一种早期胃癌诊断标志物及其应用

1.本发明涉及医学检测领域，特别是涉及一种早期胃癌诊断标志物及其应用。


背景技术：

2.胃癌指源于胃黏膜上皮畑胞的恶性肿瘤，主要是胃腺癌，好发于中、老年人，发病高峰年龄在50-80岁，并呈逐年年轻化趋势，是全球高发的恶性肿瘤之一。胃癌可由多种因素影响，在慢性胃炎等各种胃部疾病，或幽门螺旋杆菌(hp)感染，以及不良饮食习惯、环境和遗传等多种因素的作用下，都可导致胃癌的发生。胃癌的发病率随着年龄的增加而显著增高，发病的高峰年龄在50～80岁。我国是胃癌的高发区，发病率高达40/10万，仅次于肺癌，已经跃居中国癌症发病率的第二位，胃癌年患病率和死亡率均是世界平均水平的2倍多。胃癌占癌症死亡人数接近四分之一，缺乏早期诊断的方法以及容易产生耐药是其高致死率背后的主要原因。
3.依据tnm分期判定标准，胃癌可分ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ期。ⅰ期为最早，ⅳ期最晚。我们常听说的早期胃癌仅指第ⅰ期，其余均称之为中晚期胃癌(又称为进展期胃癌)。早期胃癌无明显症状，随病情进展逐渐出现消化不良等胃部不适症状，胃癌早期症状多缺乏特异性，早期病例仅占胃癌手术病例的10％～20％，大约2/3的患者在确诊时已处于中晚期或出现淋巴结、血行转移，其5年生存率仅为20％～30％，而早期胃癌的5年生存率可达90％以上。因此，早诊断早治疗可以有效提高患者的生存率，减轻患者痛苦和社会经济负担。但是目前，胃癌的早期的发现率低，这主要与早期胃癌的症状不明显以及目前尚缺乏有效的早期胃癌检测手段有关。
4.目前对胃癌的检测方法主要包括：(1)早期胃癌三项检测：检测胃部腺体分泌的三种物质，即血清胃蛋白酶原ⅰ、血清胃蛋白酶原ⅱ，以及血清胃泌素17，能够反映胃部的萎缩情况，有助于胃癌早期的防治，但敏感度不高，存在漏检；(2)血清肿瘤标志物检测：结合癌胚抗原、癌抗原ca19-9、ca724、ca125等的检查，但这些传统标志物多在胃癌晚期才明显升高，所以诊断胃癌的阳性率较低，多在40％以下，且不适用于早期胃癌的检测；(3)胃镜检查：是目前诊断胃癌的“金标准”，大多数胃癌通过内镜检查加活检，能得到正确诊断，但仍有少部分胃癌，特别是小胃癌或微小胃癌可能被漏诊，且在胃镜检查过程中患者依从性差，不适反应多，限制了其作为胃癌筛查的临床应用；(4)影像学检查：包括ct检查、pet-ct检查、超声胃镜、x线钡餐等，但早期胃癌和癌前病变的影像学表现常缺乏特异性，故其在发现早期胃癌及微小病灶方面有一定的局限性；(5)病理活检：取一小部分组织做病理活检，镜下观察是否有癌细胞的存在，明确是否癌变，此方法为侵入式，患者依从性差，且不适用于胃癌的早期筛查。因此，寻找灵敏度高、特异性好、取材方便和适用性广的早期胃癌特异性生物学靶标成为胃癌防治迫切需要解决的问题。
5.microrna(mirna)是一类内生的长度约为20～24个核苷酸的小rna，其在细胞分化、生物发育及疾病发生发展过程中发挥巨大作用。据推测，mirna调节着人类三分之一的基因，每个mirna可以有多个靶基因，而几个mirna也可以调节同一个基因。mirna存在多种
形式，最原始的是pri-mirna，长度大约为300～1000个碱基；pri-mirna经过一次加工后，成为pre-mirna即microrna前体，长度大约为70～90个碱基；pre-mirna再经过dicer酶酶切后，成为长约20～24nt的成熟mirna。研究表明mirnas参与生命过程中一系列的重要进程，包括早期发育、细胞增殖、细胞凋亡、细胞死亡、脂肪代谢和细胞分化等，其在多种疾病中存在异常表达。随着对于mirna作用机制的进一步的深入研究，以及利用mirna芯片等高通量的技术手段对mirna和疾病之间的关系进行研究，越来越多的mirna正被发现可成为疾病诊断的特异性生物标记物，包括肿瘤、自身免疫性疾病、炎症性疾病和感染性疾病等。
6.现有胃癌的检测标志物和检测方法对早期胃癌检出率较低，容易造成漏诊，使患者不能及时得到治疗，从而严重降低患者的五年生存率。导致上述缺点的原因在于缺乏灵敏度高、特异性好的胃癌诊断标志物和诊断方法，尤其是针对早期胃癌，不能有效全面地进行确诊。


