人结直肠癌原发灶与肝脏转移灶配对类器官细胞系及其培养方法与应用

no.c202218的人右半结肠癌原发灶类器官细胞系cwh22与对应的保藏号为cctcc no.c202219的配对人右半结肠癌肝转移灶类器官细胞系clm22。
7.进一步地，所述细胞系为一例右半结肠癌合并同时性肝转移患者同时切除的原发灶和对应肝脏转移灶肿瘤组织进行体外3d类器官培养建立得到。
8.本发明的目的之二是公开一种人结直肠癌原发灶与肝脏转移灶配对类器官细胞系的培养方法，它包括如下步骤：
9.1)取材：术中分别留取该患者原发灶及对应肝脏转移灶肿瘤组织各0.5cm3于含advanced dmem/f12的无菌取样管中，置于4℃冰盒快速送到实验室；
10.2)消化：在无菌超净台中用pbs清洗弃去步骤1)所得样本表面的黏液、坏死组织和残余血细胞，继而用活力碘(临床黏膜消毒用)冲洗一次及pbs冲洗三次后，在平皿中用剪刀将组织反复剪碎，加入2ml50％浓度消化酶tryple(2mldmem稀释)室温消化，每隔5min充分混匀含消化酶的组织悬液，约20min左右，加入等体积含ca
2+
的hbss缓冲液中和并再次混匀；
11.3)过滤：用不小于200目网径的滤网过滤步骤2)所得悬液，并离心，沉淀用5ml培养基重悬，并反复洗涤离心弃去坏死细胞碎片，离心转速500～1500r/min；
12.4)种细胞：取上述洗涤所得细胞进行活细胞计数，用基质胶低温重悬细胞为8000个/30μl，种于已预热的24孔板中，30μl/孔，置于37℃培养箱30min待穹隆状基质胶凝固后，每孔添加培养基650μl；
13.5)常规传代培养：培养基每3～5天更换一次，在第10～14天时进行传代操作，用tryple消化酶250μl/孔进行消化，每隔5分钟吹打混匀一次，10～15min可消化为单个细胞悬液，以hbss中和离心重悬后计数，以8000个细胞每孔继续传代，后续重复步骤4)和5)。
14.本发明的目的之三是公开一种上述人结直肠癌原发灶与肝脏转移灶配对类器官细胞系用于构建盲肠原位成瘤动物模型和/或肝脏转移灶成瘤动物模型并用来研究直肠癌发生机理及耐药机理。
15.本发明的目的之四是公开一种肝脏转移灶成瘤动物模型的建立方法，它包括如下步骤：
16.1)类器官培养：将类器官细胞使用慢病毒感染稳定过表达荧光素酶后，常规培养类器官，于传代后第4、7、9、11天分别换液，取处于对数生长期的cwh22和clm22类器官(每代次生长第10-12天)进行裸鼠脾脏注射转移成瘤操作；
17.2)类器官消化：消化收细胞过程同常规传代操作，尽量消化为单细胞悬液状态，并计数，以dmem重悬为1.25*107/ml置4℃保温箱备用；
18.3)脾脏注射：戊巴比妥麻醉裸鼠后，固定裸鼠并做腹部皮肤消毒，沿腹部左肋下缘腋前线前0.5cm处做纵向约1cm切口至腹腔，轻轻挑出脾脏后从脾脏远端注射混匀的细胞悬液约80μl/只裸鼠，10min后结扎脾脏血管剪除脾脏并缝合，密切观察确保顺利苏醒。
19.4)成瘤监测：定期活体成像观察裸鼠肝转移成瘤情况并记录。
20.本发明的目的之五是公开一种盲肠原位成瘤动物模型的构建方法，它包括如下步骤：
21.1)类器官培养：常规培养过表达荧光素酶的类器官cwh22和clm22，于传代后第4、7、9、11天分别换液，取处于对数生长期的类器官进行裸鼠盲肠壁注射操作；其中，每代次生长第10～12天；
22.2)类器官收集：于第10～12天收集类器官，以tryple消化酶常规消化5min后，中和收集类器官沉淀，约3*106细胞，预冷后重悬于60μl基质胶中置4℃保温箱备用；
23.3)盲肠原位注射：戊巴比妥麻醉裸鼠后，固定裸鼠并做腹部皮肤消毒，沿下腹部正中线做纵向约1.5cm切口至腹腔并找到盲肠，将盲肠末端移至视野正中，以预冷胰岛素注射针抽取类器官悬液20μl做盲肠粘膜下注射。注射完毕观察无渗漏后，做腹部肌肉和皮肤缝合，并密切观察确保顺利苏醒；
