一种基于纸基微流控芯片的快速核酸检测方法与流程

1.本发明涉及分子诊断技术领域，尤其涉及一种基于纸基微流控芯片的快速核酸检测方法。


背景技术：

2.分子诊断已成为疾病诊断、检验检疫领域应用最广泛的技术领域。核酸检测因其具有高敏感性、特异性，在各领域得到了广泛的应用。在众多检测技术中，逆转录环介导等温扩增法(rt-lamp)具有反应过程无需变温、扩增速度快、操作简便等优点，适用于现场检测，现已在诊断领域有很多研究和应用。
3.但是，现有的逆转录环介导等温扩增法却仍有诸多不便。例如，其反应阶段仍需要专业人员在实验室环境下进行。虽然目前有可供户外反应使用的便捷式化学加热杯，但其仍有非实验室环境下容易出现的反应温度不均匀的问题，易导致发生其他分子和/或靶点的非特异性交叉结合，干扰结果。
4.在采样方面，目前仍存在采集的样品在反应前需特殊纯化处理的问题，甚至需要特定的环境保存样品。在现有的比色检测中，为了显色需要使用的试剂繁多，反应步骤过多且需要封闭的容器或暗环境，特定的激发光源等方可反应；主流的比色检测机制，例如基于链霉亲和素-生物素对金纳米颗粒的结合机制在比色阶段会因与其他分子非特异性交叉结合而干扰结果。以上种种缺陷都反映了目前难以在现场快速实现准确的便携化核酸检测的现实。最新的检测手法如纸基微流控芯片仍有体积较大(所设计芯片的结构较大且复杂)，反应时间长(需固定温度加热30～40min进行rt-lamp反应)，设计结构复杂(需要多层结构实现吸附样品分离除杂等不同的功能)等问题，而且对样品仍有限制，较小的污染物也会影响结果判定。同时，肉眼观察对结果的确认有一定误差。
5.因此，建立一种可以脱离实验室环境、操作流程简单、检测灵敏精确的采检一体的现场核酸检测方法对现场快速核酸检测具有重要价值。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种基于纸基微流控芯片的快速核酸检测方法，可以脱离实验室环境、操作流程简单、检测灵敏精确。
7.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
8.本发明提供了一种基于纸基微流控芯片的快速核酸检测方法，包括以下步骤：
9.将色谱纸依次进行裁剪、打蜡和加热，得到纸基微流控芯片；所述纸基微流控芯片设置有装样区、主通道过滤区和检样区，所述装样区的形状为5
×
5mm的正方形，所述主通道过滤区的形状为3
×
30mm的长方形，所述检样区的形状为直径5mm的圆形；
10.将待检样品加载到所述装样区，直至待检样品转移至检样区，将所述检样区对应的纸条剪下后，在所得检样区纸条上加入比色染料，进行rt-lamp反应，得到反应后检样区纸片；
11.采用cmos阵列智能手机在环境照明条件下对所述反应后检样区纸片进行拍摄，将所得原始图像转化为rgb图像，使用图像处理软件比较红色光强度与绿色光强度的比值，得出核酸检测结果。
12.优选的，所述色谱纸为孔径20～25μm的whatmang4级色谱纸。
13.优选的，在所述主通道过滤区上进行打蜡，所述加热采用加热板进行；所述加热的温度为120℃，时间为5min。
14.优选的，所述待检样品包括水、尿液或血浆。
15.优选的，所述待检样品中病毒的浓度为1～10拷贝/微升。
16.优选的，所述比色染料以rt-lamp混合液的形式使用，所述rt-lamp混合液由2.5μl引物与12.5μlrt-lampcolorimetricmastermix比色染料混合组成。
17.优选的，在所得检样区纸条上加入比色染料后，将所得检样区纸片夹入载玻片之间密封。
18.优选的，所述rt-lamp反应的温度为68℃，时间为10～15min。
