一种具有结肠癌细胞生长抑制作用的植物乳杆菌及其应用

1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株对结肠癌细胞和多种肠道致病菌具有较强抑制作用的植物乳杆菌，特别涉及功能性乳酸菌及其制品生产开发领域。


背景技术：

2.植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)广泛存在于植物、发酵食品、人和动物类肠道等多种环境中，它以其将糖类发酵为乳酸的能力和健康益处而闻名。特别是，植物乳杆菌已被研究证明具有通过调节肠道菌群平衡和减少炎症来改善肠道健康的能力。它还被发现在食品保藏和发酵以及益生菌和其他功能性食品的生产中具有潜在应用价值。
3.植物乳杆菌可以通过抑制有害细菌的生长和增加有益菌的数量，来调节肠道菌群平衡；可以通过减少肠道炎症、促进肠道黏膜健康和增强免疫功能等方式，改善肠道健康状况；可以降低人体中的胆固醇水平，有助于预防心血管疾病等疾病。因此，植物乳杆菌能够对人体健康产生多种益处，具有很大的开发应用价值。但是，目前的植物乳杆菌并不具备治疗结肠癌的作用，因此，开发具有抑制结肠癌细胞生长的植物乳杆菌具有很大价值。
4.酸菜富含多种营养成分，包括维生素c、膳食纤维、乳酸菌等，具有调节肠道菌群、促进食欲、助消化等作用，有助于增强人体免疫力、维护肠道健康。因此，酸菜是一种营养丰富、美味可口的传统特色食品，深受人们喜爱。经我们研究分析，贵州酸菜中益生菌种类十分丰富，特别是植物乳杆菌最为丰富，为我们分离筛选综合益生性能好的植物乳杆菌创造了条件。


技术实现要素：

5.针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种具有结肠癌细胞生长抑制作用的植物乳杆菌及其应用，该植物乳杆菌具有结肠癌细胞生长抑制作用、抑菌抗炎作用、产酸降糖作用和提高人体肠道环境适应性的作用。
6.为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
7.一种植物乳杆菌gz1806，于2023年02月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏编号为cgmcc no:26590，分类命名为植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)。
8.上述的植物乳杆菌gz1806在制备抗结肠癌药物或抗结肠癌辅助药物中的应用。
9.上述的植物乳杆菌gz1806在非疾病治疗目的的抑制大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、空肠弯曲杆菌、大肠弯曲杆菌、单增李斯特菌、溶血性葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌或小肠结肠炎耶尔氏菌中的应用。
10.上述的植物乳杆菌gz1806在制备治疗大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、空肠弯曲杆菌、大肠弯曲杆菌、单增李斯特菌、溶血性葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌或小肠结肠炎耶尔氏菌导致疾病的药物中的应用。
11.上述的植物乳杆菌gz1806在制备降血糖或抗氧化功能药物中的应用。
12.上述的植物乳杆菌gz1806在调节人或动物肠道菌群的功能性食品中的应用。
13.一种抗结肠癌药物或抗结肠癌辅助药物，包括上述的植物乳杆菌gz1806。
14.一种降血糖药物，包括上述的植物乳杆菌gz1806。
15.一种抗氧化药物，包括上述的植物乳杆菌gz1806。
16.一种功能性食品，包括上述的植物乳杆菌gz1806。
17.本发明的植物乳杆菌gz1806是从贵州省黎平县德凤镇采集的酸辣泡椒中分离筛选获得。植物乳杆菌gz1806在mrs琼脂培养基上生长良好，菌落为乳白色，表面光滑，边缘整齐，不透明，对菌体形态进行镜检，革兰氏染色呈紫色，杆状。