一种基于人LDHA基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体及其构建方法和应用

一种基于人ldha基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体及其构建方法和应用
技术领域
1.本发明属于分子克隆和基因编辑技术领域，具体涉及一种基于人ldha基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体及其构建方法和应用。


背景技术：

2.恶性肿瘤作为全球公共卫生问题，严重威胁人类健康。肿瘤代谢是肿瘤发生和发展过程中经历的必由之路。肿瘤细胞通过各种代谢途径自主改变其通量，以满足增加的生物能量和生物合成需求，并减轻肿瘤细胞增殖和存活所需的氧化应激。过去几十年，随着技术发展和应用，研究人员不仅揭示了肿瘤异质性和可塑性，同时还发现了维持肿瘤生长的新代谢途径。肿瘤代谢起源于otto warburg研究(otto warburg因发现线粒体呼吸链复合体iv而获得1931年诺贝尔生理学或医学奖)，他发现与正常组织相比，体外癌组织切片即使在有氧情况下也可利用大量葡萄糖产生乳酸，这种现象称为有氧糖酵解或warburg效应。20世纪90年代，人们发现参与糖酵解的乳酸脱氢酶(ldha)是癌基因myc转录靶点，是肿瘤细胞糖酵解增加和致瘤所必需的，这为warburg效应提供了分子基础，也是肿瘤治疗中，针对肿瘤代谢重编程的新兴治疗靶点。乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,ldh)是烟酰胺腺嘌呤二核苷(nicotinamide adenine dinucleotide,nad)依赖性激酶，常见的a、b两种亚基可构成5种ldh同工酶(ldh1～5)，c亚基仅仅组成一种ldh同工酶ldh-c4，又称为ldh-x。ldha蛋白由ldha基因编辑，ldha基因位于甲基化热点11染色体的短臂。ldha对丙酮酸有较高的亲和力，其主要作用是将丙酮酸转化为乳酸，将nadh转化为nad+。在诸多癌症中，ldha具有较高的表达谱和激活状态，ldha通过多种机制与肿瘤的恶性生物学特性密切相关。ldha可促进癌细胞增殖，维持细胞存活；ldha有助于增强癌细胞的侵袭和转移；ldha还可以触发血管生成以及协助癌细胞免疫逃逸。
3.肿瘤代谢研究开始于上世纪中期，然而在过去几十年中，靶向肿瘤代谢治疗的进展依然十分缓慢。只有少数基于代谢的抗肿瘤药物正在或准备进行临床试验，近年来针对肿瘤代谢方向的精准医疗方案的不断进展，科研工作者也逐渐认识到肿瘤药物设计框架必须考虑肿瘤免疫微环境(time)中非癌细胞的代谢脆弱性，以及癌细胞的代谢脆弱性。乳酸脱氢酶以ldha和ldhb同源四聚体和异源四聚体形式存在，对warburg效应至关重要。抑制ldha和ldhb可能都具有治疗作用，不过大多数尝试都针对ldha，尽管已经开发了几种有效的ldha抑制剂，但小分子对其选择性抑制的成功率有限。因此，一款能够测量ldha表达量的敏感识别元件亟待开发。专利cn113362956a“基于个体化代谢模型的肿瘤分型与潜在靶标预测方法”构建了肿瘤病人个体化代谢网络模型，该模型能够预测对肿瘤细胞生长具有重要影响的基因及药物潜在靶标，但该专利属于数据量化生物学模型，对肿瘤标记物ldha表达量的预测分析特异性不佳。专利cn107119112a“一种检测肿瘤代谢通路基因表达的引物组、芯片及其应用”公开发表了168个肿瘤代谢相关基因的引物对，但该发明仅可测量肿瘤样本中ldhamrna水平的表达，对其ldha由dna甲基化所导致的表达水平变化以及其转录因
子结合位点，则无法进行考察。专利cn113056559a“用于乳酸脱氢酶(ldha)基因编辑的组合物和方法”提供了一种用于在ldha基因内进行编辑，例如引入双链断裂的组合物和方法，但该方法仅用于治疗患有高草酸尿症的受试者，无法应用于肿瘤患者治疗。


技术实现要素：

4.基于解决以上上述问题，本发明的目的在于提供一种基于人ldha基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体及其构建方法和应用。
5.本发明的具体技术方案如下：
6.本发明第一方面提供一种基于人ldha基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体，所述基于人ldha基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体记为pgl3-ldha-promoter，其核苷酸序列如seq id no.2所示。
7.本发明第二方面提供所述基于人ldha基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体的构建方法，包括如下步骤：
8.(1)以人卵巢上皮细胞a2780全基因组dna为模板，利用核苷酸序列如seq id no.3和seq id no.4所示的引物对，进行pcr扩增，得到ldha基因启动子；
9.(2)使用限制性内切酶bgl ii和hind iii对pgl3-basic质粒进行双酶切，得到pgl3-basic的线性化质粒；
10.(3)将步骤(1)得到的ldha基因启动子和步骤(2)得到的pgl3-basic的线性化质粒进行重组反应；
11.(4)将步骤(3)所得重组产物转入感受态细胞中，挑取单克隆进行电泳验证、酶切验证和测序鉴定，得到基于人ldha基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体。
12.进一步地，步骤(1)中所述pcr扩增的体系为：
[0013][0014][0015]
步骤(1)中所述pcr扩增的程序为：
[0016][0017]
