一种早期鉴定亚洲莲花瓣颜色的分子标记及其应用

1.本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一种早期鉴定亚洲莲花瓣颜色的分子标记及其应用。


背景技术：

2.莲属于莲科莲属的古老孑遗植物，全世界仅有亚洲莲(nelumbo nucifera)和美洲莲(n.lutea)两个种。亚洲莲分布较为广泛，北起俄罗斯南部，南到澳大利亚北部，其在株型、花型、地下茎和种子等方面表现出极为丰富的遗传多样性。美洲黄莲主要分布于美国，处于野生状态，其植株较小，花单瓣，花瓣为黄色。经过长期人工驯化与选择，亚洲莲形成了花莲(主要用于观赏)、藕莲(主要用于生产藕)和子莲(主要用于生产莲子)三种不同农业用途的栽培类型。其中花莲因多变的花型、艳丽的花色等优良观赏性状，深受到大众喜欢，是园林水景景观设计的重要构成要素之一。
3.花色是评价花莲观赏价值的重要评价指标。虽然亚洲莲野生资源只有粉色和白色两种，但通过亚洲莲种内杂交、与美洲黄莲种间杂交选育的花莲品种花色有红、粉、白、黄及复色五种。目前已经选育得到1000余个花莲品种，其中红色占35％、粉色占20％、白色占20％、黄色占6％、复色占13％。在不同花色的花莲品种选育进程中，花色鉴定均是在开花期通过观察花朵形态完成的。如能开发出用于在莲幼苗阶段早期鉴定花色的分子标记或者方法，将会节约大量的人力、物力、时间等育种成本，提高育种效率，加速花莲定向育种进程。


