定量检测降钙素原和肝素结合蛋白的干式荧光免疫层析检测卡、试剂盒及检测方法与流程

1.本发明涉及生物医学检测领域，尤其涉及一种定量检测降钙素原和肝素结合蛋白的干式荧光免疫层析检测卡及试剂盒。


背景技术：

2.降钙素原(pct)是一种由甲状腺c细胞合成的降钙素原前体蛋白，由116 个氨基酸组成，分子量为13kda。当机体受到细菌内毒素刺激后，pct可在短时间内迅速升高，目前认为其是临床早期鉴别细菌和病毒感染，判断重症患者预后的重要指标。通常认为，pct反映了全身炎症反应的活跃程度，其影响因素包括被感染器官的大小和类型、细菌的种类、炎症的程度和免疫反应的状况等。即使没有细菌感染或细菌性病灶的情况下，在机体出现休克、免疫反应、脏器衰竭时，pct水平也会升高，但会弱于内毒素感染时。肝素结合蛋白(hbp)是多形核白细胞发分泌的重要颗粒蛋白，也是一种急性时相蛋白，会随着机体感染后中性粒细胞的聚集而释放，具有趋化特性，灭菌活性及炎症调节作用。作为新型炎症标志物，可对病情早期进行评估，判断病情的动态发展，指导临床用药具有较高的临床价值和重要意义。
3.目前，降钙素原/肝素结合蛋白常用的检测方法有放射免疫分析法、化学发光法、透射免疫浊度法，干式免疫荧光法，电化学发光法和胶体金比色法，这些方法各有优劣势，具体如下：
4.1)放射免疫分析法的原理是利用放射性核素标记抗原或抗体，与被测的抗体或抗原结合，形成抗原抗体复合物的原理来进行分析的。一种竞争性ria，标记的是抗原，其原理是未知抗原ag+标记抗原ag+已知定量抗体ab标记抗原与抗体复合物agab+未知抗原与抗体复合物ag ab+游离标记抗原ag(去除)(未知抗原多，标记抗原与定量抗体结合的复合物就少，表现为负相关)，另一种非竞争性ria，标记的是抗体，生成夹心状的抗体一抗原一抗体复合物，去除游离的标记抗体，测固相抗体一抗原一标记抗体复合物的放射性计数；这种方法耗时比较长，而且会出现交叉反应、假阳性反应。
5.2)化学发光标记免疫分析又称化学发光免疫分析，运用双单克隆抗体，分别与分子结合，这种方法可排除交叉反应。化学发光免疫分析仪包含两个部分，即免疫反应系统和化学发光分析系统。化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化，形成一个激发态的中间体，当这种激发态中间体回到稳定的基态时，同时发射出光子，利用发光信号测量仪器测量光量子产额。免疫反应系统是将发光物质(在反应剂激发下生成激发态中间体)直接标记在抗原(化学发光免疫分析)或抗体(免疫化学发光分析)上，或酶作用于发光底物。化学发光免疫分析仪器中核心探测器件为光电倍增管，由单光子检测并传输至放大器，并加高压电流放大，放大器将模拟电流转化为数字电流，数字电流将发光信号由r232数据线传输给电脑并加以计算，得出临床结果。化学发光免疫分析技术的优势在于灵敏度高、较宽的线性动力学范围、结果稳定、误差小；缺点是需要配对专业的化学发光仪器，且多为封闭式系统，不同厂家之间试剂和仪器不能通用，成本较高，操作比较耗时，
而且操作人员必须具备专门的操作技能。
6.3)透射免疫浊度法是抗原与抗体在一定缓冲液中形成抗原抗体复合物，当光线透过反应溶液时，由于溶液内抗原抗体复合物粒子对光线的反射和吸收，引起透射光减少，抗原抗体复合物越多透射光越少，可用吸光度表示，但是准确度低。
7.4)干式免疫荧光法是基于免疫荧光定量检测技术的干化学层析法：将检测缓冲液和血液样本在检测瓶中进行混合，缓冲液中的荧光标记抗抗体和血液中的抗原形成抗原抗体复合物，当混合样本被放到反应板的样品上并通过毛细血管作用扩散到硝酸纤维基质的测试带上，该复合物被测试带上的抗体所捕获，荧光抗体的信号强度反映了被捕获的数量，经过ichroma reader免疫荧光分析仪的处理，能够反映出血液样品中的浓度。这个方法制备简单，操作的成本也低，活性较差，会影响检测的结果。