技术实现要素：

7.基于此，本发明的目的之一在于提供一种早期胃癌的特异性诊断生物标志物microrna-330-5p，其在用于胃癌检测时具有很好的灵敏度和特异性，可保证检测结果的准确性，尤其适用于早期胃癌的检测。本发明还提供了一种胃癌的检测方法。
8.实现上述目的的技术方案如下：
9.microrna-330-5p作为胃癌的检测标志物。
10.本发明的另一目的是提供microrna-330-5p的应用。
11.检测样本中microrna-330-5p表达水平的试剂在制备胃癌检测试剂盒中的应用。
12.本发明的另一目的是提供一种早期胃癌检测试剂盒。
13.实现上述目的技术方案如下.
14.一种早期胃癌检测试剂盒，包括有检测样本中microrna-330-5p表达水平的试剂。
15.在其中一些实施例中，所述试剂盒包含以下检测引物对：上游引物如seg id.no.1所示；下游引物如seg id.no.2所示。
16.在其中一些实施例中，所述试剂盒还包含检测内参基因表达水平的引物对。
17.在其中一些优选的实施例中，检测内参基因表达水平的引物对的如上游引物如seg id.no.3所示；下游引物如seg id.no.4所示。
18.在其中一些实施例中，所述待检测样本外周血，优选为血液、血清或血浆，进一步为外周血单个核细胞
19.(peripheral blood mononuclear cell,pbmc)。
20.本发明的另一目的是提供一种早期胃癌检测方法。
21.实现上述目的的技术方案包括如下。
22.一种早期胃癌检测方法，包括以下步骤：(1)收集待检测者的外周血样本，分离获得外周血单个核细胞；(2)提取外周血单个核细胞的总rna；(3)逆转录得到cdna；(4)qrt-pcr法检测microrna-330-5p的表达水平。
23.在其中一些实施例中，pcr中的检测引物对的上游引物如seg id.no.1所示；下游引物如seg id.no.2所示。
24.本发明提供了一种新的胃癌特异性检测标记物microrna-330-5p和检测方法，可
用于胃癌，尤其是早期胃癌的诊断。发明人首次发现，早期胃癌患者pbmc中microrna-330-5p的表达水平显著高于健康对照者，因此，microrna-330-5p可作为早期胃癌的特异性检测标记物。与现有检测方法相比，使用microrna-330-5p作为早期胃癌的检测标志物，可以获得更好的灵敏度和特异性(其roc曲线的曲线下面积为0.9180)，保证检测结果的准确性，实现早确诊早治疗，提高患者五年生存率，且取样方便无创，可大规模推广。
附图说明
25.图1为实施例i中临床样本中检测microrna-330-5p的表达的结果示意图。
26.图2实施例i中临床样本中检测的proc曲线示意图。
具体实施方式
27.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
28.下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
29.此外，如本发明所使用的，术语“或”是包含性的“或”符号，并且等同于术语“和/或”，除非上下文另有明确规定。术语“基于”不是排他性的，并且允许基于未描述的其他因素，除非上下文另有明确规定。此外，在整个说明书中，“一个”、“一种”和“所述/该”的含义包括复数指示物。“在......中”中的含义包括“在......中”和“在......上”。
30.以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
31.实施例1一、早期胃癌患者pbmc中microrna-330-5p的表达
32.1、采集28例经临床确诊为早期胃癌(依据tnm分期判定为ⅰ期)的患者以及32例健康志愿者的外周血，利用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(pbmc)：
33.(1)用pbs+2％fbs缓冲液将全血按体积比为1:1进行稀释，得到全血稀释液。
34.(2)在50ml离心管中加入与全血稀释液等体积的ficoll淋巴细胞分离液，将全血稀释液缓慢加入淋巴细胞分离液上方，不可使两者混合。
35.(3)将离心管于1800rpm离心20min，升5降0。
36.(4)小心拿出离心管，用吸管将白膜层吸出，加入等体积的pbs+2％fbs缓冲液上下颠倒洗涤一次，然后于2000rpm离心5min。
