防治番茄细菌性病害的链霉菌、发酵液及制备方法和应用与流程

1.本发明涉及生防菌株及应用技术领域，特别是一种防治番茄细菌性病害的链霉菌、发酵液及制备方法和应用。


背景技术：

2.番茄是蔬菜设施栽培的主要作物，位于设施蔬菜种植面积的第一位。番茄安全生产对我省蔬菜的周年供应和满足人们生活水平的需要起着至关重要的作用。
3.番茄溃疡病(bacterial canker of tomato)是由是密执安棒形杆菌密执安亚种clavibacter michiganensis subsp.michiganensis(简称cmm)引起的一种细菌性维管束系统性病害。该病害寄主广泛传播方式多样，自1909年在美国密歇根州的温室首次发生以来，已经广泛分布于世界各国的番茄主要生产区给番茄生产带来了极大地危害。番茄溃疡病一旦发生，可造成减产25％—75％，而且呈逐年上升趋势，严重制约着番茄产业的发展。我国已于1995年将该病原菌列入《全国植物检疫对象名单》。
4.我国番茄种植面积大，分布区域广，主栽品种或品系多，遗传背景相对复杂，细菌性病害发生连年加重，长期、大面积使用化学农药，对环境、食品质量安全以及农业可持续发展带来了较大的安全隐患，而且还增加了对病原菌的选择压力，从而产生抗药性。随着人们对农产品质量安全要求的不断提高，国家对环境保护以及农业可持续发展的重视，对番茄溃疡病的防治也提出了更高要求，不但要有效地防治溃疡病的发生而且要符合现代农业的发展趋势。因此生产上迫切需要一种环保、高效的生物源农药来替代传统的化学农药，降低蔬菜农药残留，促进绿色食品生产，保障农业增效、农民增收和农业的可持续发展。


技术实现要素：

5.本发明的目的是要解决现有技术中存在的不足，提供一种防治番茄细菌性病害的链霉菌、发酵液及制备方法和应用。
6.为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：
7.本发明的第一个目的是要提供一种防治番茄细菌性病害的链霉菌，所述防治番茄细菌性病害的链霉菌为委内瑞拉链霉菌streptomyces venezuelae fk-11，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmcc no.25330，保藏日期为2022年07月18日，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
8.本发明的第二个目的是要提供一种防治番茄细菌性病害的链霉菌发酵液的制备方法，包括以下步骤：
9.将委内瑞拉链霉菌streptomyces venezuelae fk-11接种到装有由葡萄糖40g、酵母粉10g、氯化钠0.5g、甘油15ml、磷酸氢二钾2g组成的培养基的摇瓶中，所述培养基的初始ph值为7，所述委内瑞拉链霉菌streptomyces venezuelae fk-11接种量为8％，摇瓶放置于转速为180r/min、温度为28℃的摇床培养48h，即得防治番茄细菌性病害的链霉菌发酵液。
10.本发明的第三个目的是要提供一种防治番茄细菌性病害的链霉菌发酵液。
11.本发明的第四个目的是要提供一种防治番茄细菌性病害的链霉菌发酵液在防治番茄溃疡病中的应用。
12.与现有技术相比，本发明提供了一种土壤拮抗菌，是一种能产生氯霉素的链霉菌，从番茄根基周围土壤中分离、筛选得到，其发酵液能够有效抑制番茄细菌性病害的发生，尤其是番茄细菌性溃疡病及番茄青枯病。其来源于土壤，并且在抑制病害发生的同时能有效提升产量，作用方式为发酵液浸种，操作简便，省时省工，无毒，对环境友好，开发应用前景广阔，希望以此替代化学药品，减少化学品投入，减少环境污染，保障番茄的绿色高效生产。
附图说明
13.图1为本发明的委内瑞拉链霉菌streptomyces venezuelae fk-11的菌落形态图。
14.图2为本发明的委内瑞拉链霉菌streptomyces venezuelae fk-11的电镜照片。
15.图3为本发明的委内瑞拉链霉菌streptomyces venezuelae fk-11对溃疡病和青枯病的抑菌圈大小：(a)为对溃疡病的抑菌圈；(b)为对青枯病的抑菌圈。
16.图4为本发明的委内瑞拉链霉菌streptomyces venezuelae fk-11产生的抑菌活性物质图：(a)胞外蛋白酶；(b)纤维素酶；(c)卵磷脂酶。