通过采用细菌通用引物16s rrna的27f/1492r对其基因组总dna为模板进行pcr扩增，得到由1000个碱基对(bp)组成的目的基因序列，序列如下：gcgcagtgcggggtgctataatgcaagtcgaacgaactctggtattgattggtgcttgcatcatgatttacatttgagtgagtggcgaactgaatgagtaacacgtgggaaacctgcccagaagcgggggataacacctggaaacagatgctaataccgcataacaacttggaccgcatggtccgagtttgaaagatggcttcggctatcacttttggatggtcccgcggcgtattagctagatggtggggtaacggctcaccatggcaatgatacgtagccgacctgagagggtaatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatggacgaaagtctgatggagcaacgccgcgtgagtgaagaagggtttcggctcgtaaaactctgttgttaaagaagaacatatctgagagtaactgttcaggtattgacggtatttaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggatttattgggcgtaaagcgagcgcaggcggttttttaagtctgatgtgaaagccttcggctcaaccgaagaagtgcatcggaaactgggaaacttgagtgcagaagaggacagtggaactccatgtgtagcggtgaaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggctgtctggtctgtaactgacgctgaggctcgaaaagtatgggtagcaaacaggattagataccctggtagtccatacccgtaaacgatgaatgctaagtgttggagggtttccgcccttcagtgctgcagctaacgcattaagcattccgcctggggagtacggccgcaaggctgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggttatttcgaatctacgcgaagaaccttaacagatcttgacattctatgcaat
18.将测序得到的基因序列输入ncbi数据库进行比对，其与genbank中的标准菌株lactobacillus plantarumstrain 103b3相似率达98.80％，可初步鉴定该菌株为植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)。
19.本发明的植物乳杆菌gz1806菌株安全性好，在哥伦比亚血平板上不产生溶血现象，对多种常见类型的抗生素敏感，不携带抗生素抗性基因；
20.本发明的植物乳杆菌gz1806菌株肠道适应能力强，对酸、胆盐、人工胃液、人工肠液有较好的耐受能力；
21.本发明的植物乳杆菌gz1806菌株益生性能明显，对人结肠癌细胞有较强黏附能力，其发酵上清液与结肠癌细胞hct-116共培后表现出较强的癌细胞活性抑制能力，对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、空肠弯曲杆菌和大肠弯曲杆菌等具有较强的抑制能力，能产生乙酸、丁酸等多种短链脂肪酸，对α-葡萄糖苷酶具有较强的抑制作用，抗氧化作用较强。
22.本发明所产生的有益效果为：
23.1、本发明提供的植物乳杆菌gz1806分离筛选自贵州酸菜，在mrs琼脂培养基上生长良好，对酸和胆盐有较好的耐受能力。
24.2、本发明提供的植物乳杆菌gz1806对人结肠癌细胞黏附能力好，并具有较强的癌
细胞活性抑制能力。
25.3、本发明提供的植物乳杆菌gz1806对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、空肠弯曲杆菌、大肠弯曲杆菌、单增李斯特菌、溶血性葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌、小肠结肠炎耶尔氏菌等常见肠道病原细菌抑菌能力较强。
26.4、本发明提供的植物乳杆菌gz1806能产生乙酸、丁酸等多种短链脂肪酸，对α-葡萄糖苷酶具有较强的抑制作用，抗氧化作用较强。
附图说明
27.图1为本发明植物乳杆菌gz1806与其它菌株的系统进化关系图；
28.图2为本发明植物乳杆菌gz1806菌株在mrs琼脂培养基上的菌落形态图(a)和革兰氏染色图(b)；
29.图3为mtt法测定细胞活性的标准曲线图；
30.图4为本发明植物乳杆菌gz1806发酵上清液不同浓度下对结肠癌细胞生长的抑制作用；
31.图5为本发明植物乳杆菌gz1806菌株的溶血活性实验；