8.5)电化学发光法是通过在电极上施加一定波形的电压或电流信号进行电解反应的产物之间或与体系中共存组分反应产生化学发光的现象。其灵敏度高、线性范围宽，仪器设备简单、易于实现自动化，仪器多为进口，成本比较昂贵，实验室要求高。
9.6)胶体金比色法采用胶体金的技术，形成金标记的抗原抗体复合物，该方法快速简便，容易操作，但是无法准确的判断含量。


技术实现要素：

10.鉴于上述问题，本发明所要解决的问题之一在于提供一种基于荧光免疫层析法且加入荧光微球、可实现操作简便、快速定量检测降钙素原和肝素结合蛋白的干式荧光免疫层析检测卡
11.本发明所要解决问题二在于及提供一种定量检测降钙素原和肝素结合蛋白的干式荧光免疫层析试剂盒。
12.本发明的技术方案一如下：
13.一种定量检测降钙素原和肝素结合蛋白的干式荧光免疫层析检测卡，其特征在于，所述检测卡包括试纸条以及适配纳置所述试纸条的卡壳；其中：
14.所述试纸条包括样品垫、结合垫、反应膜、吸收垫及底板；所述底板为长条结构状，所述反应膜粘贴在所述底板一表面的中部位置，所述反应膜左右两侧边分别与结合垫一侧边及吸收垫一侧边层叠扣压搭接；所述样品垫一侧边层叠扣压搭接在所述结合垫的另一侧边，且所述样品垫和吸收垫分别设置在所述底板的两端；所述结合垫上包被有荧光微球标记的降钙素原/肝素结合蛋白；在所述反应膜中部位置设置有相互平行的两条检测线和一条质控线，且两条检测线相邻；所述检测线包被降钙素原/肝素结合蛋白抗原；所述质控线包被鸡igy 单克隆抗体；
15.所述卡壳包括纳置腔、加样孔和观察窗；所述加样孔和观察窗分别与所述纳置腔贯通；当所述试纸条置于所述卡壳的纳置腔中时，所述样品垫通过加样孔外露、所述反应膜通过所述观察窗外露。
16.一实施例，所述干式荧光免疫层析检测卡中，所述结合垫上包被有荧光微球标记的识别不同表位的降钙素原/肝素结合蛋白抗体和荧光微球标记的羊抗鸡igy单克隆抗体。
17.一实施例，所述干式荧光免疫层析检测卡中，所述检测线与质控线的间隔距离为5
±
0.5mm。
18.一实施例，所述干式荧光免疫层析检测卡中，所述包被降钙素原/肝素结合蛋白抗原和包被鸡igy单克隆抗体的包被液为含0.01m蔗糖和0.01m ph为7.4 的pbs缓冲液组成的混合液，所述混合液的浓度为1mg/ml。
19.一实施例，所述干式荧光免疫层析检测卡中，所述样品垫为经表面活性剂缓冲液浸泡处理后干燥的玻璃纤维素膜。
20.一实施例，所述干式荧光免疫层析检测卡中，所述活性剂缓冲液为含有bsa、 ph8.0
±
0.05的tween－20及0.2m的硼酸－硼砂缓冲液。
21.一实施例，所述干式荧光免疫层析检测卡中，所述反应膜为硝酸纤维素膜制得。
22.一实施例，所述干式荧光免疫层析检测卡中，所述结合垫为玻璃纤维素膜制得。
23.本发明所要解决的方案二在于提供一种定量检测降钙素原和肝素结合蛋白的干式荧光免疫层析试剂盒，该试剂盒包含上述任一所述的干式荧光免疫层析检测卡、样本稀释液和芯片；所述芯片中存储有试剂标准曲线信息；所述样本稀释液用于稀释待检测血清、血浆和/或全血样本。
24.本发明还提供一种使用上述试剂盒进行血清、血浆和/或全血液中降钙素原和肝素结合蛋白含量的检测方法，包括如下步骤：
25.首先，将血清、血浆和/或全血液样本加入到样本稀释液中混合均匀，得到混合样本；
26.其次，将混合样本再加入到试纸条的样品垫上，10～15分钟内，由检测卡显示检测结果；