17.图5为本发明的委内瑞拉链霉菌streptomyces venezuelae fk-11生理生化结果图：(a)淀粉水解结果；(b)h2s产生结果；(c)牛奶液化结果；(d)葡萄糖氧化发酵结果。
具体实施方式
18.为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。
19.实施例1：委内瑞拉链霉菌streptomyces venezuelae fk-11的分离筛选与鉴定。
20.供试菌株番茄青枯病菌和番茄细菌性溃疡病菌均由本实验室自主分离鉴定与保存
21.土样采集及菌株的分离纯化：采集长春、公主岭等地溃疡病及青枯病发病番茄植株及健康番茄植株根际土壤，过筛后，使用平板稀释法及平板划线法分离、纯化得到拮抗菌fk-11。
22.生防菌抑菌活性测定：采用平板对峙法对生防菌株进行筛选，将筛选到的生防菌株、番茄溃疡病菌及番茄青枯病菌分别接种到lb液体培养基中220rpm，28℃条件下震荡培养12h，分别取25ml番茄溃疡病菌菌液和青枯病菌均匀混入到250ml na固体培养基中倒平板；待凝固后用内径8mm的打孔器在平板上呈三角形打洞，用移液枪吸取拮抗菌20μl置于孔洞内，每个处理设3个重复，28℃培养48h，十字交叉法测量抑菌圈的大小。为了更直观的了解到链霉菌的抑菌效果，同时用无菌lb液体培养基、化学药剂农用链霉素和噻霉酮作对照。fk-11对溃疡病和青枯病抑菌效果如图3和表1所示。
23.表1
[0024][0025]
生防菌的形态学鉴定：将菌株fk-11采用平板划线法接种到高氏1号等不同培养基上，观察菌株的菌落形态，色素产生等特征；将生防菌在试管斜面培养基中划线培养；将适量超纯水加入到培养好的细菌试管中制成菌悬液；将等量的2％的磷钨酸钠染液与制成的菌悬液混合均匀；用移液枪吸取少量的混合液滴到铜网膜上；待铜网上的样品干燥后放到透射显微镜下观察。结果显示：fk-11菌株在高氏一号培养基中培养，表面有褶皱，产生红色色素，有刺激性气味，电镜下观察气生菌丝，孢子链呈双链状排列。见图1，图2。
[0026]
nacl耐受试验：高氏1号培养基中添加不同量的nacl，制成盐浓度分别为5，10，20，30，40，50，70，90，150和200g
·
l-1
的供试平板；将预先培养好的拮抗链霉菌制成孢子悬液，将链霉菌按顺序点接于同一盐浓度的平板中，置28℃下避光培养。发现fk-11在不同盐浓度条件下均能正常生长，10％条件下抑菌活性最好。
[0027]
温度耐受：将制备的链霉菌孢子悬液分别置于25℃、40℃、60℃、80℃、100℃、120℃下水浴处理30min。将链霉菌点接于na平板中，置28℃下避光培养，发现温度超过60℃菌株生长逐渐减缓，抑菌效果下降。
[0028]
ph耐受试验：取lb液体培养基，灭菌后用1m盐酸和1m氢氧化钠调节ph值分别为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，将活化后的生防菌株fk-11接入，28℃，180r/min震荡培养12h，将链霉菌点接于na平板中，置28℃下避光培养，检测到菌株在不同ph环境下均能生长但在ph6-9之间抑菌效果最好。
[0029]
在自然光照下照射6、12、24、36、48h，以未经照射处理的无菌发酵液作为对照，将链霉菌点接于na平板中，观察到菌株fk-11的生长没有明显变化，抑菌活性36h后开始下降。
[0030]
紫外线稳定性试验：取无菌发酵滤液在20w紫外灯下分别照射2、4、6、8h，并以未经照射处理的无菌发酵液作为对照，将链霉菌点接于na平板中，观察到菌株fk-11的生长和抑菌活性均没有明显变化。
[0031]
存放时间活性检测：将无菌发酵滤液分别存放于25℃和4℃冰箱，分别于7、14、30、60d检测抗菌活性，以未经处理的无菌发酵液作为对照，将链霉菌点接于na平板中，观察到菌株fk-11在4℃环境下生长和抑菌活性均没有明显变化，25℃环境中14天后抑菌活性开始下降。
[0032]
对蛋白酶的稳定性试验：无菌滤液与蛋白酶在37℃下反应1h，酶反应浓度均为
1mg/ml，将链霉菌点接于na平板中，观察到菌株fk-11的生长和抑菌活性均没有明显变化。
[0033]