进一步地，步骤(3)中所述重组反应的体系为：
[0018][0019]
插入片段ldha promoter与线性化载体的摩尔比＝1:2～1:5。
[0020]
本发明第三方面提供人ldha基因启动子的双荧光素酶识别系统，其包括所述基于人ldha基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体、pgl3-basic质粒和内参prl-tk质粒。
[0021]
本发明第四方面提供所述基于人ldha基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体在检测细胞中人ldha基因启动子活性中的应用。
[0022]
本发明第五方面提供一种检测细胞中人ldha基因启动子活性的方法，所述方法为：将pgl3-ldha-promoter、pgl3-basic分别与内参prl-tk质粒共转入细胞中，检测相对荧光素酶活性的值，相对荧光素酶活性的值＝[荧光(pgl3-ldha-promoter)-荧光(pgl3-basic)]/荧光(prl-tk)，基于相对荧光素酶活性的值判定人ldha基因启动子活性，所述相对荧光素酶活性的值越大，人ldha基因启动子活性越强。
[0023]
进一步地，所述pgl3-ldha-promoter或pgl3-basic质粒的质量为1μg，所述内参prl-tk质粒的质量为50ng；
[0024]
优选地，所述细胞为肿瘤细胞。
[0025]
ldha在肿瘤中升高，不仅可以促进糖酵解，还可以促进乳酸的产生从而重塑肿瘤微环境，抑制免疫系统促进免疫逃逸。因此，ldha是一个有前景的治疗靶点，对于ldha表达的精准量化，有助于筛查代谢疾病与肿瘤疾病。具体措施：当病人进行病理活检时，组织可以在体外进行培养形成特定病人细胞系或类器官，该细胞系可以转染本发明报告基因载体，进行ldha promoter活性的预测，从而精准预测疾病的发生发展。
[0026]
本发明第六方面提供所述基于人ldha基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体，或所述人ldha基因启动子的双荧光素酶识别系统在制备肿瘤疾病筛查试剂盒或肿瘤治疗药物筛选试剂盒中的应用，在进行肿瘤疾病的筛查时，通过所述检测细胞中人ldha基因启动子活性的方法检测待测样本细胞和已知对照组标准肿瘤细胞的相对荧光素酶活性的值，比较两者的大小，从而实现对肿瘤疾病进程的预测与判断；
[0027]
在进行肿瘤治疗药物的筛选时，通过所述检测细胞中人ldha基因启动子活性的方法检测施加待测肿瘤治疗药物和未施加待测肿瘤治疗药物的肿瘤细胞的相对荧光素酶活性的值，比较两者的大小，从而实现对肿瘤治疗药物的筛选。
[0028]
本发明第七方面提供所述基于人ldha基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体或所述人ldha基因启动子的双荧光素酶识别系统在制备糖尿病筛查试剂盒或降血糖药物筛选试剂盒中的应用，在进行糖尿病的筛查时，通过所述检测细胞中人ldha基因启动子活性的方法检测待测样本细胞和已知对照组标准糖尿病细胞的相对荧光素酶活性的值，比较两者的大小，从而实现对糖尿病进展的预测与判断；
[0029]
在进行降血糖药物的筛选时，通过所述检测细胞中人ldha基因启动子活性的方法检测施加待测降血糖药物和未施加待测降血糖药物的糖尿病患者细胞的相对荧光素酶活
性的值，比较两者的大小，从而实现对降血糖药物的筛选。
[0030]
本发明的有益效果为：
[0031]
1、本发明基于人ldha基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体可作为肿瘤细胞ldha promoter活性检测敏感元器件，实现对ldha启动子表达量进行敏感识别和较为准确的检测。
[0032]
2、本发明pgl3-ldha-promoter质粒可解决现有技术中无法检测dna甲基化所导致的mrna表达水平变化，以及无法考察转录因子结合位点的问题。
[0033]
3、人ldha启动子序列gc含量高，难以使用特异性引物进行pcr扩增实验，本发明利用map viewer进行目的基因的查找，利用nucleotide blast进行引物设计，运用sts查找与比对已经公布的引物序列，优选特异性较高组别。本发明所设计如seq id no.3和seq id no.4所示的引物对具有高特异性，实现对人ldha启动子的扩增。
[0034]
4、针对dna序列单酶切容易导致质粒载体自连的问题，本发明将ldha基因启动子通过高效酶和同源重组原理，利用bgl ii以及hindⅲ完成了ldha基因启动子目的片段与pgl3-basic线性化载体的克隆重组，利用双酶切的方法可以极大的降低载体的自连，提高重组载体的阳性率。
附图说明
[0035]
图1为pgl3-basic荧光素酶报告基因载体图谱；
[0036]
图2为ncbi验证pcr引物特异性验证报告；
[0037]
图3为pcr扩增ldha启动子片段，其中s列为dna标准参照物；1为ldha启动子pcr扩增产物；
[0038]
图4为pcr重组质粒pgl3-ldha-promoter的鉴定；其中s为dna标准参照物；1、2、3为重组质粒pgl3-ldha-promoter质粒双酶切的产物；
[0039]
图5为pgl3-ldha-promter测序线性化概括图；
[0040]
图6为pgl3-ldha-promter测序序列；
[0041]
图7为pgl3-ldha-promter测序峰图；
[0042]
图8为pgl3-ldha-promoter和pgl3-basic空载体分别与prl-tk海肾荧光素酶报告质粒(内参)共转染a2780细胞。转染24小时后，a2780细胞在5mm与20mm d-glucose中暴露三天后，pgl3-ldha-promoter活性。