32.图6为本发明植物乳杆菌gz1806发酵上清液短链脂肪酸gc-ms检测离子流图。
具体实施方式
33.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
34.因此，以下对提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
35.需要说明的是，术语“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个
……”
限定的要素，并不排除在包括要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
36.下面结合实施例和附图对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
37.实施例1植物乳杆菌gz1806的分离、筛选及分子生物学鉴定：
38.1.材料准备
39.酸辣泡椒采自贵州省黎平县德凤镇；
40.16s rdna通用引物27f和1492r通用引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，序列如下：
41.27f：5-agagtttgatcmtggctcag-3，1492r：5-ggttaccttgttacgactt-3
42.mrs肉汤培养基的配方(每升)：酪蛋白酶消化物10.0g，牛肉膏粉10.0g，酵母膏粉
4.0g，柠檬酸三铵2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，磷酸氢二钾2.0g，葡萄糖20.0g，吐温-80，最终ph为5.7左右。
43.mrs琼脂培养基的配方(每升)：蛋白胨10.0g，牛肉膏粉5.0g，酵母膏粉4.0g，葡萄糖20.0g，吐温80 1.0ml，磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸三铵2.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，琼脂15.0g，最终ph为6.2左右。
44.2.具体方式
45.取2g发酵食品样品于20mlmrs肉汤中，充分振荡混匀，置于37℃恒温摇床培养24h。采用10倍梯度稀释，涂布接种于mrs琼脂培养基，37℃培养24h后挑取单菌落，连续单菌落纯化3次。将纯化后的菌株接种于600μl mrs肉汤培养基中，37℃摇床培养18h，加入400μl浓度50％(v/v)无菌甘油，于-80℃超低温冰箱中冻存备用。纯化之后的菌株，用mrs肉汤进行扩培后，采用天根细菌基因组dna提取试剂盒提取菌株dna，16s rrna扩增采用菌落pcr技术完成，pcr产物测序由生工生物工程(上海)有限公司完成，将序列与ncbi中blast进行比对，共获得植物乳杆菌181株，其中一株与标准菌株lactobacillus plantarumstrain 103b3相似率达99.60％，可初步鉴定该菌株为植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)，命名为gz1806，该菌株与其它菌株的系统发育关系如附图1。采用试剂盒法对植物乳杆菌gz1806进行革兰氏染色，在显微镜下观察并记录染色后的细菌形态。植物乳杆菌gz1806在mrs琼脂培养基上生长良好，菌落形态乳白色、圆形凸起、边缘平整、表面光滑，如图2所示。镜检可见菌体呈杆状、紫色，符合植物乳杆菌的形态特征。将该菌株于2023年2月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmcc 26590。
46.实施例2植物乳杆菌gz1806发酵液对结肠癌细胞的生长抑制作用
47.2.1、植物乳杆菌gz1806对人结肠癌细胞的粘附性
48.将植物乳杆菌gz1806冻存菌种复苏培养后接种于mrs肉汤培养基中，37℃恒温培养24h。培养完毕后置于-4℃、5000r/min条件下离心10min，并用无菌pbs缓冲液多次洗涤。调整菌悬液浓度至1
×
106cfu/ml后备用。复苏人结肠癌细胞ht-29，将其接种至六孔细胞培养皿，添加dmem完全培养基并置于37℃、5％ co2中培养，两天更换一次培养液。当细胞贴壁状态达80％时，使用0.25％胰酶-edta进行消化，并传代培养。培养完毕后用细胞血球计数板对其进行计数，并将细胞浓度调整至5
×
