一种用于制备外泌体的脐带间充质干细胞的培养方法与流程

1.本发明涉及干细胞培养技术领域，特别涉及一种用于制备外泌体的脐带间充质干细胞的培养方法。


背景技术：

2.间充质干细胞(msc)是一种非成熟细胞，具备自我复制和多向分化能力，存在于成人和新生儿组织中。间充质干细胞分泌的外泌体可继承间充质干细胞的诸多治疗特性，具有分化潜能高、移植后存活率高、无不良反应等优点，在临床上具有良好的应用前景。目前已有大量间充质干细胞外泌体的成功应用案例，主要应用在组织损伤修复等方面。
3.脐带来源的间充质干细胞易分离和培养，异质性较小，且没有伦理障碍及无致/成瘤性，因此脐带组织是制备间充质干细胞的理想组织材料。若进行脐带间充质干细胞外泌体的临床应用，需要大量优质的间充质干细胞，而以往的培养方案存在细胞易老化、生物学特性无法长期维持、只能得到少量外泌体等问题。因此，有必要对间充质干细胞的培养方法进行优化，以便满足实际要求。


技术实现要素：

4.鉴于以上不足，本发明提供一种用于制备外泌体的脐带间充质干细胞的培养方法。
5.本发明技术方案为：
6.一种用于制备外泌体的脐带间充质干细胞的培养方法，包括以下步骤：
7.(1)采集脐带组织，剥离出华通氏胶组织，洗涤后剪成组织小块，将组织小块转移至培养瓶中；
8.(2)向培养瓶中缓慢加入培养基，在培养箱中培养，得到p0代细胞；
9.(3)将p0代细胞用驯化激活培养基重悬，然后在培养箱中静置培养至细胞融合度达70％-80％，得到p1代细胞；
10.(4)重复步骤(3)，得到后代(p2～p30代)细胞。
11.为了得到最优的应用效果，在实际应用中优选p3～p10代细胞。
12.所述驯化激活培养基添加3-(4－甲氧基苯氧基)-1,2－丙二醇60～120μg/ml和丙酮酸乙酯12～17μg/ml。
13.优选的，步骤(2)所述培养基为96.4％(v/v)dmem/f12培养基+2％(v/v)血清替代物ultroser g+1.6％(v/v)谷氨酰胺(总简称c培养基)。
14.优选的，所述驯化激活培养基为：添加3-(4－甲氧基苯氧基)-1,2－丙二醇60～120μg/ml、血清替代物ultroser g 2v/v％～3v/v％、谷氨酰胺1.6～2.2v/v％、甘草酸二钾10～15μg/ml、丙酮酸乙酯12～17μg/ml、硫酸钠4～9μg/ml的dmem/f12培养基。
15.优选的，所述驯化激活培养基为：添加3-(4－甲氧基苯氧基)-1,2－丙二醇120μg/ml、血清替代物ultroser g 2％(v/v)、谷氨酰胺1.6％(v/v)、甘草酸二钾15μg/ml、丙酮酸
乙酯12μg/ml、硫酸钠4μg/ml的dmem/f12培养基。
16.优选的，步骤(3)中，所述培养为在氧气5％体积浓度条件下培养。通常干细胞体外培养的氧浓度大约在21％左右，本发明在干细胞培养过程中设计了低氧浓度，通过低氧刺激，促进干细胞的增殖。
17.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
18.间充质干细胞在体外的寿命有限，长期培养会导致细胞衰老，严重影响细胞生物学功能和临床疗效，而本发明方法可以抑制ucmscs衰老。
19.本发明有效促进ucmscs的增殖，培养的ucmscs端粒酶活性显著高于其他方法。
20.本发明以低氧培养作为辅助驯化激活手段，丙酮酸乙酯等成分作为保护手段，同时借助3-(4－甲氧基苯氧基)-1,2－丙二醇的作用显著提高细胞分泌外泌体的能力，提高细胞外泌体产量。所得外泌体粒径范围均为94～130nm之间，符合外泌体的粒径范围分布，外泌体均表达cd63、cd9和tsg101等特异性标志物。
附图说明
21.图1：各组细胞端粒酶活性分析统计图。
22.图2：各组细胞外泌体浓度统计结果图。
具体实施方式
23.为了更好理解本发明技术内容，下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