37.(5)弃上清，向细胞沉淀中加入红细胞裂解液，室温裂解3-5min，终止裂解，然后于2000rpm离心5min。
38.(6)弃上清，得pbmc细胞沉淀。
39.2、rna提取：
40.(1)向pbmc细胞沉淀中加入500μl trizol细胞裂解液，室温裂解10min。
41.(2)向细胞裂解液中加入200μl氯仿，涡旋振荡15s后室温放置10min。
42.(3)4℃，12000rpm离心10min，小心将上层清夜吸入无rna酶的离心管中。
43.(4)向离心管中加入500μl异丙醇，上下轻轻颠倒8～10次，室温放置10min。
44.(5)4℃，12000rpm离心10min，弃上清。
45.(6)加入1ml 75％酒精，洗涤沉淀，4℃，12000rpm离心10min。
46.(7)弃酒精，开盖室温放置5min后，加入30-50μl depc水溶解沉淀，测定浓度。
47.3、逆转录：
48.对rna进行逆转录获得cdna，反应体系如下：rna 0.5ug，rt引物工作液(62.5nm)2μl，depc水补足体系至11μl。体系混匀后70℃反应10min，冰育2min。然后加入以下体系：5
×
rt buffer 5μl，dntp mix(2.5mm)2μl，rnase inhibitor(40u/μl)0.5μl，rt酶(200u/μl)0.5μl，无rna酶水6μl。反应程序：42℃60min，70℃反应10min。获得的cdna直接进入下一步检测或冻于-20℃备用。
49.4、qrt-pcr检测microrna-330-5p的表达
50.反应体系如下：sybr green mix 9μl，cdna 2μl，forward primer(5μm)2μl，reverse primer(5um)2μl，rnase-free h2o 5μl。反应程序如下：95℃20s，95℃10s，60℃20s，70℃10s，第二步开始40个循环。
51.针对microrna-330-5p的检测引物如下：forward:5
’‑
ctctccgacctgccacaga-3’(seg id.no.1)；
52.reverse:5
’‑
aacctagatgggcgcgatct-3’(seg id.no.2)。
53.使用u6作为内参，其检测引物如下：forward 5'-tgcgggtgctcgcttcgcagc-3'(seg id.no.3)；reverse 5'-ccagtgcagggtccgaggt-3'(seg id.no.4)。
54.数据分析采用2
‑△△
ct
法，具体检测结果如图1所示，早期胃癌患者外周血pbmc中microrna-330-5p的表达量显著高于健康志愿者(p《0.001)，几乎在所有早期胃癌患者标本中的表达水平都上调，说明microrna-330-5p可作为早期胃癌的一个特异性检测指标，用于早期胃癌的诊断。
55.实施例2、microrna-330-5p对早期胃癌的诊断价值
56.为了评估microrna-330-5p对早期胃癌的诊断价值，根据实施例1中28例经临床确诊为早期胃癌患者以及32例健康志愿者的pbmc中microrna-330-5p的表达检测结果，进一步绘制了早期胃癌患者区别于健康志愿者的受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，简称roc曲线)，具体如图2所示。分析结果显示，曲线下面积(auc)为0.9180，表明microrna-330-5p作为早期胃癌的诊断标志物具有很高的灵敏度和特异性，可作为早期胃癌的特异性诊断标志物。
57.实施例3、microrna-330-5p作为检测标志物与现有检测方法的比较
58.分别检测15例早期胃癌疑似患者的血清胃泌素-17(gas-17)、血清胃蛋白酶原ⅰ和ⅱ(pgⅰ和pgⅱ)、pbmc中microrna-330-5p表达水平，同时进行胃镜联合胃粘膜活检检查。
59.血清胃泌素-17检测：使用非抗凝管收集疑似患者的血液，室温静置30min，然后于2000rpm/min条件下离心10min，收集血清；通过酶联免疫吸附法测试gas-17水平,检测试剂盒由芬兰biohit公司提供，操作步骤严格按照说明书进行。将gas-17小于等于1pmol/l或大于等于15pmol/l界定为gas-17阳性，反之为阴性。