106个/ml。将1ml细胞悬浮液加至六孔细胞培养皿的其中一培养孔中，置于培养箱中培养。待培养板中的细胞长至单层，弃掉dmem培养液，用无菌pbs将每孔冲洗3次。将1ml已制备好的菌悬液加入细胞孔，轻微晃动细胞培养板，吸取孔中少量菌液用于平板计数，其结果作为菌悬液中的初始活菌数。将细胞板置于37℃孵育2h，弃去培养基并用无菌pbs缓冲液洗涤3次。使用0.7ml 0.25％胰蛋白酶-edta消化细胞10min，待细胞完全脱落后加入0.3ml dmem培养液终止消化，收集黏附实验结束后的培养液进行平板计数，其结果作为黏附活菌数。并用标准菌株lgg作为对照。
49.粘附率(％)＝结束期乳酸菌数目/初始乳酸菌接种数目
×
100％
50.结果见表1。结果可知，植物乳杆菌gz1806对人结肠癌细胞ht-29的粘附率为18.83％。
51.表1植物乳杆菌gz1806对人结肠癌细胞ht-29的粘附率(％)
52.菌株重复1重复2重复3均值
gz180618.0619.6318.7918.83
±
0.68标准菌株lgg15.1316.4215.1415.56
±
0.94
53.2.2植物乳杆菌gz1806发酵上清液对结肠癌细胞的生长抑制作用
54.植物乳杆菌gz1806发酵上清液制备：将植物乳杆菌gz1806复苏后接种于mrs肉汤培养基中，37℃恒温培养24h，使菌悬液浓度至1
×
109cfu/ml。培养完毕后置于-4℃、5000r/min条件下离心10min，收集发酵上清液，用细菌滤膜过滤后备用。
55.癌细胞复苏：在15ml离心管中准备好预热的含有10％fbs和1％双抗的dmem培养基，置于无菌操作台上，从-80℃冰箱或液氮中拿出冻存的人结肠癌细胞(hct116)37℃水浴锅中快速解冻。待细胞解冻后，将其于无菌操作台上转移到准备好的含有培养基的15ml离心管中，1000r/min离心3min重悬细胞，吸到6cm的细胞培养皿中，在5％ co2培养箱中37℃培养24h后，更换新鲜的培养基。
56.细胞传代：待细胞生长状态良好，且密度达到80％左右时进行传代。将培养基和无菌的pbs在37℃水浴锅中预热之后置于无菌操作台上吸掉细胞培养皿中旧的培养基用预热的pbs洗细胞以除去死细胞和残留的培养基，再用0.25％的胰酶消化细胞，待细胞变成圆形之后用移液枪吸掉胰酶，培养基终止消化，将细胞收集到无菌的离心管中。1000r/min离心3min吸掉上清，用新鲜的培养基重悬细胞后将其吸到新的细胞培养皿中，置于细胞培养箱中培养。
57.mtt法测定细胞活性：本研究采用《碧云天mtt细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒》检测不同浓度的植物乳杆菌gz1806发酵上清液对人结肠癌细胞生长的影响。mtt细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(mtt cell proliferation and cytotoxicity assay kit)是一种非常经典的细胞增殖和细胞毒性检测试剂盒，被广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的检测。mtt可以被活细胞线粒体内的一些脱氢酶还原生成结晶状的深紫色产物甲臜(formazan)沉积于细胞中，而死细胞则无此现象。二甲基亚砜(dmso)能溶解细胞中的甲臜，用酶标仪在570nm波长测定吸光度。细胞增殖越多越快，则吸光度越高，细胞毒性越大，则吸光度越低，其标准曲线如图3。
58.用5ml mtt溶剂溶解25mg mtt，配制成5mg/ml的mtt溶液。每培养孔加入100μl约2000个复苏培养好的人结肠癌细胞，并分别加入1μl、0.75μl、0.5μl和0.25μl植物乳杆菌gz1806发酵上清液，每个浓度三次重复，并设置空白对照，在5％co2培养箱中37℃培养120小时。然后在每培养孔加入10μlmtt溶液，在细胞培养箱内继续孵育4h后，每孔加入100μl formazan溶解液，适当混匀，在细胞培养箱内再继续孵育4h，在普通光学显微镜下可以观察到formazan全部溶解，用酶标仪570nm波长测定吸光度。
59.测定结果如表2所示。植物乳杆菌gz1806不同浓度发酵上清液对人结肠癌细胞的生长表现出明显的抑制作用，当加入1％的发酵上清液时效果最为明显，对细胞生长的抑制效果随着上清液浓度降低而减弱，当浓度降低到0.25％时，抑制效果大大减弱，如图4所示。
60.表2不同浓度发酵上清液与人结肠癌细胞hct116共培养5天的细胞活性(吸光度)
[0061][0062]
实施例3植物乳杆菌gz1806对人肠道的适应能力及安全性