24.以下所述c培养基为添加2v/v％血清替代物ultroser g和1.6v/v％谷氨酰胺的dmem/f12培养基。
25.实施例1(实验组1)：间充质干细胞的培养方法
26.(1)从健康产妇足月分娩后的废弃物中采集脐带组织(获得产妇知情同意)，剥离出华通氏胶组织，洗涤后剪成组织小块，将组织小块转移至培养瓶中；
27.(2)向培养瓶中缓慢加入c培养基，在培养箱中培养(37℃，5％co2，21％o2，饱和湿度)，间隔2—3天换液一次，直至细胞融合度达70％-80％时，得到p0代细胞；
28.(3)按5
×
104cells/ml的比例将p0代细胞用驯化激活培养基重悬，然后在培养箱中静置培养(37℃，5％co2，5％o2，饱和湿度)至细胞融合度达70％-80％，得到p1代细胞；
29.(4)重复步骤(3)，得到p2～p30代细胞。经鉴定，所得细胞符合间充质干细胞的特征。
30.驯化激活培养基：添加3-(4－甲氧基苯氧基)-1,2－丙二醇60μg/ml、血清替代物ultroser g 2％(v/v)、谷氨酰胺1.6％(v/v)、甘草酸二钾15μg/ml、丙酮酸乙酯12μg/ml、硫酸钠4μg/ml的dmem/f12(无血清)培养基。
31.实施例2(实验组2)：间充质干细胞的培养方法
32.(1)从健康产妇足月分娩后的废弃物中采集脐带组织(获得产妇知情同意)，剥离出华通氏胶组织，洗涤后剪成组织小块，将组织小块转移至培养瓶中；
33.(2)向培养瓶中缓慢加入c培养基，在培养箱中培养(37℃，5％co2，21％o2，饱和湿度)，间隔2—3天换液一次，直至细胞融合度达70％-80％时，得到p0代细胞；
34.(3)按5
×
104cells/ml的比例将p0代细胞用驯化激活培养基重悬，然后在培养箱中
静置培养(37℃，5％co2，5％o2，饱和湿度)至细胞融合度达70％-80％，得到p1代细胞；
35.(4)重复步骤(3)，得到p2～p30代细胞。经鉴定，所得细胞符合间充质干细胞的特征。
36.驯化激活培养基：添加3-(4－甲氧基苯氧基)-1,2－丙二醇120μg/ml、血清替代物ultroser g 2％(v/v)、谷氨酰胺1.6％(v/v)、甘草酸二钾15μg/ml、丙酮酸乙酯12μg/ml、硫酸钠4μg/ml的dmem/f12(无血清)培养基。
37.实施例3间充质干细胞的培养方法
38.(1)从健康产妇足月分娩后的废弃物中采集脐带组织(获得产妇知情同意)，剥离出华通氏胶组织，洗涤后剪成组织小块，将组织小块转移至培养瓶中；
39.(2)向培养瓶中缓慢加入c培养基，在培养箱中培养(37℃，5％co2，21％o2，饱和湿度)，间隔2—3天换液一次，直至细胞融合度达70％-80％时，得到p0代细胞；
40.(3)按5
×
104cells/ml的比例将p0代细胞用驯化激活培养基重悬，然后在培养箱中静置培养(37℃，5％co2，5％o2，饱和湿度)至细胞融合度达70％-80％，得到p1代细胞；
41.(4)重复步骤(3)，得到p2～p30代细胞。经鉴定，所得细胞符合间充质干细胞的特征。
42.驯化激活培养基：添加3-(4－甲氧基苯氧基)-1,2－丙二醇60μg/ml、血清替代物ultroser g 3％(v/v)、谷氨酰胺2.2％(v/v)、甘草酸二钾15μg/ml、丙酮酸乙酯12μg/ml、硫酸钠9μg/ml的dmem/f12(无血清)培养基。
43.实施例4间充质干细胞的培养方法
44.(1)从健康产妇足月分娩后的废弃物中采集脐带组织(获得产妇知情同意)，剥离出华通氏胶组织，洗涤后剪成组织小块，将组织小块转移至培养瓶中；
45.(2)向培养瓶中缓慢加入c培养基，在培养箱中培养(37℃，5％co2，21％o2，饱和湿度)，间隔2—3天换液一次，直至细胞融合度达70％-80％时，得到p0代细胞；
46.(3)按5
×