24.4)成瘤监测：定期活体成像观察裸鼠盲肠原位成瘤情况并记录。
25.本发明目的之六是公开一种上述人结肠癌原发灶与肝脏转移灶配对类器官细胞系在制备用于筛选治疗结直肠癌和/或肝转移灶肿瘤药物中的应用。
26.进一步地，将治疗药物施用于体外细胞模型中，施用后抑制细胞增殖或导致细胞凋亡的为治疗敏感性药物，或者将测试化合物施用于体外细胞模型中，施用后抑制细胞增殖或导致细胞凋亡的为候选化合物。
27.本发明目的之七是公开一种筛选用于治疗结直肠癌和/或肝转移灶肿瘤药物的方法，它包括取上述对数生长期的cwh22和clm22类器官消化计数重悬于基质胶并种于96孔板内，2*105个cell/ml，10μl/孔，待基质胶凝固后，添加培养基100μl/孔，培养5～6天时，其中，类器官直径约100μm，替换成梯度药物培养基继续培养，3天换液一次，药物作用6天后通过3d细胞活性检测，计算对应药物ic50。
28.进一步地，所述梯度药物包含如下中的至少一种：5-氟尿嘧啶，奥沙利铂，伊立替康(sn-38)，依托泊苷(vp-16)，索托拉西布(sotorasib，amg-510)，瑞戈非尼(regorafenib)，达沙替尼(dasatinib)或硼替佐米(bortezomib，ps-341)。
29.有益效果：
30.1、本发明培养得到的人右半结肠癌原发灶类器官cwh22和对应的肝脏转移灶类器官clm22经str鉴定为新的细胞株，且来自于同一患者，为人结直肠癌和肝转移的研究提供了新的与临床肿瘤生物学接近的实验材料。
31.2、本发明筛选得到的人结直肠癌原发灶类器官cwh22和对应的肝脏转移灶类器官clm22具备较好3d类器官形态，且性状稳定，可持续稳定传代，可良好耐受病毒感染等特征，研究发现其具有非常强的盲肠原位成瘤和脾脏注射肝脏转移成瘤能力，可以成功制备结直肠癌肝转移动物模型，实验发现注射100万细胞于盲肠原位或者脾脏，25天左右，可形成明显的肿瘤，可用于在裸鼠体内进行结直肠癌转移机制及综合治疗的药物敏感性研究等。
32.3、本发明培养得到的人结直肠癌原发灶类器官细胞系cwh22和对应的转移灶类器官细胞系clm22，全外显子(wes)测序提示均有kras外显子2错意突变(nm_033360.3:p.gly12cys/c.34g》t)，apc基因移码突变(nm_000038.5:p.tyr935fs/c.2805_2806delca)，smad4基因错义突变(:c.1610a》g)，kmt2c错意突变(nm_170606.2:p.gln3158his/c.9474g》t)及cdkn2b基因移码突变(nm_004064.4:p.ser110fs/c.323_329dupatgtcag)等。此外结直肠癌常见的相关驱动基因nras/hras/braf/pik3ca,tp53等均为野生型。这组配对的类器官细胞系为典型的同时有kras、apc和smad4突变的结直肠癌类器官细胞系，故其可作为一有效的工具细胞，用于kras/apc/smad4三突变、tp53野生型亚群的结直肠癌发生发展及治疗耐药的相关机制研究。
附图说明
33.图1为本发明探究得到的cwh22和clm22类器官细胞所来源的病人术前相关检查。其中，图1a为术前肠镜检查情况，图1b为病人术前肝脏ct及mr平扫情况。
34.图2为图1的患者术中所切除原发灶及转移灶肿瘤组织对应的he及免疫组化染色结果。ck20(+)，cdx-2(+)，her-2(4b5)(-)，her-2(阳性对照)(+)，p53(散在+)，ki-67(li约60％)，mlh1(+)，pms2(+)，msh2(+)，msh6(+)，villin(+)。根据形态学及免疫组化诊断为中分化结直肠腺癌。
35.图3为图2中所取原发灶和转移灶肿瘤组织培养所得类器官cwh22和clm22显微镜下明场形态学及动态生长记录。其中比例尺分别为500μm和200μm。