胞外蛋白酶活力：蛋白培养基：取5g脱脂奶粉加入50ml蒸馏水中，另称1.5g琼脂溶于50ml蒸馏水中，将两液分开灭菌。待冷却至45～50℃时将两液混匀倒平板即成牛奶平板，将平板倒置过夜，使表面水分干燥，备用。将菌株点接入酪蛋白培养基上，30℃培养48h，观察到有明显透明圈，说明产生胞外蛋白酶见图4(a)。
[0034]
纤维素酶活性检测：幾甲基培养基：幾甲基纤维素钠5g，琼脂20g，磷酸二氧钾0.25g，mgso4.7h2o 0.1g，(nh4)2so
4 0.5g，定容至1000ml，ph7.0。将菌株点接入幾甲基培养基上，30℃培养48h，用1mg/ml的刚果红染色20min，倒掉刚果红染液后，1mg/mlnacl浸泡15min，用水洗去表面附着的刚过红，观察到明显透明圈产生，说明产生纤维素酶见图4(b)。
[0035]
溶磷能力的测定：将菌株点接于pko平板培养基上，每皿5个接菌点，各重复3次，置于28℃恒温培养箱培养5d后，观察到菌株在培养基平板上形成溶磷圈，说明菌株有解磷能力见图4(c)。
[0036]
菌株碳源利用情况：将新鲜的孢子悬浮液接种到不同的碳源培养基中，观察其生长情况。以普戈二号培养基为基础培养基，分别点入各种碳源0.2g(葡萄糖、甘油、阿拉伯糖、甘露醇等)，28℃恒温培养，第5d及第l0d观察。与对照比较，生长为利用碳源，不生长为不利用。具体利用情况参见表2。
[0037]
参照《链霉菌鉴定手册》、《放线菌系统学—原理、方法及实践》中推荐的培养基和方法测定fk-11菌株的生理生化特征发现：菌株fk-11为革兰氏阳性菌，接触酶反应阳性，氧化酶反应阴性，不可产生h2s，能使牛奶液化；可利用甘露醇、肌醇、鼠李糖等具体结果参见图5，表2。
[0038]
表2 fk-11的生理生化特征
[0039][0040]
注：“+”表示阳性，
“‑”
表示阴性。
[0041]
分子生物学鉴定：使用细菌基因组dna提取试剂盒获得菌株fk-11菌株的基因组dna，使用引物1492r和27f进行pcr特异性扩增，将获得的产物送至上海生工生物有限公司进行测序，获得16s rdna基因序列如seq.no1所示，具体为：
[0042]
aaagtcagttcaccttcgaagctccctcccacaaggggttgggccaccggcttcgggtgttaccgactttcgtgacgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcagcaatgctgatctgcgattactagcaactccgacttcatggggtcgagttgcagaccccaatccgaactgagaccggctttttgagattcgctccgcctcgcggcatcgcagctctttgtaccggccattgtagcacgtgtgcagcccaagacataaggggcatgatgacttgacgtcgtccccaccttcctccgagttgaccccggcggtctcctgtgagtccccatcaccccgaagggcatgctggcaacacaggacaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacagccatgcaccacctgtataccgaccacaaggggggcactatctctaatgctttccggtatatgtcaagccttggtaaggttcttcgcgttgcgtcgaattaagccacatgctccgctgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagttttagccttgcggccgtactccccaggcggggaacttaatgcgttagctgcggcaccgacgacgtggaatgtcgccaacacctagttcccaacgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgttcgctccccacgctttcgctcctcagcgtcagtaatggcccagagatccgccttcgccaccggtgttcctcctgatatctgcgcatttcaccgctacaccaggaattccgatctcccctaccacactctagcctgcccgtatcggatgcagacccggggttaagccccgggctttcacacccgacgtgaca
