一种能诱导血浆干细胞分泌细胞因子的方法与流程

1.本发明涉及细胞工程技术领域，具体为一种能诱导血浆干细胞分泌细胞因子的方法。


背景技术：

2.细胞因子是由如单核、巨噬细胞、t细胞、b细胞、nk细胞等免疫细胞和内皮细胞、表皮细胞、纤维母细胞等非免疫细胞经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质。细胞因子一般通过结合相应受体调节细胞生长、分化和效应，调控免疫应答。细胞因子是免疫原、丝裂原或其他刺激剂诱导多种细胞产生的低分子量可溶性蛋白质，具有调节固有免疫和适应性免疫、血细胞生成、细胞生长、apsc多能细胞以及损伤组织修复等多种功能。细胞因子可被分为白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子、生长因子等。
3.干细胞作为一种具有自我更新能力的多潜能细胞，在培养过程中会产生各种细胞因子，为获取更多的细胞因子，通常会对干细胞进行扩增增殖。传统技术通过向干细胞培养基中添加诱导成分，刺激干细胞分泌细胞因子，通过改进诱导培养方法及诱导组合物，能够很好的刺激干细胞分泌细胞因子。


技术实现要素：

4.鉴于现有技术中所存在的问题，本发明公开了一种能诱导血浆干细胞分泌细胞因子的方法，包括步骤如下：步骤一、选取t25培养瓶，加入完全培养基；步骤二、取传代培养的血浆干细胞，接种于t25培养瓶中的完全培养基中进行过培养；步骤三、待细胞浓度融合至75％后，吸出培养瓶中的培养基，用pbs对细胞清洗2次，再向培养瓶中加入诱导培养基，继续培养30-35小时，所述诱导培养基各组分以培养基终浓度计为：玉米素19-24mg/ml、转铁蛋白10-12mg/ml、海藻酸钠51-54μg/ml、谷氨酰胺0.06-0.1mg/ml、葡萄糖1-10mg/ml、淫羊藿素0.3-0.5mg/ml、胰岛素0.20-0.5mg/ml、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.5-1mmol/l、吲哚美辛0.2-0.8mmol/l；步骤四、将培养瓶中的细胞及培养基均分转移入两个培养瓶中，同时补充诱导培养基进行扩培养，培养35-40小时，收集培养基，获取细胞因子。
5.作为本发明的一种优选方案，步骤一中所述完全培养基为dmem-hg/f12培养基中加入葡甲胺80-85ng/ml、右旋糖苷25-28μg/ml、甘草酸二钾2-4mg/ml。
6.作为本发明的一种优选方案，步骤二血浆干细胞的接种密度为1-2
×
105个/ml，诱导培养过程在37℃，4-5％co2，4-5％o2的条件下进行。
7.本发明的有益效果：本发明根据细胞培养及诱导培养需求，提供了一种完全培养基和一种诱导培养基，完全培养基中添加葡甲胺、右旋糖苷、甘草酸二钾，各组分协同作用，
在干细胞培养过程中初步完成诱导培养，促进细胞因子的分泌，提高细胞培养液中细胞因子的含量；诱导培养基以玉米素、转铁蛋白、海藻酸钠、谷氨酰胺、葡萄糖为主要成分，能够有效促进干细胞的细胞因子分泌，提高了培养液中细胞因子的含量，整个过程有利于细胞因子的收集和应用，易于操作，节约成本，便于商业化的生产各种细胞因子产品。
具体实施方式
8.实施例1
9.本发明的一种能诱导血浆干细胞分泌细胞因子的方法，包括步骤如下：步骤一、选取t25培养瓶，加入完全培养基，所述完全培养基为dmem-hg/f12培养基中加入葡甲胺80ng/ml、右旋糖苷25μg/ml、甘草酸二钾2mg/ml；步骤二、取传代培养的血浆干细胞，接种于t25培养瓶中的完全培养基中进行过培养，血浆干细胞的接种密度为1
×
105个/ml，诱导培养过程在37℃，4％co2，5％ o2的条件下进行；步骤三、待细胞浓度融合至75％后，吸出培养瓶中的培养基，用pbs对细胞清洗2次，再向培养瓶中加入诱导培养基，继续培养30小时，所述诱导培养基各组分以培养基终浓度计为：玉米素19mg/ml、转铁蛋白10mg/ml、海藻酸钠51μg/ml、谷氨酰胺0.06mg/ml、葡萄糖1mg/ml、淫羊藿素0.3mg/ml、胰岛素0.20mg/ml、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.5mmol/l、吲哚美辛0.2mmol/l；步骤四、将培养瓶中的细胞及培养基均分转移入两个培养瓶中，同时补充诱导培养基进行扩培养，培养35小时，收集培养基，获取细胞因子。
10.实施例2
11.本发明的一种能诱导血浆干细胞分泌细胞因子的方法，包括步骤如下：步骤一、选取t25培养瓶，加入完全培养基，所述完全培养基为dmem-hg/f12培养基中加入葡甲胺85ng/ml、右旋糖苷28μg/ml、甘草酸二钾4mg/ml；步骤二、取传代培养的血浆干细胞，接种于t25培养瓶中的完全培养基中进行过培养，血浆干细胞的接种密度为2
×
105个/ml，诱导培养过程在37℃，5％co2，4％ o2的条件下进行；步骤三、待细胞浓度融合至75％后，吸出培养瓶中的培养基，用pbs对细胞清洗2次，再向培养瓶中加入诱导培养基，继续培养35小时，所述诱导培养基各组分以培养基终浓度计为：玉米素24mg/ml、转铁蛋白12mg/ml、海藻酸钠54μg/ml、谷氨酰胺0.1mg/ml、葡萄糖10mg/ml、淫羊藿素0.5mg/ml、胰岛素0.5mg/ml、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤1mmol/l、吲哚美辛0.8mmol/l；步骤四、将培养瓶中的细胞及培养基均分转移入两个培养瓶中，同时补充诱导培养基进行扩培养，培养40小时，收集培养基，获取细胞因子。
12.实施例3
13.本发明的一种能诱导血浆干细胞分泌细胞因子的方法，包括步骤如下：步骤一、选取t25培养瓶，加入完全培养基，所述完全培养基为dmem-hg/f12培养基中加入葡甲胺83ng/ml、右旋糖苷27μg/ml、甘草酸二钾3mg/ml；步骤二、取传代培养的血浆干细胞，接种于t25培养瓶中的完全培养基中进行过培
养，血浆干细胞的接种密度为1.5
×
105个/ml，诱导培养过程在37℃，4.5％ co2，4.5％ o2的条件下进行；步骤三、待细胞浓度融合至75％后，吸出培养瓶中的培养基，用pbs对细胞清洗2次，再向培养瓶中加入诱导培养基，继续培养33小时，所述诱导培养基各组分以培养基终浓度计为：玉米素22mg/ml、转铁蛋白11mg/ml、海藻酸钠53μg/ml、谷氨酰胺0.08mg/ml、葡萄糖5mg/ml、淫羊藿素0.4mg/ml、胰岛素0.3mg/ml、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.7mmol/l、吲哚美辛0.5mmol/l；步骤四、将培养瓶中的细胞及培养基均分转移入两个培养瓶中，同时补充诱导培养基进行扩培养，培养37小时，收集培养基，获取细胞因子。
14.本文中未详细说明的部件为现有技术。
15.上述虽然对本发明的具体实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施例，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化，而不具备创造性劳动的修改或变形仍在本发明的保护范围以内。