27.最后，将试剂盒中的检测卡插入配套的免疫荧光分析仪后，检测出血清、血浆和/或全血液样本中降钙素原和肝素结合蛋白的浓度。
28.本发明提供的定量检测降钙素原和肝素结合蛋白(pct/hbp)的免疫层析检测检测卡和试剂盒，其基于双抗体夹心法、荧光免疫侧向层析，提供高灵敏度降钙素原/肝素结合蛋白免疫层析定量检测试剂盒，且操作简便，直接加样本即可得到准确结果。使用本发明时，提高了检测灵敏度，并且具有操作流程简单、检测时间短、检测成本低等优点。
附图说明
29.图1为本发明提供检测卡的试纸条结构示意图；
30.图2为本发明提供检测卡的卡壳结构示意图。
具体实施方式
31.下面结合附图，对本发明的较佳实施例作进一步详细说明。
32.本发明提供一种定量检测降钙素原和肝素结合蛋白(pct/hbp)的免疫层析检测卡和试剂盒；其中，检测卡包括试纸条以及用于纳置试纸条的卡壳；具体如下。
33.如图1所示，pct/hbp免疫层析定量检测试纸条10，其包括pvc材质制得长条状构造的底板15、底板15上依次设有样品垫11、结合垫12、反应膜13和吸收垫14。吸收垫14一侧边及结合垫12一侧边分别层叠搭接在反应膜13的两个相对侧边，且反应膜13的表面形成检测区，检测区内固定有荧光标记包被的两条检测线16和鸡igy单克隆抗体包被的质控线(c线)17；两条检测线(t 线)16及质控线相平行间隔设置且两条检测线16相邻；检测线16与质控
线17 分别与底板15的短侧边平行；其中，结合垫12上包被荧光微球标记的识别不同表位的pct/hbp抗体和荧光微球标记的羊抗鸡igy单克隆抗体的，以及荧光微球标记的降钙素原/肝素结合蛋白抗原。
34.上述样品垫11为经表面活性剂缓冲液浸泡处理后干燥的玻璃纤维膜；其中，所述活性剂缓冲液为含有bsa、ph8.0
±
0.05的tween－20，0.2m的硼酸－硼砂缓冲液。
35.上述反应膜为硝酸纤维素膜制得，且结合垫为玻璃纤维素膜制得；吸收垫由h－1吸水纸制得。
36.如图2所示，卡壳20包括纳置腔21、加样孔23和观察窗22；加样孔23 和观察窗22分别与纳置腔21贯通；当试纸条10置于卡壳20的纳置腔21中时，样品垫12通过加样孔23外露、反应膜13通过观察窗22外露。也即是试纸条 10的底板15、样品垫11、结合垫12、反应膜13和吸收垫14均置于卡壳20内，且卡壳20壳面上对应于反应膜13的位置设有观察窗22，卡壳20壳面上对应于样品垫11的位置设有加样孔23。
37.本发明还提供一种定量检测降钙素原和肝素结合蛋白的干式荧光免疫层析试剂盒，该试剂盒包含上述干式荧光免疫层析检测卡、样本稀释液和芯片；芯片中存储有试剂标准曲线信息；所述样本稀释液用于稀释待检测血清、血浆和/ 或全血样本。
38.本发明的检测卡，利用荧光微球标记，提高检测灵敏度，降低非特异性结合，解决了pct/hbp检测灵敏度差的问题，并且操作流程简单、检测时间短、检测成本较低。另外，该试剂盒制备方法简单，可以实现批量生产，有利于大规模推广应用，具备广阔的市场前景。
39.使用上述试剂盒检测人体血清、血浆和/或全血液样本中的降钙素原和肝素结合蛋白含量时，按照表1所示的反应参数进行，其检测步骤如下：
40.首先，将血样样本，如人血清、血浆和/或全血样本加入到样本稀释液中混合均匀，得到混合样本；
41.其次，将混合样本再通过检测卡的卡壳上加样孔加入到试纸条的样品垫上，也就是检测卡的加样孔中，10～15分钟内，由检测卡的卡壳上的观察窗显示检测结果。
42.最后，反应膜的检测线上的荧光信号的强度则反映了被捕获的pct/hbp抗原数量，检测卡插入配套的免疫荧光分析仪后，能够检测出血液样本中pct/hbp 抗原的浓度。
