一种铜绿假单胞菌简易定性检测方法

1.本发明涉及一种铜绿假单胞菌简易定性检测方法，属于环境检测、食品安全及微生物应用技术领域。


背景技术：

2.铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)原称绿脓杆菌，在自然界分布广泛，本菌普遍存在，而在潮湿环境尤甚。
3.本菌为条件致病菌，是医院内感染的主要病原菌之一。经常引起术后伤口感染，也可引起褥疮、脓肿、化脓性中耳炎等。本菌引起的感染病灶可导致血行播散，而发生菌血症和败血症。烧伤后感染了铜绿色假单胞菌可造成死亡。该菌通常伴随毒力较强的细菌存在于病灶中，但偶尔也可单独引起暴露于外部的组织感染。感染通常发生于医院内，洗涤槽、防腐溶液和贮尿容器中常可发现这种细菌。通过医护人员可将病菌传给病人，特别在灼伤和新生儿重症监护室。是重要的医院内病原菌。铜绿假单胞菌引起的很多感染发生在衰弱或免疫受损的住院病人，它是重症监护室感染的第二位最常见的病原菌，是呼吸机相关性肺炎的常见原因。铜绿假单胞菌感染可发生于很多解剖部位，包括皮肤、皮下组织、骨、耳、眼、尿路和心脏瓣膜。感染部位与细菌的入口及病人的易感性有关。烧伤时，焦痂下区域可成为大量细菌侵犯的场所，进而成为引起菌血症的病灶，而菌血症常是烧伤的致死性并发症。热带气候条件下常见的外耳炎流脓是耳部铜绿假单胞菌感染最常见的临床类型。糖尿病患者可发生更为严重的恶性外耳炎，表现为严重耳痛常伴有单侧颅神经麻痹，需要肠外给药治疗。
4.由于铜绿假单胞菌在自然界广泛存在，一些食品比如水果、蔬菜也极易受到该菌的污染。而对食品生产环境及食品中铜绿假单胞菌的监测和检测，在食品安全中显得较为重要。
5.目前，用于检测铜绿假单胞菌的检测方法主要是基于铜绿假单胞菌特异性基因序列的pcr(聚合酶链式反应)技术及测序分析技术。该类技术具有灵敏度高、能够定量检测的优势，但是该类技术的普遍应用也具有较大的局限性，因为该类检测技术的应用不仅对操作平台要求特别高包括拥有用于基因扩增的pcr仪器、凝胶成像仪等成本较高的配套设备，而且对操作人员也具有较高的专业素养要求包括对pcr反应后基因片段的生物信息学分析专业知识的熟练掌握。此外，很多情况下，定性检测完全可以满足需求比如感染组织的菌培养、医院环境消毒的效果评价。因此，开发一种对铜绿假单胞菌进行简易定性检测技术较为重要。