[0043]
图9为pgl3-ldha-promoter和pgl3-basic空载体分别与prl-tk海肾荧光素酶报告质粒(内参)共转染afc细胞。转染24小时后，afc细胞在5mm与20mm d-glucose中暴露三天后，pgl3-ldha-promoter活性。
具体实施方式
[0044]
为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
[0045]
实施例1：一种基于人ldha基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体及其构建
[0046]
本发明提供一种基于人ldha基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体，将人ldha基因启动子连接到pgl3-basic质粒中，得到双荧光素酶报告基因载体pgl3-ldha-promter；其中，人ldha基因启动子为ldhamrna转录起始位点上游2000的位置，ldha基因启动子(homo sapiens chromosome 11,grch38.p14 primaryassembly)核苷酸序列如seq id no.1所示。pgl3-ldha-promter的核苷酸序列如seq id no.2所示。
[0047]
人ldha基因启动子核苷酸序列(seq id no.1)具体如下：
[0048]
gtgctgcagccgctgccgccgattccggatctcattgccacgcgcccccgacgaccgcccgacgtgcattcccggtacggtagggccctgcgcgcacggcgccagagggatgggcgggtagagccaactgcctctggttctgctggcctccgctgctcgcgaagggattcctgctcccgggaggtgtaggagccgctttccagaagcacagcccagagacgtctgggcggcggcccacacaacgcatgtgttcggagctcgccgcgctctgcttttgctctaagcgggaaccatggcttctggccacgctggggaaccgaggaggtggccgcacccaagcaggggtcgaaagcccgggtggatgcggaacaaggatatgataggccttaagggtgggggatacctctgggctcgaaatcggcgggcggtgcaaaactcgaggtccagttctcggagcccatagagccaaaaaagcctcagcttgtccggggcgggttcttgaaagacggaaagcggctgagtaccacgcggcttgcatttttctcttgggacgctcgagaggtgggctccgtgagggcagctgctgcctgcagattatagggagccctttgcgcatttattaagaagctactggtgtatctcgggctgcgctaggcacggcgcatgcaaagatgaagcaggcagcatcccagcccttccgcacctcagacggtcagttgagtaggatccgccggtaccaactcctccttttaacaaatagggagaccgaaagctaggagacagtcagggatctctaagttcccagtgagtaggaggcagaggtgaggtgtagaactcgtttttgcatgtctctcgcctctagacgcacccttccctcatcccatgccctcccacctccgcccctacattaaaggtagcattggatcccggggccgttcagtgaagctagcaggtgtccgcaggaactcccttccccctgccaggctagaaaccttacaaggctgtctagaaatagcagtgatttgtaaggagagacccggctccagcttggtgactctgggctgactgcctgcctagaggtcctctcggatttttgccctttggagtggtgtcaaaactagacgtgatactttggggatgcagcctgtgatatttcctccagcgaatgcagtgcagggttggattaacaaggtggaaagaattcgagggttccaccaagtagctattaactctagggctgcaggcctcaggccttctgcagctatttctacactccctgtactgaaactatttcttcatactgggcctgacaggcctttgcaacaaggatcacggccgaagccacaccgtgcgcctccctcccggttggttaacaggccctggtttctagtattgcgatttaaagtctggcgctggctgcgcgccagacctgggaggctgccagctaggcttcacgttgctggcgtctgcttcggggcattcattaggtctgaagtctgaatcccagctccctccctctcacccactgagctgcatagctccagattgcctctgcttacgggcggggcttctcagccttctgccttctggcccgatgcccgcttcccaacggccggaggccgctagactaatcggcttcgccctgcgcgctgtaatgcgcatgcgcacgcgcacaagttcctgggcccgcccatcttccggacttgggcggggcgtaaaagccgggcgttcggaggacccagcaattagtctgatttccgcccacctttccgagcgggaaggagagccacaaagcgcgcatgcgcgcggatcaccgcaggctcctgtgccttgggcttgagctttgtggcagttaatggcttttctgcacgtatctctggtgtttacttgagaagcctggctgtgtccttgctgtaggagccggagtagctcagagtgatcttgtctgaggaaaggccagccccacttggggttaataaaccgcgatgggtgaaccctcag