[0063]
3.1、耐酸性和耐胆盐性评估：将待测菌株植物乳杆菌gz1806在mrs琼脂平板上进行复苏并活化3代，并调节菌液初始浓度达到1
×
106cfu/ml。使用盐酸和猪胆盐分别配制酸度(ph＝3.0)及胆盐浓度(0.3％)的mrs肉汤培养基。将1ml待测菌株植物乳杆菌gz1806菌液接种于ph＝3.0的肉汤培养基中，37℃培养18h。培养完毕，取20μl菌液涂布于mrs琼脂平板培养基，设置3个重复，于37℃培养18h。观察培养后mrs平板表面是否有菌落生长。同样，将1ml待测菌株植物乳杆菌gz1806菌液接种于胆盐浓度为0.3％的mrs肉汤培养基，37℃培养18h后，涂平板，37℃培养24h，查看菌落生长情况。
[0064]
耐酸性试验结果表明，植物乳杆菌gz1806在ph＝3.0的mrs肉汤培养基中处理18h后仍可在mrs琼脂平板上长出正常菌落；耐盐性试验结果表明，植物乳杆菌gz1806在胆盐浓度为0.3％ mrs肉汤培养基中耐受18h后仍可在mrs琼脂平板上长出正常菌落；说明植物乳杆菌gz1806具有较强的耐酸和耐胆盐特性。
[0065]
3.2、模拟胃液、肠液耐受性：模拟胃液和肠液购自上海源叶生物科技有限公司。人工胃液模拟液成分为稀盐酸、胃蛋白酶和氯化钠，最终ph 2.5；人工肠液模拟液成分为磷酸二氢钾和胰蛋白酶，最终ph 6.8。将植物乳杆菌gz1806菌株复苏并活化，将菌液浓度调整至1
×
108cfu/ml，取1ml菌液加人9ml模拟人工胃液液中，并进行10倍梯度稀释，吸取20μl涂平板计活菌数，作为耐受人工胃液的初始活菌值；接菌的模拟胃液于37℃培养3h后，再次涂平板计活菌数，作为耐受人工胃液的结束活菌值。同理，将1ml浓度为1
×
108cfu/ml所述植物乳杆菌gz1806发酵液加入9ml模拟肠液中，并进行活菌计数，37℃培养6h后再次计活菌数，计算存活率。
[0066]
存活率＝结束时活菌数/初始活菌数*100％。
[0067]
结果表明，植物乳杆菌gz1806菌株对于人工模拟胃、肠液有较好的耐受能力，人工
胃液中3h后存活率为74.40％，人工肠液6h后存活率为62.64％(表3)。
[0068]
表3植物乳杆菌gz1806菌株对于人工模拟胃、肠液的耐受能力(％)
[0069][0070]
3.3、植物乳杆菌gz1806菌株溶血性及抗生素抗性
[0071]
将植物乳杆菌gz1806菌株复苏并活化3代后，划线接种于哥伦比亚血平板上，37℃培养24h后观测待测菌落周围是否出现溶血环，并以溶血性葡萄球菌作为阳性对照。采用纸片琼脂扩散法测试菌株对常见大类抗生素的药敏性。将植物乳杆菌gz1806菌株复苏并活化3代，菌液浓度调整至1
×
106cfu/ml，用无菌棉签将菌液均匀地涂抹于mrs培养基平板表面，室温10min后放入药敏纸片，37℃培养24h后，用游标卡尺测量各药敏纸片周围的抑菌圈直径，每种抗生素重复3次，试验结果参照美国临床实验室标准委员会(nccls)标准判断菌株的药物敏感性，结果以敏感(s)、中介(i)和耐药(r)表示。
[0072]
溶血性实验结果表明，在菌落周围没有出现溶血环现象(图5)；对测试的6种抗生素表现为敏感(s)，说明所述植物乳杆菌gz1806菌株的安全性(表4)。
[0073]
表4植物乳杆菌gz1806菌株对6种抗生素的敏感性
[0074]
编号四环素氨苄西林头孢曲松克林霉素克拉霉素氯霉素gz1806ssssss
[0075]
实施例4植物乳杆菌gz1806菌株的益生性能
[0076]
4.1短链脂肪酸产生能力
[0077]
发酵液的制备：将所述植物乳杆菌gz1806保存菌株活化培养24h后，吸取4μl菌液加入到4ml肉汤培养基中，37℃培养24h备用。
[0078]
短链脂肪酸的检测：检测仪器为日本岛津公司气质联用仪(gcms-qp2010plus)，色谱柱为美国restek(瑞斯泰克)公司rtx-5熔融石英毛细管柱(30m
×
0.25mm
×
0.25μm)。gc升温程序为初始温度40℃保持5min，每分钟5℃升至150℃，以每分钟10℃升到280℃，并维持2min。载气为高纯氦气(纯度＞99.999％)，流速：1.0ml/min。ms条件：电离方式为ei；温度为200℃，接口温度220℃，质量扫描范围m/z33-500。取发酵液4ml，加入浓度为200μg/ml 2-乙基丁酸内标液10μl，样品以分流模式1:3的方式进样1μl，溶剂延迟时间设定为0.1min，进样口温度270℃。5种短链脂肪酸(乙酸、正丁酸、异丁酸、异戊酸、2-甲基丁酸)的浓度采用内标法计算，测定结果如表5。