43.表1反应参数
44.样本类型样本量加样量反应时间反应温度血清、血浆和全血100μl100μl15min18～30℃
45.检测原理如下：
46.本试剂盒采用双抗体夹心法，利用荧光免疫层析的技术原理。测试时，样本与缓冲液混匀，并滴加到试剂的加样孔中，在毛细效应下进行层析，样本中的pct/hbp抗原与荧光标记pct/hbp抗体结合，扩散至测试区的反应膜上，被检测线包被的pct/hbp单克隆抗体捕获，并形成“抗体－抗原－荧光抗体”复合物；样本中的pct/hbp浓度与复合物荧光强度成正比，根据设定的标准曲线，免疫荧光检测仪将荧光信号值转换成样本中pct/hbp浓度。
47.下面通过实施例进一步详细说明
48.实施例1一种降钙素原/肝素结合蛋白免疫层析检测试剂盒的组成成分、包装及数量(25人份/盒)，如表2所示。
49.表2试剂盒的组成成分、包装及数量
[0050][0051][0052]
实施例2试纸条的制作过程
[0053]
1)样品垫的制备
[0054]
a)样品垫为玻璃纤维膜，对样品垫进行预处理，使用含有bsa、ph(8.0
±ꢀ
0.05)的tween－20，0.2m的硼酸－硼砂缓冲液浸泡处理，置于温度(18～26)℃、相对湿度≤30％条件下干燥过夜(16～24)h。
[0055]
2)结合垫的制备
[0056]
将制备获得的荧光微球标记pct、hbp抗体、荧光微球标记的降钙素原/肝素结合蛋白抗原和荧光微球标记羊抗鸡igy抗体充分混匀后使用定量喷膜仪以 4μl/cm均匀喷涂于预处理过的玻璃纤维素膜上，放置于37
±
2℃，湿度≤30％环境中里干燥过夜16～24h。3)质控线和检测线的制备
[0057]
使用包被液，即含有蔗糖的0.01m，0.01m ph7.4 pbs缓冲液分别将鸡igy抗体和pct/hbp(降钙素原/肝素结合蛋白)抗原稀释到1mg/ml的浓度，质控线和检测线的距离为5
±
0.5mm，使用定量喷膜仪以1.0μl/cm均匀喷涂于硝酸纤维素膜上，放置在温度37
±
2℃、湿度≤30％电热鼓风干燥箱中干燥16～24h。
[0058]
4)试纸条的组装
[0059]
a)在湿度小于35％，温度20～30℃条件下进行试纸条的组装。在底板粘贴面的方向顺次连接且相邻部位部分重叠的样品垫、结合垫、反应膜及吸收垫。
[0060]
b)在nc膜粘覆底板时，检测线的位置靠近结合垫，质控线的位置靠近吸收垫，组装好后切割成宽度为3.85
±
0.05mm的试纸条。
[0061]
c)在底板上正确安装试纸条，吸收垫应装在底板的终端，置于压壳设备上压牢，得到试纸卡，备用。
[0062]
实施例3id芯片录入存储数据信息
[0063]
取已进行中间产品检测合格的试纸条、缓冲液，pct/hbp校准品，每个校准品至少有5个浓度，每个浓度至少测试3次，计算测试得出t/c值的均值。
[0064]
将配制浓度与相对应的t/c均值作为线性数据，将数据代入专用软件烧制芯片，贴好芯片标签。
[0065]
应当理解的是，上述针对本发明较佳实施例的表述较为详细，并不能因此而认为是对本发明专利保护范围的限制，本发明的专利保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：