[0049]
pgl3-ldha-promter核苷酸序列(seq id no.2)：
[0050]
ggtaccgagctcttacgcgtgctagcccgggctcgagatctggcaatggaatcagcaagaatacaggcccagaggtaagtatgataagaaaacaaaaaattgagctgggcacggtggctcacgcctgtaatcccagctctttgtgaggccgaggcggccagatcacttgaggccaggagtttgagatcagcctgaccaacatggtgaaaccccgtctctactaaaaattacaaaaattagccgggcgtggtggcgcctggctgtaatcccatcttctcaggaggctgaggcaggagattcgcttgaacccgggaggcggaggttgcagtgagccgagatcagcccactgcactccagcctgggcgacagagcgactc
cgtttcaaaaaaaaaaaaattaataattaaaaaaaaaatcgcagggcaagtgggcgcgcttgtagtcccagtcacttcggggagccgaggtgggaggatcgcttgagccagaaggtcgaggctgcaggaagccatgatcacgccactgccctccagcctgggtgacagagtgagaccctgtctcgaaaaataccaaaaaacaaataaacaaacaaaaaaccaaaaccaaaaaaacaagccactgacagttcttgggtatggttgagactcgagatgagatgccagtggggtgggcagtagaaagtgcagaataaaatgtacatttgaactgagtcaccctgcaaggcctgagaggccaaggcttcactgtgagtgggagctggtaggcttagcagcagagggaaaagcagcgtcgagttttggaggtcactcgacttaggtaagaacagactgactgactgctaggcattttcttcctttcgttcaacaaatatttgtggagtgcctattacgtgccagaagctgttctggacactgagaaacagggatgaagaagaaacagatccaagccttcctgagagtaacctccccaggtttcatggatgaggaaactgaaggtcgtcctgactcaggctcatggctccgaccccggcttctgtggttggagggcagcaccttacttagactcccagcgcacgtggagcagtctgccggtcggttgtctggctgcgcgcgccacccgggcctctccagtgccccgcctggctcggcatccacccccagcccgactcacacgtgggttcccgcacgtccgccggccccccccgctgacgtcagcatagctgttccacttaaggcccctcccgcgcccagctcagagtgctgcagccgctgccgccgattccggatctcattgccacgcgcccccgacgagcgatctaagtaagcttggcattccggtactgttggtaaagccaccatggaagacgccaaaaacataaagaaaggcccggcgccattctatccgctggaagatggaaccgctggagagcaactgcataaggctatgaagagatacgccctggttcctggaacaattgcttttacagatgcacatatcgaggtggacatcacttacgctgagtacttcgaaatgtccgttcggttggcagaagctatgaaacgatatgggctgaatacaaatcac
[0051]
agaatcgtcgtatgcagtgaaaactctcttcaattctttatgccggtgttgggcgcgtta
[0052]
tttatcggagttgcagttgcgcccgcgaacgacatttataatgaacgtgaattgctcaac
[0053]
agtatgggcatttcgcagcctaccgtggtgttcgtttccaaaaaggggttgcaaaaaat
[0054]
tttgaacgtgcaaaaaaagctcccaatcatccaaaaaattattatcatggattctaaaac
[0055]
ggattaccagggatttcagtcgatgtacacgttcgtcacatctcatctacctcccggtttt
[0056]
aatgaatacgattttgtgccagagtccttcgatagggacaagacaattgcactgatcatg
[0057]
aactcctctggatctactggtctgcctaaaggtgtcgctctgcctcatagaactgcctgc
[0058]
gtgagattctcgcatgccagagatcctatttttggcaatcaaatcattccggatactgcga
[0059]
ttttaagtgttgttccattccatcacggttttggaatgtttactacactcggatatttgata
[0060]
tgtggatttcgagtcgtcttaatgtatagatttgaagaagagctgtttctgaggagcctt
[0061]
caggattacaagattcaaagtgcgctgctggtgccaaccctattctccttcttcgccaaa