104cells/ml的比例将p0代细胞用驯化激活培养基重悬，然后在培养箱中静置培养(37℃，5％co2，5％o2，饱和湿度)至细胞融合度达70％-80％，得到p1代细胞；
47.(4)重复步骤(3)，得到p2～p30代细胞。经鉴定，所得细胞符合间充质干细胞的特征。
48.驯化激活培养基：添加3-(4－甲氧基苯氧基)-1,2－丙二醇60μg/ml、血清替代物ultroser g 2％(v/v)、谷氨酰胺1.6％(v/v)、甘草酸二钾10μg/ml、丙酮酸乙酯17μg/ml、硫酸钠4μg/ml的dmem/f12(无血清)培养基。
49.实施例5(对照组1)：间充质干细胞的培养方法
50.(1)从健康产妇足月分娩后的废弃物中采集脐带组织(获得产妇知情同意)，剥离出华通氏胶组织，洗涤后剪成组织小块，将组织小块转移至培养瓶中；
51.(2)向培养瓶中缓慢加入c培养基，在培养箱中培养(37℃，5％co2，21％o2，饱和湿度)，间隔2—3天换液一次，直至细胞融合度达70％-80％时，得到p0代细胞；
52.(3)按5
×
104cells/ml的比例将p0代细胞用驯化激活培养基重悬，然后在培养箱中静置培养(37℃，5％co2，5％o2，饱和湿度)至细胞融合度达70％-80％，得到p1代细胞；
53.(4)重复步骤(3)，得到p2～p30代细胞。经鉴定，所得细胞符合间充质干细胞的特征。
54.驯化激活培养基：添加丙二醇60μg/ml、血清替代物ultroser g 2％(v/v)、谷氨酰胺1.6％(v/v)、甘草酸二钾15μg/ml、丙酮酸乙酯12μg/ml、硫酸钠4μg/ml的dmem/f12(无血清)培养基。
55.实施例6(对照组2)：间充质干细胞的培养方法
56.(1)从健康产妇足月分娩后的废弃物中采集脐带组织(获得产妇知情同意)，剥离出华通氏胶组织，洗涤后剪成组织小块，将组织小块转移至培养瓶中；
57.(2)向培养瓶中缓慢加入c培养基，在培养箱中培养(37℃，5％co2，21％o2，饱和湿度)，间隔2—3天换液一次，直至细胞融合度达70％-80％时，得到p0代细胞；
58.(3)按5
×
104cells/ml的比例将p0代细胞用驯化激活培养基重悬，然后在培养箱中静置培养(37℃，5％co2，5％o2，饱和湿度)至细胞融合度达70％-80％，得到p1代细胞；
59.(4)重复步骤(3)，得到p2～p30代细胞。经鉴定，所得细胞符合间充质干细胞的特征。
60.驯化激活培养基：添加3-(4－甲氧基苯氧基)-1,2－丙二醇180μg/ml、血清替代物ultroser g 2％(v/v)、谷氨酰胺1.6％(v/v)、甘草酸二钾15μg/ml、丙酮酸乙酯12μg/ml、硫酸钠4μg/ml、dmem/f12(无血清)培养基。
61.实施例7(对照组3)：间充质干细胞的培养方法
62.(1)从健康产妇足月分娩后的废弃物中采集脐带组织(获得产妇知情同意)，剥离出华通氏胶组织，洗涤后剪成组织小块，将组织小块转移至培养瓶中；
63.(2)向培养瓶中缓慢加入c培养基，在培养箱中培养(37℃，5％co2，21％o2，饱和湿度)，间隔2—3天换液一次，直至细胞融合度达70％-80％时，得到p0代细胞；
64.(3)按5
×
104cells/ml的比例将p0代细胞用驯化激活培养基重悬，然后在培养箱中静置培养(37℃，5％co2，5％o2，饱和湿度)至细胞融合度达70％-80％，得到p1代细胞；
65.(4)重复步骤(3)，得到p2～p30代细胞。经鉴定，所得细胞符合间充质干细胞的特征。
66.驯化激活培养基：添加3-(4－甲氧基苯氧基)-1,2－丙二醇80μg/ml、血清替代物ultroser g 2％(v/v)、谷氨酰胺1.6％(v/v)、甘草酸二钾15μg/ml、硫酸钠4μg/ml的dmem/f12(无血清)培养基。
67.实施例8(对照组4)：间充质干细胞的培养方法