1.一种定量检测降钙素原和肝素结合蛋白的干式荧光免疫层析检测卡，其特征在于，所述检测卡包括试纸条以及适配纳置所述试纸条的卡壳；其中：所述试纸条包括样品垫、结合垫、反应膜、吸收垫及底板；所述底板为长条结构状，所述反应膜粘贴在所述底板一表面的中部位置，所述反应膜左右两侧边分别与结合垫一侧边及吸收垫一侧边层叠扣压搭接；所述样品垫一侧边层叠扣压搭接在所述结合垫的另一侧边，且所述样品垫和吸收垫分别设置在所述底板的两端；所述结合垫上包被有荧光微球标记的降钙素原/肝素结合蛋白和荧光微球标记的羊抗鸡igy抗体；在所述反应膜中部位置设置有相互平行的两条检测线和一条质控线，且两条检测线相邻；所述检测线包被降钙素原/肝素结合蛋白抗原；所述质控线包被鸡igy单克隆抗体；所述卡壳包括纳置腔、加样孔和观察窗；所述加样孔和观察窗分别与所述纳置腔贯通；当所述试纸条置于所述卡壳的纳置腔中时，所述样品垫通过加样孔外露、所述反应膜通过所述观察窗外露。2.根据权利要求1所述的干式荧光免疫层析检测卡，其特征在于，所述结合垫上包被有荧光微球标记的识别不同表位的降钙素原/肝素结合蛋白抗体和荧光微球标记的羊抗鸡igy单克隆抗体。3.根据权利要求1所述的干式荧光免疫层析检测卡，其特征在于，所述检测线与质控线的间隔距离为5
±
0.5mm。4.根据权利要求1所述的干式荧光免疫层析检测卡，其特征在于，所述包被降钙素原/肝素结合蛋白抗原和包被鸡igy单克隆抗体的包被液为含0.01m蔗糖和0.01m ph为7.4的pbs缓冲液组成的混合液。5.根据权利要求4所述的干式荧光免疫层析检测卡，其特征在于，所述混合液的浓度为1mg/ml。6.根据权利要求1所述的干式荧光免疫层析检测卡，其特征在于，所述样品垫为经表面活性剂缓冲液浸泡处理后干燥的玻璃纤维素膜。7.根据权利要求6所述的干式荧光免疫层析检测卡，其特征在于，所述活性剂缓冲液为含有bsa、ph8.0
±
0.05的tween－20及0.2m的硼酸－硼砂缓冲液。8.根据权利要求1所述的干式荧光免疫层析检测卡，其特征在于，所述反应膜为硝酸纤维素膜制得；所述结合垫为玻璃纤维素膜制得。9.一种定量检测降钙素原和肝素结合蛋白的干式荧光免疫层析试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括权利要求1至8任一所述的干式荧光免疫层析检测卡、样本稀释液和芯片；所述芯片中存储有试剂标准曲线信息；所述样本稀释液用于稀释待检测血清、血浆和/或全血样本。10.一种使用权利要求9所述的试剂盒进行血清、血浆和/或全血液中降钙素原和肝素结合蛋白含量的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：首先，将血清、血浆和/或全血液样本加入到样本稀释液中混合均匀，得到混合样本；其次，将混合样本再加入到试纸条的样品垫上，10～15分钟内，由检测卡显示检测结果；最后，将试剂盒中的检测卡插入配套的免疫荧光分析仪后，检测出血清、血浆和/或全血液样本中降钙素原和肝素结合蛋白的浓度。

技术总结
本发明公开了一种定量检测降钙素原和肝素结合蛋白的干式荧光免疫层析检测卡、试剂盒及检测方法；其中，该检测卡中的试纸条包括样品垫、结合垫、反应膜、吸收垫及底板；反应膜粘贴在底板一表面的中部位置，反应膜左右两侧边分别与结合垫一侧边及吸收垫一侧边层叠扣压搭接；样品垫一侧边层叠扣压搭接在结合垫的另一侧边，且所述样品垫和吸收垫分别设置在所述底板的两端；在反应膜中部位置设置有相互平行的两条检测线和一条质控线，且两条检测线相邻；试纸条基于双抗体夹心荧光免疫侧向层析，提高了降钙素原/肝素结合蛋白定量检测灵敏度，试剂盒操作简便，直接加样本即可得到准确结果操作流程简单、检测时间短、检测成本低等优点。优点。优点。


技术研发人员：齐文闯 蒋析文 刘双 潘秀华 杨珍珍
受保护的技术使用者：广州达安基因股份有限公司
技术研发日：2022.01.12
技术公布日：2023/7/25