[0079]
表5植物乳杆菌gz1806发酵液短链脂肪酸含量(ug/ml)
[0080]
菌株号菌种名乙酸正丁酸异丁酸异戊酸2-甲基丁酸gz1806植物乳杆菌8.8010.0940.1280.3320.1
[0081]
gc-ms检测的5种短链脂肪酸分别是乙酸、正丁酸、异丁酸、异戊酸、异己酸，总离子流图谱如图6所示，基线稳定，内标物与其他目标峰位相近且分离度良好，互相之间无干扰，
结果正常。计算结果表明，植物乳杆菌gz1806发酵液中乙酸含量最高，为8.801μg/ml，此外还含有正丁酸、异丁酸、异戊酸和2-甲基丁酸。最新研究发现乙酸不仅增加了结肠中iga(免疫球蛋白a是哺乳动物中最丰富的免疫球蛋白，维持粘膜表面稳态的一种成分)产生，而且还改变了iga与特定微生物(包括肠杆菌)结合的能力。因此，认为肠道微生物产生的乙酸具有调节iga产生以维持粘膜稳态的作用。丁酸和异戊酸也有非常重要的生理功能。
[0082]
4.2、对常见肠道致病菌的抑菌活性
[0083]
将大肠埃希氏菌(escherichia coli cmccb 44102)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus cmccb 50094)、鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium atcc14028)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa cmccb 10104)、空肠弯曲杆菌(campylobacter jejuni atcc 33291)、大肠弯曲杆菌(campylobacter coli atcc 43478)、单增李斯特菌(listeria monocytogenes atcc19115)、溶血性葡萄球菌(staphylococcus haemolyticus atcc29970)、多杀性巴氏杆菌(pasteurella multocida atcc51689)和小肠结肠炎耶尔氏菌(yersinia enterocolitica atcc23715)分别接种于营养琼脂培养基，复苏并活化3次。吸取适量胰酪大豆胨液体培养基至离心管，将活化好的致病菌接种于肉汤培养基中，并调节菌液浓度达到1
×
108cfu/ml。吸取上述致病菌和肉汤的混合液1ml加至500ml灭菌后暂未凝固的营养琼脂培养基内(温度冷却至40℃左右)，充分混匀后按每皿20ml的量分装至培养皿中。待培养基冷却凝固后，使用直径6mm的打孔器在平板上打孔，制成致病菌琼脂板，每板对应一株菌，并设置三孔作为重复。将待测菌株进行复苏并活化，调节培养后的菌液浓度达到1
×
108cfu/ml。吸取50μl的待测菌菌液加至上述致病菌琼脂板孔内，于37℃培养24h。培养后，使用游标卡尺测量打孔点周围的抑菌圈直径大小并记录。将标准菌株lgg作为对照菌株，与待测菌株同时进行以上实验操作。
[0084]
发酵液对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、空肠弯曲杆菌、大肠弯曲杆菌等致病菌的生长具有较强的抑制活性，与lgg标准菌株的效果基本相当(表6)。
[0085]
植物乳杆菌gz1806菌株的抑菌活性评估测定结果见下表6所示，该菌株对10种常见肠道致病菌的抑菌效果普遍优于标准菌株lgg，特别是对金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特菌、多杀性巴氏杆菌的抑菌优势更加明显，说明由植物乳杆菌gz1806菌株制备的菌剂可用于上述致病菌的防控。
[0086]
表6植物乳杆菌gz1806菌株的抑菌活性评估(直径：mm)
[0087][0088]
4.3、植物乳杆菌gz1806对α-葡萄糖苷酶的抑制作用
[0089]
α-葡萄糖苷酶参与碳水化合物的分解利用，研究表明抑制α-葡萄糖苷酶的活性可
以降低人体血液中的血糖水平。将植物乳杆菌gz1806保存菌种复苏培养24h后，按2％接种量接种于mrs液体培养基中，在37℃条件下培养24h，菌液在4℃4000r/min条件下离心15min，上清液经0.22μm滤膜过滤得到发酵上清液(cfs)备用；取上清液25μl，加入pbs缓冲液(ph＝6.8)50μl、20mmol/l的pnpg溶液50μl，37℃水浴10min；加入20u/mlα-葡萄糖苷酶溶液30μl，37℃继续反应10min；加入50μl 1mol/l na2co3溶液终止反应；在96孔板(365μl)中进行，每组设定3个重复；在酶标仪405nm处测定吸光值，计算得到α-葡萄糖苷酶抑制率(％)。计算公式为：