[0062]
agcactctgattgacaaatacgatttatctaatttacacgaaattgcttctggtggcgctc
[0063]
ccctctctaaggaagtcggggaagcggttgccaagaggttccatctgccaggtatcagg
[0064]
caaggatatgggctcactgagactacatcagctattctgattacacccgagggggatgat
[0065]
aaaccgggcgcggtcggtaaagttgttccattttttgaagcgaaggttgtggatctgga
[0066]
taccgggaaaacgctgggcgttaatcaaagaggcgaactgtgtgtgagaggtcctatga
[0067]
ttatgtccggttatgtaaacaatccggaagcgaccaacgccttgattgacaaggatggat
[0068]
ggctacattctggagacatagcttactgggacgaagacgaacacttcttcatcgttgac
[0069]
cgcctgaagtctctgattaagtacaaaggctatcaggtggctcccgctgaattggaatcc
[0070]
atcttgctccaacaccccaacatcttcgacgcaggtgtcgcaggtcttcccgacgatga
[0071]
cgccggtgaacttcccgccgccgttgttgttttggagcacggaaagacgatgacggaa
[0072]
aaagagatcgtggattacgtcgccagtcaagtaacaaccgcgaaaaagttgcgcggag
[0073]
gagttgtgtttgtggacgaagtaccgaaaggtcttaccggaaaactcgacgcaagaaa
[0074]
aatcagagagatcctcataaaggccaagaagggcggaaagatcgccgtgtaattctaga
[0075]
gtcggggcggccggccgcttcgagcagacatgataagatacattgatgagtttggacaa
[0076]
accacaactagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgct
[0077]
ttatttgtaaccattataagctgcaataaacaagttaacaacaacaattgcattcatttta
[0078]
tgtttcaggttcagggggaggtgtgggaggttttttaaagcaagtaaaacctctacaaa
[0079]
tgtggtaaaatcgataaggatccgtcgaccgatgcccttgagagccttcaacccagtca
[0080]
gctccttccggtgggcgcggggcatgactatcgtcgccgcacttatgactgtcttcttta
[0081]
tcatgcaactcgtaggacaggtgccggcagcgctcttccgcttcctcgctcactgactc
[0082]
gctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatac
[0083]
ggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagca
[0084]
aaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgccccc
[0085]
ctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggact
[0086]
ataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccct
[0087]
gccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcaatg
[0088]
ctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgca
[0089]
cgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaa
[0090]
cccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagag
[0091]
cgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacact
[0092]
agaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagt
[0093]
tggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgca
[0094]
agcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacg
[0095]
gggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatc
[0096]
aaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaag
[0097]
tatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctca
[0098]
gcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacga
[0099]
tacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctca
[0100]
ccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtg
[0101]
gtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaa
[0102]
gtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgt
[0103]
cacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagtta
[0104]
catgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtca
[0105]
gaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctctta
[0106]
ctgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattct
[0107]
gagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccg
[0108]
cgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaa
[0109]
ctctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaac
[0110]
tgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggca
[0111]
aaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcc
[0112]
tttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaa
[0113]
tgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacc
[0114]
tgacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtg
[0115]
accgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctc
[0116]
gccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccga
[0117]
tttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaatttcccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagcccaagctaccatgataagtaagtaatattaaggtacgggaggtacttggagcggccgcaataaaatatctttattttcattacatctgtgtgttggttttttgtgtgaatcgatagtactaacatacgctctccatcaaaacaaaacgaaacaaaacaaactagcaaaataggctgtccccagtgcaagtgcaggtgccagaacatttctctatcgata
[0118]
二、双荧光素酶报告基因载体pgl3-ldha-promter的构建
[0119]
1.材料与方法
[0120]
1.1质粒和细胞
[0121]
pgl3-basic和海肾荧光素酶报告质粒prl-tk购自promega公司。本实施例所使用的细胞包括人卵巢癌上皮细胞a2780和原代培养人腹水提取卵巢癌细胞系(afc)，分别培养在含有10％血清(美国gibco公司)的dmem(美国gibco公司)中；培养基中含10μg/ml链霉素和100u/ml青霉素，所有细胞均培养在37℃、5％co2条件下的恒温培养箱中。pgl3-basic质粒的图谱如图1。
[0122]
1.2试剂
[0123]
本实施例所用的pcr引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；pcr premix taq
tm
购自takara公司；细胞总rna提取试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；质粒小提试剂盒及凝胶纯化试剂盒购自爱思进生物技术(杭州)有限公司；血液/细胞/组织基因组dna提取试剂盒及感受态大肠埃希菌dh5α购自碧云天生物技术有限公司；lps和atp购自sigma；限制性内切酶hind iii和bgl ii日本takara公司)；质粒转染试剂lipofectaminetm 3000(美国invitrogen公司)dual-glo luciferaseassay system购自碧云天生物技术有限公司。
[0124]
1.3方法
[0125]
1.3.1全基因组dna的提取
[0126]
提取人卵巢上皮细胞a2780的全基因组dna作为人ldha启动子区域序列pcr扩增的模板。首先，选取汇合度为80％的a2780细胞，经胰酶消化后，用含有10％血清的完全dmem终止消化，室温500rpm离心3min，弃上清液；pbs重悬后再次离心弃上清液，根据血液/细胞/组织基因组dna提取试剂盒说明书提取人卵巢上皮细胞a2780基因组dna。
[0127]
1.3.2pcr扩增人ldha启动子序列
[0128]
