一种检测小鼠内参基因PPIB的RNA探针及其制备方法与应用与流程

一种检测小鼠内参基因ppib的rna探针及其制备方法与应用
技术领域
1.本发明涉及核酸杂交技术领域，尤其是涉及一种检测小鼠内参基因ppib的rna探针及其制备方法与应用。


背景技术：

2.基因表达和分布的检测分析现已广泛应用于生物科学的研究以及临床医学的应用中。目前在转录水平对目标基因的表达和分布进行分析的方法，有实时荧光定量pcr、rna印迹，基因芯片、原位杂交等，这些技术都依赖于内参基因的选择。然而荧光定量pcr、rna印迹，基因芯片等技术仅能反映基因的表达，原位杂交技术能同时反映基因的表达和分布情况。
3.荧光原位杂交技术是在原位杂交技术上发展起来的非放射性分子实验技术，它根据碱基互补配对的原则设计一段与目标组织或者细胞中的rna能特异性结合的rna探针，通过显微成像将结果呈现出来。这项技术的准确性很大程度上取决于组织样品中rna的质量。常使用内参基因作为判定样品rna质量的标准，一个理想的内参基因、具有表达量高，分布广泛，表达稳定的特点。大量的研究分析表明，内参基因的稳定性也是相对的，在不同细胞不同时期，不同组织中内参基因的表达并不是恒定不变的。
4.ppib(peptidyl-prolyl isomerase b，肽基脯氨酰基异构酶b)也称为亲环素b(cyclophilin b)。亲环素b在体内的分布十分广泛，研究表明ppib是一种表达相对稳定的内参基因，比actb以及gapdh，更适合作为内参基因。
5.基于ppib作为内参基因的广泛应用，现有的ppib荧光探针的选用，通常采用rnascope acd试剂盒，其价格昂贵，货期较长，且及时性较差。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种检测小鼠内参基因ppib的rna探针及其制备方法与应用，以解决现有技术中采用rnascope acd试剂盒作为ppib荧光探针的应用，其价格昂贵，货期较长，且及时性较差的技术问题。
7.本发明提供一种检测小鼠内参基因ppib的rna探针，具有seq id no.1所示的碱基序列结构。
8.进一步，所述rna探针的长度不小于500nt。
9.本发明还提供了如上述的rna探针的制备方法，包括如下步骤：
10.sp1：设计引物：根据ppib的碱基序列设计引物，得到正向引物和反向引物，且正向引物和反向引物的序列如下：
11.正义链：acagtggataattttgtagc，
12.反义链：gtgtggggattgacagg；
13.sp2：pcr扩增ppib探针序列，并电泳跑胶纯化，以3:1的浓度，连接ppib pcr产物以及pgm-t载体，转化感受态细胞得到pgm-t-ppib克隆；
14.sp3：单克隆培养：挑取10个pgm-t-ppib单克隆与大肠杆菌混合培养；
15.sp4：从上述单克隆样品中，选取3个培养成功的样品进行送测，比对测序结果与ppib序列，判断比对结果是否符合预期；
16.sp5：用上述测序结果符合预期的重组质粒作为模版，进行单酶切，并跑胶回收酶切产物，得到线性化的重组质粒；
17.sp6：用上述线性化重组质粒作为模版进行体外转录，合成带有地高辛标记的反义rna探针，即为ppib的rna探针；
18.sp7：使用探针纯化试剂盒纯化ppib探针。
19.本发明另外提供了如上述的rna探针的应用，用于检测小鼠的内参基因ppib，该方法包括如下步骤：
20.步骤一：杂交前处理：取待检测的组织样本进行预处理；
21.步骤二：预杂交：向预处理过的组织样本上加入预杂交液，覆盖住组织，并放入烘箱孵育；
22.步骤三：杂交：吸走预杂交液，向切片上加入所述rna探针，覆盖组织，并放入烘箱孵育；
23.步骤四：一抗标记：弃去杂交液，漂洗样本，加入地高辛抗体，进行孵育；
24.步骤五：显色：弃去地高辛抗体，漂洗样品，加入显色底物室温避光孵育；
25.步骤六：复染封片：加入含dapi的封片液，室温晾干；
26.步骤七：镜检观察：在显微镜下拍照观察。
27.与现有技术相比较，本发明的有益效果在于：
28.本发明中，通过本发明的制备方法制得的ppib rna原位杂交探针的稳定性较好，能够长期保存使用。同时，本发明的制备方法下制备的小鼠ppib rna原位杂交探针具有信噪比高、特异性好、制备成本低且简单的特点，有利于商业化的推广应用。
附图说明
29.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
30.图1为本发明中制得的ppib rna原位杂交探针显示在凝胶上的碱基序列条带示意图；
31.图2为本发明中显示pgm-t载体图谱以及酶切位点的示意图；
32.图3为本发明中显示pspt19载体条带以及重组质粒pspt19-wpre的条带示意图；
33.图4为本发明方法下制得的探针进行原位杂交检测的结果，白色亮点为ppib rna探针在小鼠脑组织中的特异性表达的示意图；
34.图5为本发明的连接体系表；
35.图6为本发明的pgm-t-ppib酶切体系表。
具体实施方式
36.下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
37.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明的技术方案作进一步完整详细地说明。以下所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
38.下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。