36.图4为图1中所取肿瘤组织及图3中培养所得类器官的相关染色情况对比。图4a为图1中所取原发灶和转移灶肿瘤组织肉眼所见形态及组织切片he染色，ck20和cdx2表达情况。图4b为培养的类器官明场形态学和类器官切片对应的he染色，ck20和cdx2表达情况。
37.图5为cwh22和clm22全外显子测序，与对应肿瘤组织突变一致性及突变特征分析。
38.图6为cwh22和clm22细胞裸鼠体内肝转移成瘤相关研究。图6a为经脾脏分别注射100万cwh22和clm22细胞至两组裸鼠(5只/组)，第45天活体成像信号及取肝脏观察转移成瘤情况；图6b为对应he染色，及对应的ck20和cdx2表达情况。
39.图7为cwh22类器官细胞盲肠注射原位成瘤后肉眼所见及he染色情况。
40.图8为图3中细胞cwh22和clm22在对应浓度梯度下，5-氟尿嘧啶，奥沙利铂，伊立替康(sn-38)，依托泊苷(vp-16)，索托拉西布(sotorasib，amg-510)，瑞戈非尼(regorafenib)，达沙替尼(dasatinib)和硼替佐米(bortezomib，ps-341)的剂量效应反应曲线及对应的ic50检测结果。
41.图9为临床患者术前及术后8个疗程mfolfox+bevacizumab治疗过程中影像学复查情况对比。
具体实施方式
42.下面结合具体实例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
43.下列实施例中未注明具体条件的实验方法，可采用本领域中的常规方法，例如参考《分子克隆实验指南》(第三版，纽约，冷泉港实验室出版社，new york：cold springharbor laboratory press，1989)或按照供应商所建议的条件。
44.本发明涉及生物材料保藏，其中，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉，武汉大学，邮编：430072，保藏时间为2022年10月21日。
45.下列实施例中未特别说明的各种仪器、原料和试剂均为本领域熟知的市售产品，可通过商业途径获得。在下列实施例中列出的所使用的具体材料及其来源，仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下组织、细胞、试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。
46.实施例1
47.公开了一例人右半结肠癌原发灶类器官细胞系cwh22和对应的肝转移类器官细胞系clm22的建立方法，它包括如下步骤：
48.1.1标本的来源：
49.该肿瘤组织标本来源于一例65岁右半结肠占位合并肝脏转移的患者，2021年1月因“体检发现肝脏占位半月余”入院，ct及mr平扫提示“肝左叶-尾叶巨大分块状肿块影，考虑肿瘤性病变”，肠镜检查示“升结肠新生物，ca？”。后于我院行同期“右半结肠切除术+左半肝切除术”。术后病检示：右半结肠中分化腺癌，侵及肠壁浆膜下；(1)吻合环近端切缘：未见癌；(2)吻合环远端切缘：未见癌；(3)放射状切缘/系膜血管断端：未见癌，局灶紧邻切缘；(4)脉管侵犯：可见；(5)神经侵犯：未见；(6)肠系膜淋巴结：13枚未见癌；(7)淋巴结外肿瘤种植(entd)：可见，n＝1。(8)肝iv段、v段、viii段、肝总动脉旁均可见癌；(9)胆囊、阑尾、肝十二指肠韧带淋巴结1枚均未见癌。免疫组化：mlh1(+)，pms2(+)，msh2(+)，msh6(+)，cdx-2(+)，her-2(4b5)(-)，her-2(阳性对照)(+)，p53(散在+)，ki-67(li约60％)。基因检测提示：kras基因外显子2突变；mss，braf扩增；tmb 4.61muts/mb，排位高于80.98％的患者。