技术实现要素：

4.为了解决上述问题，本发明提供了一种用于亚洲莲花瓣颜色早期鉴定或亚洲莲新种质花瓣颜色分子辅助育种的分子标记及方法。
5.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
6.分子标记在亚洲莲花瓣颜色早期鉴定或在亚洲莲新种质的花瓣颜色分子辅助育种中的应用：包括分子标记pc1和pc2，分子标记pc1的核苷酸序列如seq id no.1所示，分子标记pc2的核苷酸序列如seq id no.2所示。花瓣为白色的纯隐形株仅含有分子标记pc1，花瓣为红色的纯显性株仅含有分子标记pc2，花瓣为红色的杂合株或花瓣为红白复色的杂合株同时含有分子标记pc1和pc2。
7.一种早期鉴定亚洲莲花瓣颜色的方法：白色花瓣的亚洲莲仅含有序列如seq id no.1所示的分子标记pc1，红色或红白复色花瓣的亚洲莲含有seq id no.2所示的分子标记pc2。具体包括以下方法：以待测亚洲莲的基因组dna为模板，利用seq id no.3和4所示的引物1扩增所述的分子标记pc1，以seq id no.5和6所示的引物2扩增所述的分子标记pc2，根据扩增产物来判断花瓣的颜色，如果引物1扩增出大小为2079bp条带，引物2未扩增出条带，则待检测莲为白色花瓣；如果引物2扩增出大小为3630bp条带，则待检测莲为红色花瓣或红白复色花瓣。
8.与传统依据外形进行花色鉴定相比，本发明具有如下优势：
9.1.效率高：本发明提供分子标记及其鉴定方法可快速精准鉴定和筛选红色、白色的莲种质资源，选择目标明确，效率高。在本发明实施例中，利用分子标记进行不同花色莲种质的鉴定，其准确率可以达到90.9％。
10.2.节约育种时间：本发明提供分子标记及其鉴定方法能够在dna水平上对花瓣颜色进行选择，在幼苗阶段完成花色早期鉴定，可用于红白花色莲新种质的分子标记辅助育种，显著缩短育种的时间。
附图说明
11.图1为分子标记pc1和pc2在24个莲种质资源的检测电泳图；其中，a为分子标记pc1的电泳图，b为分子标记pc2的电泳图。图中泳道编号的顺序同表2中样品编号，m为d5000 ladder。
具体实施方式
12.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如michael r.greenhe和joseph sambrook编著的《分子克隆实验指南》(molecular cloning:a laboratory manual,2012)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
13.实施例1一种早期鉴定亚洲莲花瓣颜色的分子标记的开发和方法
14.(1)分子标记的开发
15.发明人通过对86个红色、36个白色和5个红白复色的莲种质资源基因组序列进行分析发现，这些莲种质资源在第4号染色体32mb处存在着一个90kb的插入/缺失变异。其中，97.7％的红色莲种质资源和80.0％的复色莲种质资源的基因组序列中存在着这90kb片段，而83.3％的白色莲种质资源的基因组序列中缺失这90kb片段(表1)。根据此90kb片段的侧翼和内部的序列分别开发了分子标记pc1(seq id no.1)和pc2(seq id no.2)。
16.分子标记pc1的引物序列为：
17.正向引物pc1f：5'-ggaaggattatgcaatagatccgagc-3'(seq id no.3)；
18.反向引物pc1r：5'-cgaactggttcagacccaaaattaattatt-3(seq id no.4)'。
19.分子标记pc2的引物序列为：
20.正向引物pc2f：5'-gaagtttttggagttgattacgtgtgac-3'(seq id no.5)；
21.反向引物pc2r：5'-tcaataactccaccacctatgattcat-3'(seq id no.6)。
22.表1 127个莲种质资源的基因组中90kb序列片段的插入与缺失情况
[0023][0024]
(2)已知花瓣颜色莲种质资源基因组dna的提取
[0025]
选取36个莲种质资源(14个白色、19个红色和3个红白复色)的幼嫩新鲜叶片，采用改良ctab法提取基因组dna，具体步骤如下：
[0026]
i取鲜样约0.5克放入冰浴的研钵中，加1ml ctab提取液，把叶片磨碎至浆状，然后转移装到2.0ml离心管中；
[0027]
ii将离心管置于65℃水浴恒温煮60分钟，其间混合2-3次。于12000rmp离心10分钟，吸取上清液至新离心管中；
[0028]
iii加等体积的24:1(v:v)的氯仿：异戊醇，轻轻颠倒使其充分摇匀；然后12000rpm离心10分钟使其分层；吸取上清液，重复一次加等体积的24:1(v:v)的氯仿：异戊醇；
[0029]
iv轻轻吸取上清液至干净离心管，加800μl的-20℃预冷无水乙醇，置于-20℃冷冻30分钟，以沉淀dna；
[0030]
v取出白色絮状dna，用200μl的75％乙醇浸泡5个小时。倒掉乙醇，重复加75％乙醇1次，浸泡1个小时，把离心管置于通风橱内吹干；
[0031]
vi加入100ml te溶液溶解dna；
[0032]
vii用0.8％琼脂糖凝胶电泳和onedrop分光光度计检测dna质量和浓度；
[0033]
viii将dna浓度稀释为50ng/μl，放到-20℃冰箱备用。
[0034]
(3)pcr扩增
[0035]
用分子标记pc1和pc2的引物对36个莲种质资源的dna进行pcr扩增。pcr反应体系按10μl计为：50ng dna模板，2μl 10
×
pcr buffer，1u taq dna聚合酶，0.2mmol/l dntps，正反引物各4μmol/l。pcr扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，58～60℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；最后72℃延伸10min，10℃保存。
[0036]
(4)pcr产物检测
[0037]
在pcr产物加入2微升6
×
loading buffer用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，d5000 ladder作为标准分子量对照。电泳时电压为120v，电流48ma，在凝胶成像系统中观察拍照。
[0038]
(5)电泳结果分析
[0039]
利用分子标记pc1和pc2的引物分别对36份供试莲种质资源进行pcr扩增，结果如表2。分子标记pc1的引物在13个白花、2个红色和2个复色种质资源中扩增出大小为2079bp条带，在17个红花和1个复色种质资源中未扩增出条带。虽然分子标记pc1的引物在白色种质资源
‘
白龙戏珠’扩增出条带，但片段大小与其他白色莲种质资源不同。分子标记pc2的引物在所有的红花和复色种质资源中均扩增出大小为3630bp条带，在所有白花种质资源中未扩增出条带。
[0040]
从上述结果可以看出，92.9％的白花莲种质资源只可用分子标记pc1的引物扩增出2079bp的条带，89.5％的红花莲种质资源只可用分子标记pc2的引物扩增出3630bp的条带，2个复色莲种质资源可用分子标记pc1和pc2的引物扩增出2079bp和3630bp条带。因此，分子标记pc1和pc2可以准确鉴定出莲种质资源花瓣的白色和红色，其准确率达到90.9％。
[0041]
表2分子标记在供试36份莲种质资源的扩增结果
[0042][0043]
实施例2莲杂交后代花瓣颜色的早期鉴定
[0044]
利用分子标记pc1和pc2对由红色和白色的莲种质资源杂交获得50个f2代单株进行花色的早期鉴定，包括以下步骤：
[0045]
(1)利用红色和白色莲种质资源配置杂交并进行自交，获得f2后代种子。把种子破壳萌发，待长至3片叶时，采取1片幼嫩的莲叶，提取基因组dna。并将50个f2代单株种植到口径80cm的缸中。
[0046]
(2)以提取的基因组dna为模板，分别利用分子标记pc1和pc2引物对进行pcr扩增，并用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，方法如实施例1。
[0047]
(3)在莲花期时调查50个f2代单株的花瓣颜色
[0048]
50个f2代单株利用分子标记pc1和pc2的引物进行pcr扩增结果及其花瓣颜色见表3。仅pc1的引物扩增出2079bp条带的f2代单株有13个，花瓣均为白色；仅pc2的引物扩增出3630bp条带的f2代单株有12个，花瓣均为红色；分子标记pc1和pc2均扩增出条带的f2代单株有25个，花瓣均为红色。
[0049]
从上述结果看出，表型性状白色和红色的分离比为1:3，基因型分离比为1:2:1。因此红色为显性性状，基因型分离比符合f2代遗传分离比。说明了分子标记pc1和pc2鉴定莲杂交后代花瓣颜色的准确性。
[0050]
因此，用分子标记pc1和pc2可以进行亚洲莲花瓣颜色的早期鉴定和分子辅助选择。如果分子标记pc1的引物扩增出大小为2079bp条带，而分子标记pc2的引物未扩增出条带，说明该检测单株为纯隐性，花瓣为白色；如果分子标记pc2的引物扩增出大小为3630bp条带，而分子标记pc1的引物未扩增出条带，说明该检测单株为纯显性，花瓣为红色。如果分子标记pc1和pc2的引物均扩增出条带，说明该检测单株为杂合性，花瓣为红色。
[0051]
表3 50个莲f2单株的花瓣颜色
[0052][0053]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