通过在ncbi genbank数据库中查询人ldha基因序列和真核生物启动子数据库(eukaryotic promoter database，epd)，获得包含可能的启动子及转录调节区域的人ldha基因序列。利用oligo 6.24软件设计pcr扩增引物对扩增启动子。ncbi验证pcr引物特异性(图2)。
[0129]
pcr扩增上游引物seq id no.3：
[0130][0131]
(下划线部分为bglii酶切位点，英文斜体部分为同源重组设计的序列以及保护碱基)；
[0132]
pcr扩增下游引物seqidno.4：
[0133][0134]
(下划线部分为hindⅲ酶切位点，英文斜体部分为同源重组设计的序列以及保护碱基)。
[0135]
以提取的人卵巢上皮细胞a2780全基因组dna为模版，pcr扩增人ldha基因启动子序列，扩增体系为：
[0136][0137]
*：50μlpcr反应体系中模板dna推荐使用量人基因组为0.1-1μg。
[0138]
premixtaq(extaqversion2.0plusdye)溶液组成：
[0139]
takaraextaq1.25u/25μl
[0140]
dntpmixture2
×
conc.各0.4mm
[0141]
extaqbuffer2
×
conc.4mmmg
2+
[0142]
pcr反应扩增程序为：
[0143][0144]
pcr扩增产物采用1％琼脂糖凝胶进行电泳，1％琼脂糖凝胶电泳结果显示，扩增片段位于1000bp与2000bp之间，与目标dna长度一致(图3)。pcr产物条带鉴定正确后，进行切胶回收纯化。
[0145]
1.3.3pgl3-ldha-promoter质粒的构建及鉴定
[0146]
(1)重组反应
[0147]
pgl3-basic质粒用bglii和hindiii经37℃2h双酶切，pgl3-basic的线性化质粒与上述切胶回收产物进行重组反应。
[0148]
重组反应的体系为：
[0149][0150]
重组反应的条件为：37℃30min，然后转移到冰上或-20℃上存储。
[0151]
(2)质粒转化至感受态细胞中
[0152]
从-70℃冰箱中取出感受态细胞置于冰上融化，如需分装可将刚融化的细胞悬液分装到无菌预冷的离心管中，再置于冰浴中。一次转化感受态细胞的建议用量为50-100μl，可以根据实际情况分装使用。应注意所用dna体积不要超过感受态细胞悬液体积的十分之一。以下实验以100μl感受态细胞为例。
[0153]
向感受态细胞悬液中加入目的dna(也就是上述重组后质粒)(1-10ng，且体积《10μl)，轻轻旋转离心管以混匀内容物，冰浴30分钟。将离心管置于42℃水浴中90秒，迅速将管转移到冰上3分钟。(注意该过程不要摇动离心管)。向离心管中加入900μl无菌lb培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃摇床振荡培养1小时(160-220转/分钟)。该步骤的目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。
[0154]
将已转化的感受态细胞低速离心(5000rpm，4分钟)后弃掉部分上清，保留100-150μl培养基，用移液器轻轻吹打悬浮菌体后，全部加到含相应抗生素的lb固体琼脂培养基上，或含x-gal、iptg及相应抗生素的lb琼脂平板表面，用无菌弯头玻棒铺菌器将细胞均匀涂开。如果预计的单克隆数量较多，可省略离心步骤，直接取200-300μl转化产物涂布平板(过多的菌液涂布可能会使单克隆菌落粘连在一起，难以挑取)。涂布后剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的转化菌落数过少可以将剩下的菌液再涂布至新的平板上。
[0155]
将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37℃培养12-16小时可出现单菌落。次日，随机挑选单克隆菌落于lb培养基中振荡培养、大量扩增并提取质粒。
[0156]
(3)pgl3-ldha-promoter质粒的鉴定
[0157]
将提取的重组质粒进行bgl ii和hind iii双酶切鉴定，同时送样生工生物工程(上海)股份有限公司测定核酸序列，并利用软件snap gene viewer比对测序结果。
[0158]
对pgl3-ldha promoter重组质粒进行bgl ii和hind iii双酶切鉴定，结果可见特异性片段，约为4817bp(载体片段)，如图4。重组质粒测序比对结果显示(图5、图6、图7)，插入的ldha启动子序列与理论序列一致，表明pgl3-ldha-promoter重组质粒构建成功。
[0159]
实施例2：萤火虫荧光素酶报告实验检测pgl3-ldha-promoter重组质粒在肿瘤细胞高糖环境暴露下疾病早筛中的应用。
[0160]
将a2780细胞与afc细胞系接种在48孔板中，待细胞密度达到80-90％时，使用lipofectaminetm 3000将pgl3-ldha-promoter重组质粒1μg、pgl3-basic空载体1μg分别与内参prl-tk质粒50ng共转入a2780细胞与afc细胞，24h后加入终浓度为5mm与20mm的d-glucose。24h后，收取细胞，根据dual-glo luciferaseassay system试剂盒(碧云天)说明书检测相应组别的荧光素酶活性，相对荧光素酶活性的值＝[荧光(pgl3-ldha-promoter)-荧光(pgl3-basic)]/荧光(prl-tk)。样品相对荧光素酶活性的值等于每组中每个独立实验
的相对萤火虫荧光素酶平均值，使用prism对数据进行统计分析，两两比较采用one way anova检验，p＜0.05为差异有统计学意义。
[0161]