50.病人术前肠镜、ct及mr影像学表现见图1。病人肿瘤组织切片染色情况见图2。
51.1.2标本处理：
52.1)取材：术中分别留取该患者原发灶及转移灶肿瘤组织各0.5cm3于含advanced dmem/f12的无菌取样管中，置于4℃冰盒快速送到实验室；
53.2)消化：在无菌超净台中用pbs清洗弃去步骤1)所得样本表面的黏液、坏死组织和残余血细胞，继而用活力碘(临床黏膜消毒用)冲洗一次及pbs冲洗三次后，在平皿中用剪刀将组织反复剪碎，加入2ml50％浓度消化酶tryple(2mldmem稀释)室温消化，每隔5min充分混匀含消化酶的组织悬液，约20min左右，加入等体积含ca
2+
的hbss缓冲液中和并再次混匀；
54.3)过滤：用不小于200目网径的滤网过滤步骤2)所得悬液，并离心，沉淀用5ml培养基重悬，并反复洗涤离心弃去坏死细胞碎片，离心转速500～1500r/min；
55.4)种细胞：取上述洗涤所得细胞进行活细胞计数，用基质胶低温重悬细胞为8000个/30μl，种于已预热的24孔板中，30μl/孔，置于37℃培养箱30min待穹隆状基质胶凝固后，每孔添加培养基650μl；
56.5)常规传代培养：培养基每3～5天更换一次，在第10～14天时进行传代操作，用tryple消化酶250μl/孔进行消化，每隔5分钟吹打混匀一次，10～15min可消化为单个细胞悬液，以hbss中和离心重悬后计数，以8000个细胞每孔继续传代，后续重复步骤4)和5)。即培养得到具备较好3d类器官形态，且性状稳定，可持续传代，并良好耐受病毒感染等的类器官细胞系。
57.实施例2
58.公开了一例人右半结肠癌原发灶类器官细胞系cwh22和对应肝转移类器官细胞系clm22的生物学特性。
59.2.1cwh22和clm22类器官细胞系的形态学观察
60.取传代培养的cwh22和clm22类器官，在日本olympus imt-2倒置显微镜下观察记录类器官生长形态学变化情况，结果见图3。该类器官以单细胞形式传代，在第4天时可见少数较小腔状腺上皮上分化结构，第7天后明显进入对数生长期。
61.2.2cwh22和clm22类器官结构与原发肿瘤的相似性
62.将临床取回的结直肠癌原发灶及肝转移灶组织进行固定包埋制片，后行he，ck20和cdx2染色；类器官正常培养14天后进行固定并用thermo的组织包埋胶包埋后制备蜡块切
片行he，ck20和cdx2染色，结果见图4。类器官与对应的肿瘤组织具有一致的上皮样排列分化表现及ck20和cdx2的阳性表达。
63.2.5cwh22和clm22类器官细胞系的基因检测
64.取正常培养第四代的cwh22和clm22类器官沉淀，术中切除并速冻的病人肿瘤组织及正常粘膜组织分别提取dna，质检合格后行全外显子测序，图5a为人类肿瘤驱动基因研究数据库中(http://driverdb.tms.cmu.edu.tw/cancer)结直肠癌高频突变基因(apc,kras,smad4,cdkn1b，kmt2c等)在该患者肿瘤组织及对应的类器官cwh22、clm22中的阳性突变情况汇总，图5b为培养的类器官与原发肿瘤突变一致性分析结果，提示类器官较好保留了原发肿瘤的突变特性，且已建立的该患者来源的这对类器官为apc/kras/smad4三突变，tp53野生型的结肠癌类器官细胞系及对应肝转移灶来源的类器官细胞系。
65.2.6cwh22和clm22类器官细胞系的str检测
66.短串联重复序列((short tandem repeat，str))又称为微卫星dna，是指染色体上，由数个碱基对作为核心单位，一般2～6个碱基对，串联重复形成的一类dna序列，重复次数为10～60多次，基因片段在400碱基对以下；每个核心单位重复的次数会出现个体差异，从而形成片段长度不同的等位基因。因此，一组str序列的重复次数在不同个体中几乎是唯一的，是个体的基因身份特征，也是细胞生物学对细胞身份和来源进行鉴定的主要方法。