19.本发明提供了一种基于纸基微流控芯片的快速核酸检测方法，本发明通过毛细作用的原理及电荷强弱的差别，将待检样品中的核酸与其他蛋白质和细胞片段等杂质自发流动分离，目标rna被推向芯片末端的检样区，切下检样区后在其上加入比色染料，进行扩增，通过智能手机捕捉图像来原位监测芯片的颜色变化以确认检测结果。本发明的方法具有加热充分均匀、便于保存携带(芯片形状尺寸小)、核酸分离脱杂效果好(待检样品利用毛细作用经过主通道流至检样区后即可完好分离杂质与核酸)、智能手机实时检测(手机拍照的清晰度足以准确分析，且能转化图像分析g/r比值)、比色明显(由原来的橘红色转变为黄色)等显著优势。本发明的方法检测灵敏度高(最低检测限度为1拷贝/微升)，反应速度更快(rt-lamp反应15min后即可明显区分阴阳性)。本发明的方法可以让非专业人员仅依靠少量试剂与材料进行采样，使用一部智能手机即可准确分析检测结果，是一种便携的采检一体的现场快速核酸检测技术。
20.本发明采用纸基微流控芯片，造价便宜，轻薄便于加热，可通过简单的蜡印制作成两端为液体流动的亲水区域和中间为经过蜡封的疏水区域。
21.本发明的原材料简单易生产，成本低廉，设计更加优化，减少了空间占用。本发明不需要复杂的多层结构，只需一层纸基微流控芯片，形状为长条状，尺寸小，方便加工携带。
22.本发明的采样方式简单，无需预处理样品，分离核酸过程在主通道过滤区全封闭，减少污染，只需将样品滴在检样区即可分离核酸。
23.进一步，本发明在比色阶段使用基于ph、无需额外激发光源、可在环境光下识别的比色指示试剂盒，搭配智能手机进行检测，使肉眼无法区分的可疑检测结果得到准确检测，无需试验室环境；本发明抛弃了其他传统的比色染料(如无色结晶紫、孔雀绿等)，且无需使用荧光染料，明显降低荧光染料产生的高成本。
24.进一步的，本发明以加热板作为加热方式，反应过程受热全面且均匀，不依赖试验室环境。
附图说明
25.图1为实施例1中纸基微流控芯片的制备过程示意图；
26.图2为实施例1中待检样品的加载过程示意图；
27.图3为实施例1中检样区的rt-lamp反应示意图；
28.图4为不同待检样品的智能手机拍照处理结果；
29.图5为不同待检样品的智能手机图像中绿色/红色(g/r)强度值数据图。
具体实施方式
30.本发明提供了一种基于纸基微流控芯片的快速核酸检测方法，包括以下步骤：
31.将色谱纸依次进行裁剪、打蜡和加热，得到纸基微流控芯片；所述纸基微流控芯片设置有装样区、主通道过滤区和检样区，所述装样区的形状为5
×
5mm的正方形，所述主通道过滤区的形状为3
×
30mm的长方形，所述检样区的形状为直径5mm的圆形；
32.将待检样品加载到所述装样区，直至待检样品转移至检样区，将所述检样区对应的纸条剪下后，在所得检样区纸条上加入比色染料，进行rt-lamp反应，得到反应后检样区纸片；
33.采用cmos阵列智能手机在环境照明条件下对所述反应后检样区纸片进行拍摄，将所得原始图像转化为rgb图像，使用图像处理软件比较红色光强度与绿色光强度的比值，得出核酸检测结果。
34.在本发明中，若无特殊说明，所需材料或设备均为本领域技术人员熟知的市售商品。
35.本发明将色谱纸依次进行裁剪、打蜡和加热，得到纸基微流控芯片。
36.在本发明中，所述色谱纸优选为孔径20～25μm的whatmang4级色谱纸。
37.本发明优选采用设计软件将所述色谱纸设计为所需形状后进行裁剪，得到所需尺寸的芯片。
38.本发明优选在所述主通道过滤区上进行打蜡，本发明优选使用蜡打印机进行打蜡。
39.在本发明中，所述加热优选采用加热板进行；所述加热板优选为便携式加热板；所述加热的温度优选为120℃，时间优选为5min；本发明使用小型便携式加热板，纸片与加热板平行保证充分加热。本发明通过加热使得印在芯片上的蜡在色谱纸上产生深度的疏水屏障。
40.在本发明中，所述纸基微流控芯片设置有装样区、主通道过滤区和检样区，所述装样区的形状为5
×
5mm的正方形，所述主通道过滤区的形状为3
×
30mm的长方形，所述检样区的形状为直径5mm的圆形。本发明设置装样区与检样区不同形状，便于区分两区，防止实操过程中混淆将装样区裁下。
41.在本发明中，所述装样区为起始段，所述主通道过滤区用于过滤掉待检样品中的生物大分子，待见样品通过毛细管作用沿着主通道自发流动，目标rna随着液体流向芯片的检样区(圆形末端)。