68.(1)从健康产妇足月分娩后的废弃物中采集脐带组织(获得产妇知情同意)，剥离出华通氏胶组织，洗涤后剪成组织小块，将组织小块转移至培养瓶中；
69.(2)向培养瓶中缓慢加入c培养基，在培养箱中培养(37℃，5％co2，21％o2，饱和湿度)，间隔2—3天换液一次，直至细胞融合度达70％-80％时，得到p0代细胞；
70.(3)按5
×
104cells/ml的比例将p0代细胞用添加2％(v/v)血清替代物ultroser g和1.6％(v/v)谷氨酰胺的dmem/f12(无血清)培养基重悬，然后在培养箱中静置培养(37℃，5％co2，5％o2，饱和湿度)至细胞融合度达70％-80％，得到p1代细胞；
71.(4)重复步骤(3)，得到p2～p30代细胞。经鉴定，所得细胞符合间充质干细胞的特征。
72.实施例9(对照组5)：间充质干细胞的培养方法
73.(1)从健康产妇足月分娩后的废弃物中采集脐带组织(获得产妇知情同意)，剥离
出华通氏胶组织，洗涤后剪成组织小块，将组织小块转移至培养瓶中；
74.(2)向培养瓶中缓慢加入c培养基，在培养箱中培养(37℃，5％co2，21％o2，饱和湿度)，间隔2—3天换液一次，直至细胞融合度达70％-80％时，得到p0代细胞；
75.(3)按5
×
104cells/ml的比例将p0代细胞用驯化激活培养基重悬，然后在培养箱中静置培养(37℃，5％co2，21％o2，饱和湿度)至细胞融合度达70％-80％，得到p1代细胞；
76.(4)重复步骤(3)，得到p2～p30代细胞。经鉴定，所得细胞符合间充质干细胞的特征。
77.驯化激活培养基：添加3-(4－甲氧基苯氧基)-1,2－丙二醇80μg/ml、血清替代物ultroser g 2％(v/v)、谷氨酰胺1.6％(v/v)、甘草酸二钾15μg/ml、丙酮酸乙酯12μg/ml、硫酸钠4μg/ml的dmem/f12(无血清)培养基。
78.实施例10间充质干细胞外泌体的分离
79.上述各实施例所得间充质干细胞外泌体的分离方法为：
80.利用超高速离心法分离细胞外泌体。取p5代细胞培养3天后的培养基上清，2000g离心10min，弃沉淀，继续10 000g离心1h，弃沉淀，110 000g离心60min，弃上清，用无菌pbs重悬离心管底部沉淀，再次110 000g离心60min，弃上清，得外泌体，外泌体用pbs重悬，-80℃储存备用。
81.试验例：
82.比较各实施例干细胞及外泌体：
83.(1)通过端粒酶活性分析间充质干细胞的扩增能力，采用罗氏端粒酶检测试剂盒进行检测，具体操作参照说明书。
84.检测培养至p30代的ucmscs端粒酶活性，结果参见图1，结果显示实验组培养的ucmscs端粒酶活性显著高于各对照组(p＜0.05)。对比实验组1与对照组1，表明培养基中的3-(4－甲氧基苯氧基)-1,2－丙二醇有效提高端粒酶活性，而丙二醇无此效果。对照组2使用了更高浓度的3-(4－甲氧基苯氧基)-1,2－丙二醇，端粒酶活性出现下降，表明过高的3-(4－甲氧基苯氧基)-1,2－丙二醇浓度将出现负作用。对照组3培养基中无丙酮酸乙酯，端粒酶活性低于实验组1，说明丙酮酸乙酯的存在有利于提高端粒酶活性。对照组4使用的是普通培养基，其干细胞端粒酶活性在各组中最低。对照组5在驯化激活培养基培养时，使用的是正常氧浓度21％，端粒酶活性低于实验组1，表明低氧刺激有利于提高细胞端粒酶活性，促进干细胞增殖。以上结果表明本发明实验组培养的ucmscs端粒酶活性显著高于其他方法，本发明方法可促进ucmscs增殖。
85.(2)取各实施例的p30代间充质干细胞采用碧云天公司的β－半乳糖苷酶染色试剂盒检测细胞衰老情况，操作过程参照试剂盒说明书。
86.β－半乳糖苷酶染色结果表明实验组细胞衰老速度明显慢于对照组，本发明的培养方法可抑制ucmscs衰老。
87.(3)透射电镜观察外泌体形态，结果显示各实验组和对照组细胞所得的外泌体均为茶托样的双层膜结构。
88.(4)使用纳米颗粒跟踪分析仪测量外泌体浓度和粒径。