agccgcctacgagctctttacgcccaataattccggacaacgcttgcgccctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccggcgcttcttctgcaggtaccgtcactttcgcttcttccctgctgaaagaggtttacaacccgaaggccgtcatccctcacgcggcgtcgctgcatcaggctttcgcccattgtgcaatattccccactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccggtcgccctctcaggccggctacccgtcgtcgccttggtaggccattaccccaccaacaagctgataggccgcgggctcatccttcaccgccggagcttttaaccagctcccatgcggaagccggtgttatccggtattagaccccgtttccagggcttgtcccagagtgaagggcagattgcccacgtgttactcacccgttcgccactaatccaccccgaagggcttcatcgttcgactgcatggtagcattcgcatggcg。
[0043]
将获得的16s rdna序列与genebank数据库中序列进行blast比对，发现与委内瑞拉链霉菌streptomyces venezuelae的同源性为99％，基因序列见序列1。通过子生物学、形态学及生理生化鉴定，表明fk-11为委内瑞拉链霉菌streptomyces venezuelae，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmcc no.25330，保藏日期为2022年07月18日，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0044]
实施例2
[0045]
将委内瑞拉链霉菌streptomyces venezuelae fk-11接种到装有由葡萄糖40g、酵母粉10g、氯化钠0.5g、甘油15ml、磷酸氢二钾2g组成的培养基的摇瓶中，培养基的初始ph值为7，委内瑞拉链霉菌streptomyces venezuelae fk-11接种量为8％，摇瓶放置于转速为180r/min、温度为28℃的摇床培养48h，即得fk-11发酵液。
[0046]
实施例3
[0047]
fk-11发酵液能有效降低番茄细菌性病害发生，进行室内及田间试验进行验证。
[0048]
室内试验具体操作如下：
[0049]
通过盆栽试验，研究以不同方式接种fk-11对番茄溃疡病的防病效果，并确定最佳的作用方式。番茄育苗后，按照各处理移栽，1株/盆，试验共设置3个处理，每个处理30次重复。处理方案如下：
[0050]
处理1:常规催芽育苗并移栽。(ck)。
[0051]
处理2:移栽后每棵苗根部灌入fk-11发酵液50ml(t1)。
[0052]
处理3:番茄育苗前fk-11发酵液泡种10min，然后催芽育苗并移栽(t2)。
[0053]
处理1-3移栽时均在每棵苗根部分别灌入番茄溃疡病菌20ml。
[0054]
番茄幼苗移栽20d后，即番茄溃疡发病期，开始观测记录每个处理发病情况，根据公式来计算病情指数和防治效果，结果如表3所示。
[0055]
病情指数(di)＝100
×
σ(病级
×
该病级株数)/(最高病级
×
总株数)
[0056]
表3链霉菌fk-11对番茄溃疡病的室内防效
[0057][0058]
fk-11发酵液浸种处理效果优于灌根和对照组，说明fk-11发酵液在播前种子处理效果较佳。
[0059]
室外小区试验具体操作如下：
[0060]
田间试验每个小区面积5
㎡
，小区随机区组排列，每个试验设三次重复。设置清水对照组和处理组，两组处理在播种前用番茄溃疡病菌浸泡种子2分钟，晾干。然后处理组在番茄播前用fk-11发酵液浸种然后催芽播种，对照组正常清水催芽播种。相同方式管理，分别于定植后10天，40天处理组喷施fk-11发酵液，对照组喷施相同量的清水。调查对照组和处理组植株生长情况及果实产量。通过调查发现处理组植株生长相对健壮，发病轻，产量高于对照组，亩增产量为262.48千克，对照组病情指数为25.4，处理组病情指数为7.5。进一步验证了本发明的fk-11在抑制番茄溃疡病发生的同时能有效提升番茄的产量。