技术特征：
1.一种能诱导血浆干细胞分泌细胞因子的方法，其特征在于，包括步骤如下：步骤一、选取t25培养瓶，加入完全培养基；步骤二、取传代培养的血浆干细胞，接种于t25培养瓶中的完全培养基中进行过培养；步骤三、待细胞浓度融合至75％后，吸出培养瓶中的培养基，用pbs对细胞清洗2次，再向培养瓶中加入诱导培养基，继续培养30-35小时，所述诱导培养基各组分以培养基终浓度计为：玉米素19-24mg/ml、转铁蛋白10-12mg/ml、海藻酸钠51-54μg/ml、谷氨酰胺0.06-0.1mg/ml、葡萄糖1-10mg/ml、淫羊藿素0.3-0.5mg/ml、胰岛素0.20-0.5mg/ml、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.5-1mmol/l、吲哚美辛0.2-0.8mmol/l；步骤四、将培养瓶中的细胞及培养基均分转移入两个培养瓶中，同时补充诱导培养基进行扩培养，培养35-40小时，收集培养基，获取细胞因子。2.根据权利要求1所述的一种能诱导血浆干细胞分泌细胞因子的方法，其特征在于：步骤一中所述完全培养基为dmem-hg/f12培养基中加入葡甲胺80-85ng/ml、右旋糖苷25-28μg/ml、甘草酸二钾2-4mg/ml。3.根据权利要求1所述的一种能诱导血浆干细胞分泌细胞因子的方法，其特征在于：步骤二血浆干细胞的接种密度为1-2
×
105个/ml，诱导培养过程在37℃，4-5％co2，4-5％o2的条件下进行。

技术总结
本发明涉及一种能诱导血浆干细胞分泌细胞因子的方法。本发明根据细胞培养及诱导培养需求，提供了一种完全培养基和一种诱导培养基，完全培养基中添加葡甲胺、右旋糖苷、甘草酸二钾，各组分协同作用，在干细胞培养过程中初步完成诱导培养，促进细胞因子的分泌，提高细胞培养液中细胞因子的含量；诱导培养基以玉米素、转铁蛋白、海藻酸钠、谷氨酰胺、葡萄糖为主要成分，能够有效促进干细胞的细胞因子分泌，提高了培养液中细胞因子的含量，整个过程有利于细胞因子的收集和应用，易于操作，节约成本，便于商业化的生产各种细胞因子产品。便于商业化的生产各种细胞因子产品。


技术研发人员：徐子恩 弗莱德
受保护的技术使用者：贝美缇（上海）健康科技有限公司
技术研发日：2023.04.18
技术公布日：2023/7/25