[0090][0091]
其中a组为α-葡萄糖苷酶；b组为pbs缓冲液；c为待测样品组，含α-葡萄糖苷酶和待测样品；d组仅含待测样品。
[0092]
检测结果表明，植物乳杆菌gz1806发酵上清液具有抑制α-葡萄糖苷酶活性，抑制率为66.46％，显著高于标准菌株鼠李糖乳杆菌lgg及其他相关菌株对α-葡萄糖苷酶的抑制活性(表7)，表明植物乳杆菌gz1806制剂可能具有降低动物和人血液血糖水平的潜力。
[0093]
表7植物乳杆菌gz1806发酵液对α-葡萄糖苷酶的抑制率(％)
[0094][0095]
4.4、植物乳杆菌gz1806发酵液的抗氧化活性
[0096]
抗氧化剂就是任何以低浓度存在就能有效抑制自由基的氧化反应的物质，以抵消自由基对人体细胞的氧化攻击。其作用机理可以是直接作用在自由基，或是间接消耗掉容易生成自由基的物质，防止发生进一步反应，机体抗氧化的能力越强，就越健康，生命也越长。越来越多的研究显示抗氧化是预防衰老的重要步骤，因为自由基或氧化剂会将细胞和组织分解，影响代谢功能，并会引起不同的健康问题。如果能够消除过多的氧化自由基，对于许多自由基引起的及老化相关疾病都能够预防。例如常见的癌症、动脉硬化、糖尿病、白内障、心血管病、老年痴呆、关节炎等，这些疾病都被认为与自由基相关。
[0097]
发酵液的制备：将植物乳杆菌gz1806冻存菌种复苏培养24h后，按2％接种量接种于mrs液体培养基中，在37℃条件下培养24h，菌液在4℃、4000r/min条件下离心15min，上清液经0.22μm滤膜过滤得到发酵上清液(cfs)冻存备用。
[0098]
试剂与仪器：羟自由基测定试剂盒(a018-1-1)、dpph自由基清除能力试剂盒(a153-1-1)和抑制与产生超氧阴离子自由基测定试剂盒(比色法a052-1-1)均由南京建成生物工程研究所生产。紫外可见分光光度计(uv752n型)，上海佑科仪器仪表有限公司生产；
发酵液抗氧化能力测定由成都里来生物科技有限公司完成。
[0099]
抑制羟自由基能力：羟自由基系活性氧的一种，具有极强的得电子能力，也就是氧化能力很强。羟自由基能杀死红细胞，降解dna、细胞膜和多糖化合物。芬顿(fenton)反应是最常见的产生羟自由基的化学反应，h2o2的量和fenton反应产生的羟自由基量成正比，当给予电子受体后，用griess试剂显色，形成红色物质，其呈色与羟自由基的多少成正比关系。严格按照说明书操作，在550nm处测吸光值。计算公式如下：
[0100]
抑制羟自由基能力(u/ml)＝(a
对照-a
测定
)/(a
标准-a
空白
)
×c标准
×
(1/v
样
)
×n[0101]
公式中，c标准:标准品浓度，8.824mmol/l；v样：取样量，0.2ml；n：样本测试前稀释倍数。
[0102]
测定结果如表8，所述植物乳杆菌gz1806发酵液具有较强的抑制羟自由基能力，为3590.76
±
50.85u/ml。
[0103]
dpph自由基清除能力：dpph又称1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，是一种很稳定的氮中心的自由基。由于dpph自由基有单电子，在517nm处有一强吸收，其醇溶液呈紫色，当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，呈现的颜色越浅，因此，可以对样本中dpph清除能力进行定量分析。按照试剂盒说明书将标准品粉剂一支加无水甲醇2ml溶解，即为0.5mg/ml(trolox)标准应用液，再用无水甲醇分别稀释成5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml、25μg/ml，使用波长517nm，1cm光径，无水乙醇调零，测定各管吸光度，制作标准曲线。
[0104]
dpph自由基清除率(％)＝(1-(a测定－a对照)
÷
a空白)
×
100％
[0105]
用从标准曲线算得的相当于抗氧化剂trolox的量来表示样本的dpph自由基清除能力。发酵液样品dpph自由基清除能力(μg trolox/ml)＝代入标准曲线得相当于trolox的浓度
×
稀释倍数。植物乳杆菌gz1806发酵液的dpph自由基清除能力测定结果见表8，可知，植物乳杆菌gz1806发酵液的dpph自由基清除能力192.69
±