[0061]
实施例4
[0062]
通过盆栽试验，研究以不同方式接种fk-11对番茄青枯病的防病效果，并确定最佳的作用方式。番茄育苗后，按照各处理移栽，1株/盆，试验共设置3个处理，每个处理30次重复。处理方案如下：
[0063]
处理1:常规催芽育苗并移栽。(ck)。
[0064]
处理2:移栽后每棵苗根部灌入fk-11发酵液50ml(t1)。
[0065]
处理3:番茄育苗前fk-11发酵液泡种10min，然后催芽育种并移栽(t2)。
[0066]
处理1-3移栽时均在每棵苗根部分别注入番茄青枯病菌20ml。
[0067]
番茄幼苗移栽15-20d后，即番茄青枯病发病期，开始观测记录每个处理发病情况，根据公式来计算病情指数和防治效果，结果如表4所示。
[0068]
表4
[0069][0070]
fk-11发酵液浸种处理效果优于灌根和对照组，说明fk-11发酵液在播前种子处理效果较佳。
[0071]
室外小区试验具体操作如下：
[0072]
田间试验每个小区面积5
㎡
，小区随机区组排列，每个试验设三次重复。设置清水对照组和处理组，两组处理在播种前用番茄青枯病菌浸泡种子2分钟，晾干。然后处理组在番茄播前用fk-11发酵液浸种然后催芽播种，对照组正常清水催芽播种。相同方式管理，分别于定植后10天，30天处理组喷施fk-11发酵液，对照组喷施相同量的清水。调查处理组和处理组植株生长情况及果实产量。通过调查发现处理组植株生长相对健壮，产量高于对照组，亩增产量为174.48千克，对照组病情指数为10.4，处理组病情指数为5.5。进一步验证了本发明的fk-11在抑制番茄青枯病发生的同时能有效提升番茄的产量
[0073]
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种防治番茄细菌性病害的链霉菌，其特征在于：所述防治番茄细菌性病害的链霉菌为委内瑞拉链霉菌streptomyces venezuelae fk-11，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmcc no.25330，保藏日期为2022年07月18日，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号。2.一种防治番茄细菌性病害的链霉菌发酵液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将委内瑞拉链霉菌streptomyces venezuelae fk-11接种到装有由葡萄糖40g、酵母粉10g、氯化钠0.5g、甘油15ml、磷酸氢二钾2g组成的培养基的摇瓶中，所述培养基的初始ph值为7，所述委内瑞拉链霉菌streptomyces venezuelae fk-11接种量为8％，摇瓶放置于转速为180r/min、温度为28℃的摇床培养48h，即得防治番茄细菌性病害的链霉菌发酵液。3.一种如权利要求2所述的方法制得的防治番茄细菌性病害的链霉菌发酵液。4.一种如权利要求3所述的防治番茄细菌性病害的链霉菌发酵液在防治番茄溃疡病中的应用。

技术总结
本发明公开了一种防治番茄细菌性病害的链霉菌、发酵液及制备方法和应用，防治番茄细菌性病害的链霉菌为委内瑞拉链霉菌Streptomyces venezuelae FK-11，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.25330，保藏日期为2022年07月18日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。与现有技术相比，本发明提供了一种土壤拮抗菌，是一种能产生氯霉素的链霉菌从番茄根基周围分离、筛选得到，其发酵液能够有效抑制番茄细菌性病害尤其是番茄细菌性溃疡病及番茄青枯病，其来源于土壤，环境适应性强，并且在抑制病害发生的同时能有效提升产量，作用方式为发酵液浸种，操作简便，省时省工，对环境友好，希望以此替代化学药品，减少化学品投入，减少环境污染，保障番茄的绿色高效生产。保障番茄的绿色高效生产。保障番茄的绿色高效生产。


技术研发人员：刘燕妮 毛芙蓉 郑士金 王剑锋 韩青妍 崔洪博 郑建超 范惠冬
受保护的技术使用者：吉林省蔬菜花卉科学研究院
技术研发日：2022.09.22
技术公布日：2023/7/25