技术特征：
1.分子标记在亚洲莲花瓣颜色早期鉴定或在亚洲莲新种质的花瓣颜色分子辅助育种中的应用，其特征在于，包括分子标记pc1和pc2，分子标记pc1的核苷酸序列如seq id no.1所示，分子标记pc2的核苷酸序列如seq id no.2所示。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，花瓣为白色的纯隐形株仅含有分子标记pc1，花瓣为红色的纯显性株仅含有分子标记pc2，花瓣为红色的杂合株或花瓣为红白复色的杂合株同时含有分子标记pc1和pc2。3.用于早期鉴定亚洲莲花瓣颜色的引物，其特征在于，包括两对引物，引物1的核苷酸序列如seq id no.3和4所示，引物2的核苷酸序列如seq id no.5和6所示。4.一种早期鉴定亚洲莲花瓣颜色的方法，其特征在于，白色花瓣的亚洲莲仅含有序列如seq id no.1所示的分子标记pc1，红色或红白复色花瓣的亚洲莲含有seq id no.2所示的分子标记pc2。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括以下方法：以待测亚洲莲的基因组dna为模板，利用seq id no.3和4所示的引物1扩增所述的分子标记pc1，以seq id no.5和6所示的引物2扩增所述的分子标记pc2，根据扩增产物来判断花瓣的颜色，如果引物1扩增出大小为2079bp条带，引物2未扩增出条带，则待检测莲为白色花瓣，如果引物2扩增出大小为3630bp条带，则待检测莲为红色花瓣或红白复色花瓣。

技术总结
本发明属于植物分子生物学领域，公开了一种早期鉴定亚洲莲花瓣颜色的分子标记及其应用。通过分子标记PC1和PC2在已知花色的36个亚洲莲中进行检测，可准确将花瓣为红色和白色的单株区分开，准确率可达90.9%。本发明提供的分子标记及其鉴定方法还可用于亚洲莲新种质分子辅助育种过程中花瓣颜色的早期鉴定，可准确将花瓣为红色和白色的纯合和杂合单株区分开。本发明可靠性高，稳定性好，可显著缩短育种周期，提高育种效率，节省成本，并具有很高的社会经济价值和十分广阔的应用前景。经济价值和十分广阔的应用前景。


技术研发人员：杨美 刘娟 杨东 邓显豹 孙恒
受保护的技术使用者：中国科学院武汉植物园
技术研发日：2023.04.21
技术公布日：2023/7/25