39.基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
40.具体实施例1：
41.本实施例介绍了ppib基因片段的合成：
42.1、设计引物：根据ppib的碱基序列设计得到引物ppib-f1和ppib-r1：
43.ppib-f：acagtggataattttgtag，
44.ppib-r：aaaatcaggcctgtggaatg，
45.2、以上述引物pcr扩增ppib dna片段,pcr扩增的反应体系为：
[0046][0047]
pcr扩增的反应程序为：
[0048][0049][0050]
以小鼠cdna为模版，ppib-f和ppib-r作为引物，按照上述反应体系和扩增程序进行扩增，将所得产物进行1.5％琼脂糖电泳以及回收纯化。
[0051]
具体实施例2：
[0052]
本实施例介绍了pgm-t-ppib重组质粒的构建：
[0053]
1、采用商业化的pgm-t克隆试剂盒按照pcr产物和线性化载体摩尔比3:1的比例进行混匀，16℃下连接过夜，体系如表1所示；
[0054]
2、产物连接成功后，转化感受态细胞并涂amp培养板，进行克隆培养；
[0055]
3、从amp细菌培养板上挑取10个pgm-t-ppib单克隆，分别与大肠杆菌混合培养18h；
[0056]
4、测序：从上述单克隆样品中选取5个培养成功的样品交由生物测序公司进行测序，再通过snapgene软件比对测序结果与ppib序列，测序结果与ppib序列一致表明重组质粒pgm-t-ppib构建成功；
[0057]
5、以上述构建成功的重组质粒pgm-t-ppib作为模版，采用限制性内切酶ncoi进行处理，37℃下酶切3小时，酶切体系如表2所示。
[0058]
酶切结束后，将酶切产物进行跑胶回收，得到线性化的重组质粒。
[0059]
具体实施例3：
[0060]
本实施例介绍了体外转录合成地高辛标记的ppib rna探针：
[0061]
1、以实施例2中的线性化重组质粒作为模版，通过sp6 rna聚合酶进行体外转录，得到一条带有地高辛标记的rna探针，即为ppib的rna探针；
[0062]
2、纯化探针：使用omega探针纯化试剂盒进行探针纯化。
[0063]
具体实施例4：
[0064]
本实施例介绍了ppib rna探针的应用：
[0065]
1.组织准备：取7-8周大小鼠用4％的pfa灌流取全脑，置于4摄氏度下固定24小时，30％蔗糖沉糖48h，使用oct包埋组织进行冰冻切片，室温晾干；
[0066]
2.组织预处理：
[0067]
(1)从冰箱取出冰冻切片，置于室温下平衡1小时，用含0.1％depc的pbs洗涤2次，每次5min；
[0068]
(2)向每张切片上滴加0.3％triton，室温固定20min,用含0.1％depc的pbs清洗载玻片3次，每次5min；
[0069]
(3)向每张切片上滴加3％的过氧化氢，使其覆盖样本，室温20min，用含0.1％depc的pbs清洗载玻片3次，每次5min；
[0070]
(4)向每张切片上滴加10ug/ml的蛋白酶k试剂以完全覆盖切片,在室温下孵育30min，用含0.1％depc的pbs清洗载玻片3次，每次5min；
[0071]
(5)向每张切片上滴加0.75％甘氨酸，孵育5min；
[0072]
(6)向每张切片上滴加tea，孵育15min，用含0.1％depc的pbs清洗载玻片2次，每次5min。
[0073]
3、预杂交：
[0074]
(1)向每张切片上加预杂交液，恒温箱37-40℃保存2-4小时，吸取多余液体，不洗。
[0075]
4、杂交：
[0076]
(1)用杂交稀释液稀释地高辛标记的rna探针，浓度一般0.2-5ng/u l，按每张切片上加200u l杂交液；
[0077]
(2)从杂交炉中取出预热的湿盒，将载玻片夹放入盒中，盖上盖，恒温箱55℃杂交过夜18-24h；
[0078]
(3)从杂交炉取出湿盒，立即将载玻片夹放入盛有蒸馏水(depc)的清洗槽中，将盖玻片轻轻取掉；
[0079]
(4)向清洗槽中加入预热的2
×
ssc，放置于65摄氏度的烘箱，洗涤5mi n*1次；
[0080]
(5)向清洗槽中加入预热的0.2
×
ssc，放置于65摄氏度的烘箱，洗涤20mi n
×
2次；
[0081]
(6)向清洗槽中加入预热的0.2
×
ssc，室温洗涤1次，5mi n。
[0082]
5、孵育抗地高辛-pod：
[0083]
(1)向切片上加入稀释的地高辛抗体，37摄氏度孵育1小时。pbst清洗三次，每次5mi n；
[0084]
(2)向切片上加入显色底物opa l-570，37摄氏度孵育30mi n。用pbst清洗三次，每次5mi n。
[0085]
6、复染与封片：
[0086]
向切片加入含dap i的封片液，盖上盖玻片，室温晾干。
[0087]
7、镜检观察：
[0088]
在荧光显微镜下拍照观察，如图2所示，其中左图是对照图片，没有信号，只有较弱的背景，右图是小鼠脑组织切片杂交18小时以后的结果，其中白色为阳性相号，ppib探针特异并广泛地结合在了小鼠脑组织细胞的细胞核以及细胞质中，由此可以证明本发明方法制得的ppib rna探针，信号强，特异性好，可作为小鼠组织ppib的的检测方法，为荧光原位杂交技术的应用提供了内参标准。
[0089]
综上，本发明在小鼠脑组织上进行验证，证明ppib探针具有特异性好以及信噪比高的特点。
[0090]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