60.血清胃蛋白酶原ⅰ和ⅱ检测：使用非抗凝管收集疑似患者的血液，室温静置30min，然后于2000rpm/min条件下离心10min，收集血清；通过酶联免疫吸附法测试胃蛋白酶原i和
胃蛋白酶原ii的含量，检测试剂盒由芬兰biohit公司提供，操作步骤严格按照说明书进行。将pgi小于等于70ug/l且pgi/pgii的比值小于等于7界定为胃蛋白酶阳性。
61.microrna-330-5p表达水平检测：方法同上。将疑似患者pbmc中microrna-330-5p表达水平与上述32例健康志愿者的平均表达水平进行比较，若疑似患者pbmc中microrna-330-5p表达水平高于健康志愿者平均表达水平的2倍以上，即判定为早期胃癌阳性，反之则为早期胃癌阴性。
62.15例疑似患者的检测结果如下(其中临床诊断结果为3个医生专家结合相关检测指标(包括胃肠镜检测)联合诊断的结果)：
63.表1 15例疑似患者的检测结果
64.[0065][0066]
由表1的结果可知，以临床诊断结果作为金标准，15例疑似患者中确诊早期胃癌患者7例，阴性8例。本发明提供的诊断标志物microrna-330-5p对早期胃癌的诊断结果准确率可高达100％，与临床诊断结果完全吻合；胃镜联合病理活检虽然也具有很高的准确率，患者依从性差，不适反应多，限制了其在早期胃癌筛查中的临床应用；而血清gas-17和胃蛋白酶原检测方法会出现部分假阴性，导致不能确诊，耽误治疗时机。上述结果说明microrna-330-5p作为早期胃癌的诊断标志物具有很好灵敏度和特异性，从而保证了诊断结果的准确性，并且取样无创，利于早期胃癌的临床大规模应用。
[0067]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：
1.一种胃癌的检测标志物，其为microrna-330-5p。2.检测样本中microrna-330-5p表达水平的试剂在制备胃癌检测试剂盒中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测样本中microrna-330-5p表达水平的试剂包括检测引物对：上游引物如seg id.no.1所示；下游引物如seg id.no.2所示。4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述样本外周血，优选为血液、血清或血浆，进一步优选为外周血单个核细胞。5.一种早期胃癌检测试剂盒，其特征在于，包括有检测样本中microrna-330-5p表达水平的试剂。6.根据权利要求5所述的早期胃癌检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含以下检测引物对：上游引物如seg id.no.1所示；下游引物如seg id.no.2所示。7.根据权利要求5或6所述的早期胃癌检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含检测内参基因表达水平的引物对。8.根据权利要求7所述的早期胃癌检测试剂盒，其特征在于，所述检测内参基因表达水平的引物对的上游引物如seg id.no.3所示；下游引物如seg id.no.4所示。9.一种早期胃癌检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)收集待检测者的外周血样本，分离获得外周血单个核细胞；(2)提取外周血单个核细胞的总rna；(3)逆转录得到cdna；(4)检测microrna-330-5p的表达水平。10.根据权利要求9所述的早期胃癌检测方法，其特征在于，所述检测方法为pcr法，优选地，pcr中的检测引物对为：上游引物如seg id.no.1所示；下游引物如seg id.no.2所示。

技术总结
本发明属于医学检验技术领域。本发明公开了一种新的用于诊断胃癌的特异性生物标志物microRNA-330-5p和检测方法，所述生物标志物microRNA-330-5p在用于胃癌检测时具有很好的灵敏度和特异性，尤其适用于早期胃癌的筛查，能满足临床上对早期胃癌的诊断需求，实现早确诊早治疗，提高患者的5年生存率。提高患者的5年生存率。


技术研发人员：范建兵 陈尚 余燕琪
受保护的技术使用者：南方医科大学
技术研发日：2022.01.11
技术公布日：2023/7/25