来起到杀菌作用，它可以抑制革兰氏阳性菌也可以抑制革兰氏阴性菌，因此科用氨苄青霉素来抑制沙漠藻混合液中的各种细菌。卡那霉素对于大肠杆菌、变形杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等大多数革兰氏阴性菌具有强大的抑制作用。实验结果显示结合使用氨苄青霉素和卡那霉素更好地表现出抗菌作用，能够快速，有效的达到沙漠小球藻纯化目的，而且对于藻种生长无副作用。
12.作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤6中，将待检测的藻液用无菌移液器吸取50～100μl涂布到lb培养基平板，37℃下培养48h，若未长出细菌，真菌或其他微生物则可判定该藻种为纯种。
13.本发明的有益效果：本发明通过对沙漠土壤样品进行采集、激活后，经观察，对其进行分离和纯化，纯化过程中，使用氨苄青霉素和卡那霉素制作抗生素平板，并在抗生素平板上进行藻种培养，克服了物理涂布、划线过程中细菌污染的问题，达到了获得较纯藻种的同时抑制细菌滋生的效果，从而获得了无菌藻系，且操作简便，能够快速，大批量，有效纯化沙漠小球藻，纯化过程中无需用复杂的检测仪器，纯化时间快，从而为沙漠微藻开发利用和大规模培养提供优良藻种。
附图说明
14.图1为本发明样品1a1分别添加卡那霉素、氨苄青霉素、混合抗生素以及未添加抗生素的对照组平板上藻种与细菌生长情况对照图；
15.图2为本发明样品1a2分别添加卡那霉素、氨苄青霉素、混合抗生素以及未添加抗生素的对照组平板上藻种与细菌生长情况对照图；
16.图3为本发明样品1a5分别添加卡那霉素、氨苄青霉素、混合抗生素以及未添加抗生素的对照组平板上藻种与细菌生长情况对照图；
17.图4为本发明样品3a5分别添加卡那霉素、氨苄青霉素、混合抗生素以及未添加抗生素的对照组平板上藻种与细菌生长情况对照图。
具体实施方式
18.实施例1
19.本发明公开了一种纯化沙漠小球藻的方法，采用的技术方案是，包括以下步骤：
20.步骤1，选取10份采自塔克拉玛干沙漠土壤样品，编号1-10，对样品用20目筛子处理，除去样品中杂物。
21.步骤2，配制激活液，灭菌放凉，在超净工作台中称取1-10号样品各100g分别加入
10个已灭菌的激活容器，然后每个激活容器加入300ml激活液放到培养架进行激活，培养架光照强度调到5000lux(光暗比是14:10)，温度30℃，培养15天，每天早中晚各通气一小时，对样品进行激活。
22.步骤3，肉眼观察激活液出现绿色斑点或团状物后，记录激活容器编号和激活液颜色等情况。吸取2ml激活液于35mm
×
35mm的塑料培养皿中，将培养皿置于倒置显微镜载物台上，观察样品确定视野中藻细胞的位置，分别用20
×
、40
×
物镜观察藻细胞的形态特征，藻细胞种类。
23.步骤4，激活液沙漠藻分离与纯化，用消毒过的小型喷雾器将藻激活液喷射到固体平板培养基上，盖好培养皿盖，在光照5000lux条件下培养，培养温度为30℃，待长出藻落后，用接种环先挑取不同的藻落制片，在显微镜下观察藻落并记录其特征。挑选单藻落，多次划线平板培养，通过外形观察，确定分离藻为纯藻为止。藻类生长培养基中除了藻细胞还会长出细菌，真菌、地衣、苔藓等微生物，继续进行划线纯化，直至只有藻细胞生长。
24.步骤5，抗生素制备，氨苄青霉素(ampicillin)(100mg/ml)溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10ml；卡那霉素(kanamycin)(10mg/ml)溶解100mg卡那霉素于足量的水中，最后定容至10ml。
25.培养基的制备：bg 11培养基各成分(nano
3 1.5g/l、k2hpo3·
3h2o0.04g/l、mgso4·
7h2o 0.075g/l、caci2·
2h2o 0.036g/l、柠檬酸铁铵0.006g/l、柠檬酸0.006g/l、edtana
2 0.001g/l、na2co30.02 g/l,、h3bo
3 2.86g/l、mnci4·
4h2o 1.81g/l、znso4·
7h2o 0.222g/l、na2moo4·
2h2o 0.39g/l、cuso4·
5h2o 0.079g/l、co(no3)2·
6h2o 0.049g/l)溶解于纯净水中，充分溶解后调ph值，加入琼脂粉再进行高压灭菌(121℃，15～20min)。
26.添加抗生素：待培养基冷却至60℃左右时将已配备好的卡那霉素(25ug/ml)和氨苄青霉素(10ug/ml)添加到培养基。
27.将待纯化的藻细胞接种到添加抗生素的固体培养基平板和未添加抗生素的对照组，光照培养一周，肉眼观察未见细菌菌落视为初步纯化成功。
28.步骤6，初步纯化好的藻种用无菌移液器吸取50μl接种于lb培养基(胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、氯化钠10g/l)中，置于培养箱(37℃)培养48h观察是否有细菌等微生物生长，未见细菌生长视为该藻种纯化成功。
29.分别添加卡那霉素、氨苄青霉素、卡那霉素和氨苄青霉素混合抗生素以及未添加抗生素的对照组的5株小球藻进行对比培养试验，结果如图1至图4以及表1所示表1.添加抗生素和未添加情况下藻种和细菌生长情况
注：表里“+”表示存活，“－”表示死亡
30.平板上小球藻和细菌生长情况结果显示，添加卡那霉素和氨苄青霉素混合抗生素的平板上未见细菌菌落，而小球藻正常生长，说明卡那霉素和氨苄青霉素混合抗生素在满足小球藻正常生长的同时能够有效抑制细菌菌落生长。
31.上述虽然对本发明的具体实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施例，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化，而不具备创造性劳动的修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