89.结果显示，各实验组1-2和对照组1、4-5的外泌体粒径范围均为94～130nm之间，符合外泌体的粒径范围分布，对照组2-3粒径范围均为110-230nm之间，粒径较大。
90.实验组的外泌体浓度显著高于对照组1、3、4、5(图2)，实验组的外泌体浓度达到63
×
108/ml培养基。
91.(5)通过western blot法检测外泌体表面特异性标志物的蛋白表达。
92.western blot检测结果显示实验组和对照组细胞分离得到的外泌体均表达cd63、cd9和tsg101。
93.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种用于制备外泌体的脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采集脐带组织，剥离出华通氏胶组织，洗涤后剪成组织小块，将组织小块转移至培养瓶中；(2)向培养瓶中缓慢加入培养基，在培养箱中培养，得到p0代细胞；(3)将p0代细胞用驯化激活培养基重悬，然后在培养箱中静置培养至细胞融合度达70％-80％，得到p1代细胞；(4)重复步骤(3)，得到后代细胞。所述驯化激活培养基含有3-(4－甲氧基苯氧基)-1,2－丙二醇60～120μg/ml和丙酮酸乙酯12～17μg/ml。2.根据权利要求1所述用于制备外泌体的脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，步骤(2)所述培养基为添加2v/v％血清替代物ultroser g和1.6v/v％谷氨酰胺的dmem/f12培养基。3.根据权利要求1所述用于制备外泌体的脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述驯化激活培养基为：添加3-(4－甲氧基苯氧基)-1,2－丙二醇60～120μg/ml、血清替代物ultroser g 2v/v％～3v/v％、谷氨酰胺1.6～2.2v/v％、甘草酸二钾10～15μg/ml、丙酮酸乙酯12～17μg/ml、硫酸钠4～9μg/ml的dmem/f12培养基。4.根据权利要求1所述用于制备外泌体的脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述驯化激活培养基为：添加3-(4－甲氧基苯氧基)-1,2－丙二醇120μg/ml、血清替代物ultroser g 2v/v％、谷氨酰胺1.6v/v％、甘草酸二钾15μg/ml、丙酮酸乙酯12μg/ml、硫酸钠4μg/ml的dmem/f12培养基。5.根据权利要求1所述用于制备外泌体的脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，步骤(3)中，所述培养为在氧气5％体积浓度条件下培养。6.由权利要求1～5任一项所述的培养方法得到的脐带间充质干细胞。

技术总结
本发明公开了一种用于制备外泌体的脐带间充质干细胞的培养方法，包括以下步骤：(1)采集脐带组织，剥离出华通氏胶组织，洗涤后剪成组织小块，将组织小块转移至培养瓶中；(2)向培养瓶中缓慢加入培养基，在培养箱中培养，得到P0代细胞；(3)将P0代细胞用驯化激活培养基重悬，然后在培养箱中静置培养至细胞融合度达70％-80％，得到P1代细胞；(4)重复步骤(3)，得到后代细胞。所述驯化激活培养基含有3-(4－甲氧基苯氧基)-1,2－丙二醇60～120μg/mL和丙酮酸乙酯12～17μg/mL。本发明可得到大量间充质干细胞，且经多次传代后干细胞仍保持较高的活性，细胞衰老缓慢。本发明培养所得的干细胞可分泌出大量外泌体，满足临床研究及应用的需求。求。求。


技术研发人员：丰玫玫 邓智敏 杨宗繁 王利群 李健 王宁丁 曾胜
受保护的技术使用者：海南苏生生物科技有限公司
技术研发日：2023.03.10
技术公布日：2023/7/25