技术特征：
1.一种检测小鼠内参基因ppib的rna探针，其特征在于：具有seq idno.1所示的碱基序列结构：acagtggataattttgtagccttagctacaggagagaaaggatttggctacaaaaacagcaagttccatcgtgtcatcaaggacttcatgatccagggtggagacttcaccaggggagatggcacaggaggaaagagcatctatggtgagcgcttcccagatgagaacttcaagctgaagcactacgggcctggctgggtgagcatggccaatgcaggcaaagacaccaatggctcacagttcttcataaccacagtcaagacctcctggctggatggcaagcatgtggttttcggcaaagttctagagggcatggatgtggtacggaaggtggagagcaccaagacagacagccgggacaagccactgaaggatgtcatcattgtcgactccggcaagatcgaagtggagaaacccttcgccattgccaaggagtagagagcctgggggacctcatccctctaagcagctgtctgtgtgggtcctgtcaatccccacac。2.根据权利要求1所述的rna探针，其特征在于：所述rna探针的长度不小于500nt。3.一种如权利要求1所述的rna探针的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：sp1：设计引物：根据ppib的碱基序列设计引物，得到正向引物和反向引物，且正向引物和反向引物的序列如下：正义链：acagtggataattttgtagc，反义链：gtgtggggattgacagg；sp2：构建重组质粒：使用上述引物进行pcr扩增ppib部分碱基序列，将所述pcr产物连接到载体上，得到重组质粒克隆；sp3：单克隆培养：挑选重组质粒单克隆与大肠杆菌进行混合培养；23a0234cnsp4：送测与比对：送测已进行培养的重组质粒大肠杆菌混合液，比对测序结果序列和ppib序列，判断测序结果与ppib序列是否一致；sp5：测序结果与ppib序列一致的重组质粒，跑凝胶电泳回收纯化；sp6：将通过电泳回收纯化得到的重组质粒作为模版进行体外转录，合成带有地高辛标记的反义rna探针，即为ppib的rna探针；sp7：使用试剂盒纯化ppib探针。4.根据权利要求3所述的一种如权利要求1所述的rna探针的制备方法，其特征在于：所述单克隆培养中，选用的质粒载体为pgm-t。5.根据权利要求4所述的一种如权利要求1所述的rna探针的制备方法，其特征在于：所述构建重组质粒中，pcr扩增ppib探针序列，通过电泳跑胶纯化，以3：1的浓度，连接ppib pcr产物以及pgm-t载体。6.根据权利要求3所述的一种如权利要求1所述的rna探针的制备方法，其特征在于：所述送测与比对中，已进行培养的重组质粒大肠杆菌混合液中，选用测序结果符合预期的重组质粒作为模版，进行单酶切，通过跑胶回收酶切产物。7.一种如权利要求1所述的rna探针的应用，其特征在于：用于检测小鼠的内参基因ppib，该方法包括如下步骤：步骤一：杂交前处理：取待检测的组织样本进行预处理；步骤二：预杂交：向预处理过的组织样本上加入预杂交液，覆盖住组织，并放入烘箱孵育；步骤三：杂交：吸走预杂交液，向切片上加入所述rna探针，覆盖组织，并放入烘箱孵育；
23a0234cn步骤四：一抗标记：弃去杂交液，漂洗样本，加入地高辛抗体，进行孵育；步骤五：显色：弃去地高辛抗体，漂洗样品，加入显色底物室温避光孵育；步骤六：复染封片：加入含dapi的封片液，室温晾干；步骤七：镜检观察：在显微镜下拍照观察。

技术总结
本发明公开了一种检测小鼠内参基因PPIB的RNA探针及其制备方法与应用，属于核酸杂交技术领域，其探针的碱基序列结构如SEQ ID NO.1所示，制备过程包括设计引物、构建重组质粒、单克隆培养、送测与比对、跑凝胶电泳回收纯化、体外转录合成探针、试剂盒纯化探针。通过本发明的制备方法制得的PPIB RNA原位杂交探针的稳定性较好，能够长期保存使用，同时，本发明的制备方法下制备的小鼠PPIB RNA原位杂交探针具有信噪比高、特异性好、制备成本低且简单的特点，有利于商业化的推广应用。有利于商业化的推广应用。有利于商业化的推广应用。


技术研发人员：姜舒 来香茹 江颖纯 罗玉珠 徐玲 梁佳莹
受保护的技术使用者：深圳市恩辑生物科技有限公司
技术研发日：2023.03.07
技术公布日：2023/7/25