荧光素酶活性检测结果显示，表达pgl3-ldha-promoter细胞中的荧光素酶活性，较无启动子活性的pgl3-basic阴性对照增加约2倍(p＜0.05)，而表达pgl3-ldha-promoter细胞中的荧光素酶活性，较无启动子活性的pgl3-basic阴性对照在高糖处理下增加约3倍(p＜0.01)，表明人ldha基因启动子在高糖暴露下，拥有显著的高活性(图8，图9)。
[0162]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种基于人ldha基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体，其特征在于，所述基于人ldha基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体记为pgl3-ldha-promoter，其核苷酸序列如seq id no.2所示。2.权利要求1所述基于人ldha基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)以人卵巢上皮细胞a2780全基因组dna为模板，利用核苷酸序列如seq id no.3和seq id no.4所示的引物对，进行pcr扩增，得到ldha基因启动子；(2)使用限制性内切酶bgl ii和hind iii对pgl3-basic质粒进行双酶切，得到pgl3-basic的线性化质粒；(3)将步骤(1)得到的ldha基因启动子和步骤(2)得到的pgl3-basic的线性化质粒进行重组反应；(4)将步骤(3)所得重组产物转入感受态细胞中，挑取单克隆进行电泳验证、酶切验证和测序鉴定，得到基于人ldha基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述pcr扩增的体系为：步骤(1)中所述pcr扩增的程序为：4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中所述重组反应的体系为：步骤(3)中所述重组反应的体系为：插入片段ldhapromoter与线性化载体的摩尔比＝1:2～1:5。5.人ldha基因启动子的双荧光素酶识别系统，其特征在于，其包括权利要求1所述基于人ldha基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体、pgl3-basic质粒和内参prl-tk质粒。6.权利要求1所述基于人ldha基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体在检测细胞中
人ldha基因启动子活性中的应用。7.一种检测细胞中人ldha基因启动子活性的方法，其特征在于，所述方法为：将pgl3-ldha-promoter、pgl3-basic分别与内参prl-tk质粒共转入细胞中，检测相对荧光素酶活性的值，相对荧光素酶活性的值＝[荧光(pgl3-ldha-promoter)-荧光(pgl3-basic)]/荧光(prl-tk)，基于相对荧光素酶活性的值判定人ldha基因启动子活性，所述相对荧光素酶活性的值越大，人ldha基因启动子活性越强。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述pgl3-ldha-promoter或pgl3-basic质粒的质量为1μg，所述内参prl-tk质粒的质量为50ng；优选地，所述细胞为肿瘤细胞。9.权利要求1所述基于人ldha基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体，或权利要求6所述人ldha基因启动子的双荧光素酶识别系统在制备肿瘤疾病筛查试剂盒或肿瘤治疗药物筛选试剂盒中的应用，其特征在于，在进行肿瘤疾病的筛查时，通过权利要求7所述方法检测待测样本细胞和已知对照组标准肿瘤细胞的相对荧光素酶活性的值，比较两者的大小，从而实现对肿瘤疾病进程的预测与判断；在进行肿瘤治疗药物的筛选时，通过权利要求7所述方法检测施加待测肿瘤治疗药物和未施加待测肿瘤治疗药物的肿瘤细胞的相对荧光素酶活性的值，比较两者的大小，从而实现对肿瘤治疗药物的筛选。10.权利要求1所述基于人ldha基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体或权利要求6所述人ldha基因启动子的双荧光素酶识别系统在制备糖尿病筛查试剂盒或降血糖药物筛选试剂盒中的应用，其特征在于，在进行糖尿病的筛查时，通过权利要求7所述方法检测待测样本细胞和已知对照组标准糖尿病细胞的相对荧光素酶活性的值，比较两者的大小，从而实现对糖尿病进展的预测与判断；在进行降血糖药物的筛选时，通过权利要求7所述方法检测施加待测降血糖药物和未施加待测降血糖药物的糖尿病患者细胞的相对荧光素酶活性的值，比较两者的大小，从而实现对降血糖药物的筛选。

技术总结
本发明公开了一种基于人LDHA基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体及其构建方法和应用，该双荧光素酶报告基因载体记为pGL3-LDHA-promote核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，利用高效酶和同源重组原理，利用BgLII以及HindⅢ完成了LDHA基因启动子目的片段与pGL3-Basic线性化载体的克隆重组获得，双酶切的方法可以极大的降低载体的自连，提高重组载体的阳性率。pGL3-LDHA-promote可实现对LDHA启动子表达量进行敏感识别和准确的检测。子表达量进行敏感识别和准确的检测。子表达量进行敏感识别和准确的检测。


技术研发人员：黄晶 维杰
受保护的技术使用者：清华大学深圳国际研究生院
技术研发日：2023.04.11
技术公布日：2023/7/25