67.将收集的第4代cwh22和clm22类器官细胞及术中切除并速冻的病人正常粘膜组织，寄送至中国典型培养物保藏中心cctcc，进行str检测。str位点包括：d19s433、d5s818、d21s11、d18s51、d6s1043、amel、d3s1358、d13s317、d7s820、d16s539、csf1po、penta d、d2s441、vwa、d8s1179、tpox、penta e、th01、d12s391、d2s1338、fga。
68.分析结果见表1，可知本发明培养得到的cwh22和clm22类器官细胞系是真实存在的，与亲本组织具有一致的谱型，为同一病人来源。在德国微生物菌种保藏中心dsmz数据库(deutsche sammlung vonmikroorganismen und zellkulturen)、美国典型培养物保藏中心(atcc)数据库，进行str序列检索，未发现相同str检测结果。即，未找到与该细胞str位点完全匹配的细胞系，表明此为新细胞株；未发现多等位点，表明此细胞株为单一细胞，无其他细胞污染。
69.表1cwh22，clm22及患者正常粘膜组织str检测结果列表
[0070][0071][0072]
[0073]
2.7cwh22和clm22类器官细胞脾脏注射肝脏转移成瘤性检测
[0074]
类器官表达荧光素酶(过表达荧光素酶病毒(plvx-luc-ires-neo)购买于上海典君生物科技有限公司)：在96孔板中预铺1:2稀释的基质胶*10孔，30μl/孔铺满底部，置于37℃培养箱30min待其成胶；同步消化细胞为单细胞悬液，并用培养基重悬为3*104/ml，100μl/孔种于上述10孔中；48h后，取其中9孔(另一孔为空白对照)换上述含病毒培养液100μl/孔(加polybrene 5μg/ml)；作用12小时后，换回常规类器官培养基，继续培养24小时后，进行g418(500μg/ml)筛选5-7天左右，待对照组全部死亡后，继续加g418至传代撤除；取1*105细胞加入20μl活体成像底物中，荧光素酶报告基因发光值》50000即为阳性表达。
[0075]
将过表达荧光素酶的cwh22和clm22类器官常规传代培养，取对数生长期的类器官细胞消化为单细胞悬液后计数，用dmem重悬为1.25*107/ml，经脾脏注射80μl/只裸鼠，10min后结扎脾脏血管剪除脾脏并缝合。定期活体成像观察裸鼠肝转移成瘤情况并记录。图6a分别为原发灶和转移灶类器官经脾脏注射45天后肝脏转移成瘤情况，图6b为两组细胞肝脏成瘤he染色及ck20和cdx2的表达情况。
[0076]
2.8cwh22类器官细胞盲肠注射原位成瘤
[0077]
将cwh22和clm22类器官常规传代培养，取对数生长期的类器官用tryple酶消化5分钟释放类器官结构后，约3*106细胞离心洗涤并预冷后重悬于60μl基质胶中置4℃；以预冷胰岛素注射针抽取类器官悬液20μl做盲肠粘膜下注射。第45天将老鼠安乐死后，取盲肠观察成瘤情况，并行he染色鉴定。图7为第45天，盲肠原位成瘤肉眼所见及he染色情况，提示在粘膜下层可见中分化样腺瘤细胞排列。
[0078]
实施例3
[0079]
公开了具备上述生物特征的一对人右半结肠癌原发灶类器官细胞系cwh22和对应的肝转移灶类器官细胞系clm22在用于判断治疗结直肠癌药物敏感性的应用。
[0080]
3.1相关化疗药物ic50检测
[0081]
取对数生长期的cwh22和clm22类器官消化计数重悬于基质胶并种于96孔板内，2*105个cell/ml，10μl/孔，待基质胶凝固后，添加培养基100μl/孔，培养5-6天时(类器官直径约100μm)替换成梯度药物培养基继续培养，3天换液一次，药物作用6天后通过3d细胞活性检测，计算对应药物ic50。见图8。