技术特征：
1.一种纯化沙漠小球藻的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，采集沙漠土壤样品；步骤2，激活沙漠土壤样品中藻细胞，得藻液；步骤3，观察藻液中的沙漠藻细胞；步骤4，分离沙漠小球藻，得藻悬浮液；步骤5，纯化沙漠小球藻；步骤6，对沙漠小球藻进行无菌检测。2.根据权利要求1所述的一种纯化沙漠小球藻的方法，其特征在于：所述步骤1中，使用无藻铲采集，且每次采样后对无藻铲进行消毒处理。3.根据权利要求1所述的一种纯化沙漠小球藻的方法，其特征在于：所述步骤2中，将所述步骤1中采集的沙漠土壤样品置于装有培养液的激活容器中并充分混匀，将混匀后的激活容器置于光照培养架上光照培养，光照强度为5000lux，光暗周期为14h/10h，温度为30℃的条件下培养15天，随时观察杂菌污染情况。4.根据权利要求1所述的一种纯化沙漠小球藻的方法，其特征在于：所述步骤3中，制作观察样本，并使用20x或40x放大倍数的显微镜观察。5.根据权利要求1所述的一种纯化沙漠小球藻的方法，其特征在于：所述步骤4中使用平板法稀释法与划线法分离藻液，分离过程中定期镜检，直至微藻形态一致，得藻悬浮液。6.根据权利要求1或5所述的一种纯化沙漠小球藻的方法，其特征在于：所述步骤5中，制作抗生素平板，并将所述步骤4中得到的藻悬浮液涂布到抗生素平板上，并进行培养，若无细菌污染则纯化完成。7.根据权利要求6所述的一种纯化沙漠小球藻的方法，其特征在于：所述抗生素平板使用氨苄青霉素和卡那霉素过滤除菌后添加到灭菌的固体培养基平板制作。8.根据权利要求1所述的一种纯化沙漠小球藻的方法，其特征在于：所述步骤6中，将待检测的藻液取样后涂布到lb培养基平板，37℃下培养48h，若未长出其他微生物则可判定该藻种为纯种。

技术总结
本发明公开了一种纯化沙漠小球藻的方法，涉及沙漠微藻纯化技术领域，旨在提供一种快速，高效、纯化沙漠小球藻，采用的技术方案是将采集的的沙漠土壤样品利用沙漠藻细胞激活液进行激活，利用稀释涂布、划线平板法分离得到不同种类的沙漠藻细胞，进行镜检，观察沙漠藻细胞形态，进行光照培养，然后将培养好的不同种类的沙漠藻小球藻涂布于添加抗生素的固体培养基平板常规培养，并观察微生物生长情况，最终进行细菌污染检测，没长出细菌等微生物属于纯培养物。该方法中沙漠小球藻纯化过程简单，高效，可以快速，批量纯化沙漠小球藻种，纯化过程中无需用复杂的检测仪器，纯化时间快，可大大提高了纯化沙漠小球藻筛查实验效率。可大大提高了纯化沙漠小球藻筛查实验效率。可大大提高了纯化沙漠小球藻筛查实验效率。


技术研发人员：艾萨江
受保护的技术使用者：新疆金正生物科技有限公司
技术研发日：2023.04.26
技术公布日：2023/7/25