42.得到纸基微流控芯片后，本发明将待检样品加载到所述装样区，直至待检样品转移至检样区，将所述检样区对应的纸条剪下后，在所得检样区纸条上加入比色染料，进行rt-lamp反应，得到反应后检样区纸片。
43.在本发明中，所述待检样品优选包括水、尿液或血浆，当所述待检样品为水或尿液
时，无需稀释或处理，直接使用；当所述待检样品为血浆时，使用plasmalyte将血浆的浓度稀释至体积浓度10％，作为待检样品。在本发明中，所述待检测样品中病毒的浓度优选为1～10拷贝/微升。本发明对所述待检样品中所检测的病毒种类没有特殊的限定；在本发明的实施例中，具体为寨卡病毒(zikv)，待检样品中病毒的浓度具体为10拷贝/微升。
44.本发明对所述待检样品的用量没有特殊的限定，根据实际需求调整即可，在本发明的实施例中，具体是50μl。
45.将待检样品加载到所述装样区后，待检样品液体将通过色谱纸所产生的毛细管作用沿着主通道自发流动，大的生物分子早在通道开始时被过滤掉，目标rna则随着液体流向芯片的圆形末端(检样区)。
46.本发明通过毛细作用使待检样品不需要外部泵或泵送机构自发流动分离，将待检样品滴在装样区，色谱纸中的纤维素由于其有强负电性，可将目标rna(强负电荷)与其他蛋白质和细胞片段等杂质(弱得多的负电荷)分离。随着毛细作用液体流动，目标rna被推向纸条的末端，而蛋白质和细胞碎片的移动会随着留存时间的增加而变慢，从而在芯片的末端分离得到目标rna。切下检样区，加入rt-lamp反应混合物，扩增后观察到可见颜色变化，通过智能手机的捕捉图像原位监测纸张的颜色变化进行定量以确认结果。
47.当待检样品全部移至检样区后，本发明将所述检样区对应的纸条剪下后，在所得检样区纸条上加入比色染料，进行rt-lamp反应，得到反应后检样区纸片。
48.在本发明中，所述比色染料优选以rt-lamp混合液的形式使用，所述rt-lamp混合液优选由2.5μl引物与12.5μlrt-lampcolorimetricmaster mix比色染料混合组成。
49.本发明对所述rt-lamp混合液的用量没有特殊的限定，根据实际需求调整即可；在本发明的实施例中，具体为15μl。
50.在所得检样区纸条上加入比色染料后，本发明优选将所得检样区纸片夹入载玻片之间密封，以防止蒸发。
51.在本发明中，所述rt-lamp反应的温度优选为68℃，时间优选为10～15min。所述rt-lamp反应所需温度优选通过温差不超过1℃的加热板提供。本发明通过rt-lamp反应实现扩增。
52.得到反应后检样区纸片后，本发明采用cmos阵列智能手机在环境照明条件下对所述反应后检样区纸片进行拍摄，将所得原始图像转化为rgb图像，使用图像处理软件比较红色光强度与绿色光强度的比值，得出核酸检测结果。
53.在本发明中，所述图像处理软件优选为手机相关软件(colormeter色彩测量工具)或imagej软件，计算g/r比值。
54.本发明对所述cmos阵列智能手机以及拍摄和转化图像的过程没有特殊的限定，按照本领域熟知的过程进行即可。
55.本发明对所述红色光强度与绿色光强度的比值没有特殊的限定，通过阴阳性的比对确认检测结果即可。
56.下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
57.实施例1
58.1、纸基微流控芯片的制备(如图1所示)
59.选用孔径20～25μm的whatmang4级色谱纸，使用软件设计裁剪纸基微流体芯片，芯片由5
×
5mm的正方形起始段(装样区)，连接到3
×
30mm的主通道以及5mm直径的圆形末端(检样区)组成，使用蜡打印机在设计好的纸基微流控芯片的主通道上打蜡，使用设定在120℃的加热板将印在芯片上的蜡再加热5min，完成纸基微流控芯片的制备。
60.2、待检样品的加载(如图2所示)
61.将50μl不同的待检样品(阴性样品分别为水、尿液、血浆；阳性样品分别为：将寨卡病毒(zikv)加入水，所得混合液作为水的待检样品；将尿液与寨卡病毒混合，作为尿液的待检样品；人血浆使用plasmalyte稀释至体积浓度10％，加入寨卡病毒，作为血浆待检样品；阳性待检样品中寨卡病毒的浓度均为10拷贝/微升)，分别移液加载到装样区，直至待检样品通过毛细作用全部移至检样区。