[0082]
cwh22和clm22的ic50如下：5-氟尿嘧啶分别为3.3μm和3.78μm；奥沙利铂分别为15.47μm和18.38μm；sn-38分别为7.54nm和10.67nm；vp-16分别为5.84μm和6.98μm；瑞戈非尼分别为3.32μm和3.68μm；amg-510分别为15.02μm和10.95μm；ps-341分别为8.06nm和7.71nm。
[0083]
与gdsc(https://www.cancerrxgene.org/)中其他结直肠癌细胞系如lovo、sw620、t84和sw480等的ic50相比，明确了cwh22和clm22对5-氟尿嘧啶和奥沙利铂的药物敏感性。如图9所示，临床患者术后复查提示肝脏散在病灶，接受8个疗程5-氟尿嘧啶+奥沙利铂+贝伐单抗(mfolfox+bevacizumab)治疗，病灶稳定并明显消退，提示该肿瘤初期对5-氟尿嘧啶和奥沙利铂治疗敏感。
[0084]
综上所述，本发明筛选得到的人结直肠癌原发灶类器官cwh22和对应的肝脏转移灶类器官clm22具有较好3d类器官形态，且性状稳定，可持续稳定传代，可良好耐受病毒感染等操作。研究发现其具有非常强的盲肠原位成瘤和脾脏注射肝脏转移成瘤能力，可以成
功制备结直肠癌肝转移动物模型。为进一步深入研究结直肠癌及肝转移的病因学、发病机制、耐药机理、新药筛选等提供新的体内外研究支撑。
[0085]
以上所述仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种人结直肠癌原发灶与肝脏转移灶配对类器官细胞系，其特征在于，包括保藏于中国典型培养物保藏中心cctcc，保藏号为cctcc no.c202218的人右半结肠癌原发灶类器官细胞系cwh22，与对应的保藏号为cctcc no.c202219的配对人右半结肠癌肝转移灶类器官细胞系clm22。2.根据权利要求1所述人结直肠癌原发灶与肝脏转移灶配对类器官细胞系，其特征在于，所述细胞系为原发灶和对应肝脏转移灶肿瘤组织进行体外3d类器官培养建立得到。3.一种人结直肠癌原发灶与肝脏转移灶配对类器官细胞系的培养方法，其特征在于，它包括如下步骤：1)取材：术中分别留取原发灶及对应肝脏转移灶肿瘤组织各0.5cm3于含advanced dmem/f12的无菌取样管中，置于4℃冰盒快速送到实验室；2)消化：在无菌超净台中用pbs清洗弃去步骤1)所得样本表面的黏液、坏死组织和残余血细胞，继而用活力碘冲洗一次及pbs冲洗三次后，在平皿中用剪刀将组织反复剪碎，加入2ml 50％浓度消化酶tryple室温消化，每隔5min充分混匀含消化酶的组织悬液，约20min左右，加入等体积含ca
2+
的hbss缓冲液中和并再次混匀；3)过滤：用不小于200目网径的滤网过滤步骤2)所得悬液，并离心，沉淀用5ml培养基重悬，并反复洗涤离心弃去坏死细胞碎片，离心转速500～1500r/min；4)种细胞：取上述洗涤所得细胞进行活细胞计数，用基质胶低温重悬细胞为8000个/30μl，种于已预热的24孔板中，30μl/孔，置于37℃培养箱30min待穹隆状基质胶凝固后，每孔添加培养基650μl；5)常规传代培养：培养基每3～5天更换一次，在第10～14天时进行传代操作，用tryple消化酶250μl/孔进行消化，每隔5分钟吹打混匀一次，10～15min可消化为单个细胞悬液，以hbss中和离心重悬后计数，以8000个细胞每孔继续传代，后续重复步骤4)和5)。4.一种权利要求1或2所述人结直肠癌原发灶与肝脏转移灶配对类器官细胞系或权利要求3所述方法培养得到的所述细胞系用于构建盲肠原位成瘤动物模型和/或肝脏转移灶成瘤动物模型并用来研究结直肠癌发生机理及耐药机理。5.