4.29μg trolox/ml，表明植物乳杆菌gz1806发酵液对dpph自由基有一定的清除能力。
[0106]
抗超氧阴离子能力：超氧阴离子自由基作为生物体代谢过程中产生的一种自由基，可攻击生物大分子，如脂质、蛋白质、核酸和聚不饱和脂肪酸等，使其交链或者断裂，引起细胞结构和功能的破坏，与机体衰老和病变有很密切的关系。本实验模拟机体中黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶反应系统，产生超氧阴离子自由基，加入电子传递物质及gress氏显色剂，使反应体系呈现紫红色，用分光光度计测其吸光度，当被测样本中含有超氧阴离子自由基抑制剂时，则比色时测定管的吸光度低于对照管的吸光度，通过以维生素c做标准，可计算出被检物品对超氧阴离子自由基的抑制能力。测定时用1cm光径比色杯，双蒸水调零，波长550nm处比色。
[0107]
抗超氧阴离子能力(u/l)＝(a对照-a测定)/(a对照-a标准)
×
c标准
×
1000
×n[0108]
在反应系统中，每升发酵液在37℃反应40分钟所抑制的超氧阴离子自由基相当于1mg的维生素c所抑制的超氧阴离子自由基的变化值为一个活力单位。植物乳杆菌gz1806发酵液的抗超氧阴离子能力测定结果见下表8，可知，植物乳杆菌gz1806发酵液对超氧阴离子自由基的抑制能力为672.36
±
8.81(u/l)，表明植物乳杆菌gz1806发酵液对超氧阴离子自由基的抑制能力较强。
[0109]
表8植物乳杆菌gz1806发酵液的抗氧化能力
[0110][0111]
综上可知，gz1806发酵液的抗氧化能力较强，在功能性食品领域具有潜在的应用价值，包括用于改善人体健康水平等。
[0112]
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

技术特征：
1.一种植物乳杆菌gz1806，于2023年02月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no:26590。2.权利要求1所述的植物乳杆菌gz1806在制备抗结肠癌药物或抗结肠癌辅助药物中的应用。3.权利要求1所述的植物乳杆菌gz1806在非疾病治疗目的的抑制大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、空肠弯曲杆菌、大肠弯曲杆菌、单增李斯特菌、溶血性葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌或小肠结肠炎耶尔氏菌中的应用。4.权利要求1所述的植物乳杆菌gz1806在制备治疗大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、空肠弯曲杆菌、大肠弯曲杆菌、单增李斯特菌、溶血性葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌或小肠结肠炎耶尔氏菌导致疾病的药物中的应用。5.权利要求1所述的植物乳杆菌gz1806在制备降血糖或抗氧化功能药物中的应用。6.权利要求1所述的植物乳杆菌gz1806在调节人或动物肠道菌群的功能性食品中的应用。7.一种抗结肠癌药物或抗结肠癌辅助药物，其特征在于，包括权利要求1中所述的植物乳杆菌gz1806。8.一种降血糖药物，其特征在于，包括权利要求1中所述的植物乳杆菌gz1806。9.一种抗氧化药物，其特征在于，包括权利要求1中所述的植物乳杆菌gz1806。10.一种功能性食品，其特征在于，包括权利要求1中所述的植物乳杆菌gz1806。

技术总结
本发明公开了一种具有结肠癌细胞生长抑制作用的植物乳杆菌及其应用，该菌株安全性好，在哥伦比亚血平板上不产生溶血现象，对多种常见类型的抗生素敏感，不携带抗生素抗性基因，对酸、胆盐、人工胃液、人工肠液有较好的耐受能力，对人结肠癌细胞有较强黏附能力，其发酵上清液与结肠癌细胞HCT-116共培后表现出较强的癌细胞活性抑制能力，对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、空肠弯曲杆菌和大肠弯曲杆菌等具有较强的抑制能力，能产生乙酸、丁酸等多种短链脂肪酸，对α-葡萄糖苷酶具有较强的抑制作用，抗氧化作用较强。因此，该菌株益生作用明显，可应用于人和动物功能性食品领域。和动物功能性食品领域。和动物功能性食品领域。


技术研发人员：岳碧松 尚可 邹方东 李琰
受保护的技术使用者：四川大学
技术研发日：2023.04.21
技术公布日：2023/7/25