62.3.检样区的rt-lamp反应(如图3所示)
63.将不用样品对应的检样区的纸片修剪下来，移液加入15μl的rt-lamp混合液(由2.5μl的引物与12.5μl的rt-lampcolorimetricmastermix比色染料混合组成)，将检样区纸片夹入载玻片之间密封，平整置于温差不超过1℃的加热板上，以68℃加热15min，进行rt-lamp反应。
64.4.智能手机拍照分析
65.纸片在加热结束反应后，使用智能手机相机(cmos阵列)在环境照明条件下对检样区纸片进行拍摄，将原始图像转化为rgb图像，结果如图4所示，并使用imagej软件比较其红色光与绿色光强度的比值g/r，确认结果。
66.图5为不同待检样品的智能手机图像中绿色/红色(g/r)强度比值数据图，根据图5可以确定，扩增后，纸上的颜色从淡橘红色(红色带淡绿色)变为黄色(红色+绿色)，绿色相对增多，红色基本保持不便，致使绿色/红色比值升高，从而能够实现阳性和阴性的快速判定。尿液的区分度虽然不大，但可以通过微流控芯片将目标rna分离出来并扩增。
67.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种基于纸基微流控芯片的快速核酸检测方法，其特征在于，包括以下步骤：将色谱纸依次进行裁剪、打蜡和加热，得到纸基微流控芯片；所述纸基微流控芯片设置有装样区、主通道过滤区和检样区，所述装样区的形状为5
×
5mm的正方形，所述主通道过滤区的形状为3
×
30mm的长方形，所述检样区的形状为直径5mm的圆形；将待检样品加载到所述装样区，直至待检样品转移至检样区，将所述检样区对应的纸条剪下后，在所得检样区纸条上加入比色染料，进行rt-lamp反应，得到反应后检样区纸片；采用cmos阵列智能手机在环境照明条件下对所述反应后检样区纸片进行拍摄，将所得原始图像转化为rgb图像，使用图像处理软件比较红色光强度与绿色光强度的比值，得出核酸检测结果。2.根据权利要求1所述的快速核酸检测方法，其特征在于，所述色谱纸为孔径20～25μm的whatmang4级色谱纸。3.根据权利要求1所述的快速核酸检测方法，其特征在于，在所述主通道过滤区上进行打蜡，所述加热采用加热板进行；所述加热的温度为120℃，时间为5min。4.根据权利要求1所述的快速核酸检测方法，其特征在于，所述待检样品包括水、尿液或血浆。5.根据权利要求1所述的快速核酸检测方法，其特征在于，所述待检样品中病毒的浓度为1～10拷贝/微升。6.根据权利要求1所述的快速核酸检测方法，其特征在于，所述比色染料以rt-lamp混合液的形式使用，所述rt-lamp混合液由2.5μl引物与12.5μlrt-lampcolorimetricmastermix比色染料混合组成。7.根据权利要求1所述的快速核酸检测方法，其特征在于，在所得检样区纸条上加入比色染料后，将所得检样区纸片夹入载玻片之间密封。8.根据权利要求1所述的快速核酸检测方法，其特征在于，所述rt-lamp反应的温度为68℃，时间为10～15min。

技术总结
本发明提供了一种基于纸基微流控芯片的快速核酸检测方法，属于分子诊断技术领域。本发明通过毛细作用的原理及电荷强弱的差别，将待检样品中的核酸与其他蛋白质和细胞片段等杂质自发流动分离，目标RNA被推向芯片末端的检样区，切下检样区后在其上加入比色染料，进行扩增，通过智能手机捕捉图像来原位监测芯片的颜色变化以确认检测结果。本发明的方法具有加热充分均匀、便于保存携带、核酸分离脱杂效果好、智能手机实时检测、比色明显等显著优势。比色明显等显著优势。比色明显等显著优势。


技术研发人员：陈泽良 刘世巍 范首东 高伟誉 牛敬淇 韩小虎 张燚
受保护的技术使用者：东沃同泰（凤城）生物工程有限公司
技术研发日：2023.03.21
技术公布日：2023/7/25