技术实现要素：

6.本发明的目的之一在于提供一种氨水培养基。
7.本发明所提供的氨水培养基，其配方为：蔗糖50g/l；k2hpo42g/l；nacl2g/l；mgso4.7h2o0.5g/l；feso4.7h2o0.1g/l；1％znso45ml；氨水0.1-10ml/l。
8.本发明的另一目的是提供一种培养基组合。
9.本发明所提供的培养基组合包括上述氨水培养基、lb培养基和pd培养基，其中，所述lb培养基的配方为：蛋白胨10g/l，氯化钠10g/l，酵母提取物5g/l；
10.所述pd培养基的配方为：马铃薯200g/l，葡萄糖10g/l，121℃灭菌20min。
11.上述氨水培养基及培养基组合在铜绿假单胞菌定性检测中的应用也属于本发明的保护范围。
12.本发明的再一目的是提供一种铜绿假单胞菌定性检测方法。
13.本发明所提供的铜绿假单胞菌定性检测方法，包括如下步骤：
14.1)采集样品；
15.2)将采集的样品接种至氨水培养基中培养；
16.3)将所得培养物分别接种至氨水培养基、lb培养基和pd培养基中培养；
17.4)观察步骤3)中各菌液的生长情况及颜色变化，若采用氨水培养基培养的菌液呈白色，采用lb培养基培养的菌液呈绿色，且采用pd培养基培养的菌液呈浅粉红色，则判定所述样品含有铜绿假单胞菌，反之，则判定所述样品不含铜绿假单胞菌。
18.上述方法步骤1)中，所述样品可为液体或固体，若为固体则进行碾碎或粉碎；
19.所述样品可为环境样品，如水、土壤，也可为组织样品，还可为食品。
20.上述方法步骤2)中，样品与氨水培养基的配比可为：1:1000-1:10(单位为g/ml或者ml/ml)；
21.所述培养的条件为：20-35℃,50-200rpm条件下，培养2-5h；
22.上述方法步骤3)中，培养物与氨水培养基、lb培养基或pd培养基的配比均可为：1:1000-1:10(单位为g/ml或者ml/ml)；
23.所述培养的条件为：20-35℃,50-200rpm条件下，培养5-20h。
24.本发明采用氨水培养基预培养结合氨水培养基、lb培养基和pd培养基分别培养，通过判定菌液在氨水培养基、lb培养基和pd培养基中的生长情况及颜色变化来定性检测体系是否含有铜绿假单胞菌，所述方法操作简单，且不需要复杂的仪器，也不要求操作人员必须具备较高的专业素养，具有推广价值。
附图说明
25.图1为本发明定性检测铜绿假单胞菌的操作流程图。
26.图2为本发明实施例1中样品a检测结果。
27.图3为本发明实施例2中样品b检测结果。
具体实施方式
28.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
29.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
30.实施例1、铜绿假单胞菌污染土壤样品及未污染土壤样品的简易检测及鉴别
31.待检测对象：
32.被铜绿假单胞菌污染的土壤样品(来源为北京市农林科学院植物保护研究所生防微生物研究室，经pcr及16srrna基因测序现有方法检测含有铜绿假单胞菌)-命名为样品a
33.未被铜绿假单胞菌污染的土壤样品(北京市农林科学院植物保护研究所生防微生物研究室，经pcr及16srrna基因测序现有方法检测不含铜绿假单胞菌)-命名为样品b
34.准备三种培养基：氨水培养基(蔗糖50g/l；k2hpo42g/l；nacl2g/l；mgso4.7h2o0.5g/l；feso4.7h2o0.1g/l；1％znso45ml；氨水5ml/l，请给出氨水的具体浓度)、pd培养基(马铃薯200g/l，葡萄糖10g/l，121℃灭菌20min)、lb培养基(蛋白胨10g/l，氯化钠10g/l，酵母提取物5g/l)
35.操作过程
36.(1)分别称取样品a，5克；样品b，5克；
37.(2)无菌条件下，把称取的样品a和b分别接种于200ml氨水培养基中；
38.(3)把以上接种的培养基在25℃，150rpm条件下，培养3h；
39.(4)无菌条件下，把(3)中培养的样品a和样品b培养物，各取500微升，然后分别接种于相对应的三种培养基(100ml，三种培养基的体积相同)中进行摇瓶培养，6个摇瓶分别标记为：瓶a-nh3.h2o/瓶a-lb/瓶a-pd和瓶b-nh3.h2o/瓶b-lb/瓶b-pd；
40.(5)摇瓶培养：25℃，150rpm条件下，培养15h；
41.(6)观察菌体生成情况及菌液颜色变化；
42.检测结果：
43.样品a接种的三个瓶最终显色结果为a-nh3.h2o-白色/瓶a-lb-绿色/瓶a-pd-浅色粉红色(见图2)，此显色结果表明样品a为阳性，即样品a含有铜绿假单胞菌；样品b接种的三个瓶最终显色结果为瓶b-nh3.h2o-白色/瓶b-lb泛黄色/瓶b-pd乳白色(见图3)，此显色结果表明样品b为阴性，即样品b不含有铜绿假单胞菌。
44.通过本发明方法检测鉴别样品a含有铜绿假单胞菌，样品b不含有铜绿假单胞菌，和样品实际情况相符。
45.实施例2、铜绿假单胞菌检测方法的特异性考察
46.选择铜绿假单胞菌、丁香假单胞菌、姜黄假单胞菌、反应假单胞菌、托拉斯假单胞菌、荧光假单胞菌、美洲欧文氏菌、液化沙雷氏菌、树生黄单胞菌(树生黄单胞菌李致病变种xanthomonasarboricolapv.pruni)、成团泛菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、高地芽孢杆菌、哈次木霉、木贼镰刀菌、美极梅奇酵母菌、季也蒙毕赤酵母、巴斯德毕赤酵母、粘红酵母菌、出芽短梗霉、葡萄汁有孢汉逊酵母菌等菌种作为供试菌株，对本发明方法进行应用验证。供试菌株来自北京市农林科学院植物保护研究所生防微生物研究室。所选择供试菌株涵盖了细菌、真菌、放线菌三大类微生中的15个典型属的微生物种类。
47.表1.用于本发明方法的应用检测效果的供试菌株
[0048][0049][0050]
以上菌株分别按照本发明实施例1的方法进行按照发明技术中方法培养操作：lb中培养，然后氨水培养基中培养、lb培养基、pd培养基。观察颜色变化。若符合方法中描述不同培养基中显色种类和顺序的鉴定为铜绿假单胞菌。
[0051]
表2.利用本方法对具有代表性的26株供试菌株检测结果
[0052][0053][0054]
**菌株符合在“在氨水培养基中生长显示白色-lb培养基中生长显示绿色-pd培养
基中显示粉红色”的标准，即各项显色指标为阳性的(+)，被确定为铜绿假单胞菌。
[0055]
通过培养观察，供试26种微生物中，只有编号为1的菌株符合在“在氨水培养基中生长显示白色-lb培养基中生长显示绿色-pd培养基中显示粉红色”的标准，符合本方法的鉴定标准，被鉴定为铜绿假单胞菌(见表2.)；而其他菌株不符合标准，鉴定为非铜绿假单胞菌。本方法鉴定结果和供试菌株实际信息相符即只有编号1菌株为铜绿假单胞菌。由此判定，本发明的方法具有特异性。
[0056]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