一种肝脏转移灶成瘤动物模型的建立方法，其特征在于，它包括如下步骤：1)类器官培养：将类器官细胞使用慢病毒感染稳定过表达荧光素酶后，常规培养类器官，于传代后第4、7、9、11天分别换液，取处于对数生长期的cwh22和clm22类器官进行裸鼠脾脏注射转移成瘤操作；2)类器官消化：消化细胞过程与常规传代操作保持相同，消化为单细胞悬液状态，并计数，以dmem重悬为1.25*107/ml置4℃保温箱备用；3)脾脏注射：戊巴比妥麻醉裸鼠后，固定裸鼠并做腹部皮肤消毒，沿腹部左肋下缘腋前线前0.5cm处做纵向约1cm切口至腹腔，挑出脾脏后从脾脏远端注射混匀的细胞悬液约80μl/只裸鼠，10min后结扎脾脏血管剪除脾脏并缝合，密切观察确保顺利苏醒。4)成瘤监测：定期活体成像观察裸鼠肝转移成瘤情况并记录。6.一种盲肠原位成瘤动物模型的构建方法，其特征在于，它包括如下步骤：1)类器官培养：常规培养过表达荧光素酶的类器官cwh22和clm22，于传代后第4、7、9、11天分别换液，取处于对数生长期的类器官进行裸鼠盲肠壁注射操作；2)类器官收集：于第10～12天收集类器官，以tryple消化酶常规消化5min后，中和收集
类器官沉淀，约3*106细胞，预冷后重悬于60μl基质胶中置4℃保温箱备用；3)盲肠原位注射：戊巴比妥麻醉裸鼠后，固定裸鼠并做腹部皮肤消毒，沿下腹部正中线做纵向约1.5cm切口至腹腔并找到盲肠，将盲肠末端移至视野正中，以预冷胰岛素注射针抽取类器官悬液20μl做盲肠粘膜下注射，注射完毕观察无渗漏后，做腹部肌肉和皮肤缝合，并密切观察确保顺利苏醒；4)成瘤监测：定期活体成像观察裸鼠盲肠原位成瘤情况并记录。7.一种权利要求1或2所述人结直肠癌原发灶与肝脏转移灶配对类器官细胞系或权利要求3所述方法培养得到的所述细胞系在制备用于筛选治疗结直肠癌和/或肝转移灶肿瘤药物中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将治疗药物施用于体外细胞模型中，施用后抑制细胞增殖或导致细胞凋亡的为治疗敏感性药物，或者将测试化合物施用于体外细胞模型中，施用后抑制细胞增殖或导致细胞凋亡的为候选化合物。9.一种筛选用于治疗结直肠癌和/或肝转移灶肿瘤药物的方法，其特征在于，它包括取权利要求3培养的对数生长期的cwh22和clm22类器官消化计数重悬于基质胶并种于96孔板内，2*105个cell/ml，10μl/孔，待基质胶凝固后，添加培养基100μl/孔，培养5～6天时替换成梯度药物培养基继续培养，3天换液一次，药物作用6天后通过3d细胞活性检测，计算对应药物ic50。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述梯度药物培养基包含以下药物中的至少一种：5-氟尿嘧啶，奥沙利铂，伊立替康，依托泊苷，索托拉西布，瑞戈非尼，达沙替尼或硼替佐米。

技术总结
本发明公开了一种人结直肠癌原发灶与肝脏转移灶配对类器官细胞系及其培养方法与应用，属于消化系统肿瘤细胞系技术领域。它包括从一例右半结肠癌合并同时性肝转移患者的结肠病灶和肝脏转移灶肿瘤组织中分离肿瘤细胞通过3D培养得到保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏号为CCTCC NO.C202218的人右半结肠癌原发灶类器官细胞系CWH22，和保藏号为CCTCC NO.C202219的配对人右半结肠癌肝转移灶类器官细胞系CLM22。这对类器官细胞系能够在体外稳定传代培养、裸鼠成瘤性良好，可用于结直肠癌及肝转移的发病机制、耐药机理、新药筛选等方面的研究。筛选等方面的研究。筛选等方面的研究。


技术研发人员：程芳玲 许三鹏 陈孝平 张必翔 梁慧芳 董汉华 郭尔钢 江晶晶 张超
受保护的技术使用者：华中科技大学同济医学院附属同济医院
技术研发日：2022.11.21
技术公布日：2023/7/25