技术特征：
1.一种氨水培养基，其配方为：蔗糖50g/l；k2hpo42g/l；nacl2g/l；mgso4.7h2o0.5g/l；feso4.7h2o0.1g/l；1％znso45ml；氨水0.1-10ml/l。2.一种培养基组合，包括权利要求1所述的氨水培养基、lb培养基和pd培养基。3.根据权利要求2所述的培养基组合，其特征在于：所述lb培养基的配方为：蛋白胨10g/l，氯化钠10g/l，酵母提取物5g/l；所述pd培养基的配方为：马铃薯200g/l，葡萄糖10g/l，121℃灭菌20min。4.权利要求1所述的氨水培养基或权利要求2或3所述的培养基组合在铜绿假单胞菌定性检测中的应用。5.一种铜绿假单胞菌定性检测方法，包括如下步骤：1)采集样品；2)将采集的样品接种至氨水培养基中培养；3)将所得培养物分别接种至氨水培养基、lb培养基和pd培养基中培养；4)观察步骤3)中各菌液的生长情况及颜色变化，若采用氨水培养基培养的菌液呈白色，采用lb培养基培养的菌液呈绿色，且采用pd培养基培养的菌液呈浅粉红色，则判定所述样品含有铜绿假单胞菌，反之，则判定所述样品不含铜绿假单胞菌。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤1)中，所述样品为液体或固体，样品为固体，先进行碾碎或粉碎。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤2)中，样品与氨水培养基的配比为：1:1000-1:10，g/ml或者ml/ml；所述培养的条件为：20-35℃,50-200rpm条件下，培养2-5h。8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤3)中，培养物与氨水培养基、lb培养基或pd培养基的配比均为：1:1000-1:10，g/ml或者ml/ml；所述培养的条件为：20-35℃,50-200rpm条件下，培养5-20h。

技术总结
本发明公开了一种铜绿假单胞菌简易定性检测方法。包括如下步骤：1)采集样品；2)将采集的样品接种至氨水培养基中培养；3)将所得培养物分别接种至氨水培养基、LB培养基和PD培养基中培养；4)观察步骤3)中各菌液的生长情况及颜色变化，若采用氨水培养基培养的菌液呈白色，采用LB培养基培养的菌液呈绿色，且采用PD培养基培养的菌液呈浅粉红色，则判定所述样品含有铜绿假单胞菌，反之，则判定所述样品不含铜绿假单胞菌。本发明方法操作简单，且不需要复杂的仪器，也不要求操作人员必须具备较高的专业素养，具有推广价值。具有推广价值。具有推广价值。


技术研发人员：张殿朋 刘建斌 卢彩鸽 杨俊刚 武凤霞 王甲辰
受保护的技术使用者：北京市农林科学院
技术研发日：2023.04.06
技术公布日：2023/7/25