一种谷氨酰胺杆菌G2及其应用

一种谷氨酰胺杆菌g2及其应用
技术领域
1.本发明属于环境微生物技术领域，具体涉及一种谷氨酰胺杆菌g2及其应用。


背景技术：

2.随着工、农业生产的快速发展，以及人们生活中含磷产品的使用，导致大量含磷废水排入河流、湖泊中。大量的磷酸盐等含磷物质导致水体富营养化，日益为全球面临的水环境污染和生态安全的重要问题，同时也是水体保护最具挑战性的问题之一。其中高盐（含盐质量≥1%）含磷废水是一种难处理废水，盐度存在限制了传统废水除磷技术的应用。因此对磷进行有效去除是亟待解决的问题，对净化水体具有重要的意义。
3.目前，常用除磷技术包括物理除磷、化学除磷和生物除磷等，其中利用吸附、结晶等物理方法除磷虽然成本较低，但除磷效果不好，单独使用物理法除磷应用比较少。化学法操作简单，反应迅速，但药剂费用较高，易产生后续污染，除磷难以达到预期效果。生物法使用较多，无二次污染，成本较低，但对水质盐度变化较敏感，高盐废水单一微生物除磷的效果比较差，难以达到排放标准。
4.在生物除磷系统中，聚磷菌被认为起到了主要的作用。聚磷菌在好氧条件下，聚磷菌氧化分解胞内的 β-羟基烷酸盐（pha）为自身提供能量，同时从外界吸接磷酸盐、聚磷酸物；在厌氧条件下，依靠水解细胞内贮存的多聚磷酸盐以获取能量，并将正磷酸盐释放到胞外，还能通过发酵胞外的有机大分子生成挥发性脂肪酸并贮存在胞内。目前使用较多的聚磷菌主要包括：不动杆菌属、气单胞菌属、棒杆菌属、微丝菌、酵母菌等。
5.生物除磷由于其除磷效果好、二次污染少等特点，广泛应用于含磷废水的修复与治理，而高盐含磷废水是目前难处理的废水之一，因此筛选挖掘耐高盐除磷微生物，对于水体磷去除，尤其是高盐含磷废水治理有广阔应用前景。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种既可高效聚磷，又具有良好除臭能力的耐盐谷氨酰胺杆菌g2，利用其同时进行聚磷和除臭，可在富营养化污染水体治理、堆肥及有机肥生产过程中进行应用。
7.本发明采用如下技术方案：一种谷氨酰胺杆菌（glutamicibacter halophytocola）g2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmcc no. 20968，保藏日期为2020年10月29日。
8.该谷氨酰胺杆菌g2在富磷培养基上生长，菌体呈短小杆状，革兰氏染色呈阴性，无鞭毛，无芽孢；需氧，过氧化氢酶阳性，不能移动。最适生长温度为25~28℃，ph为7.0~7.5。菌株吐温80、淀粉水解、吲哚、硫化氨和以精氨酸脱羧酶试验均呈阳性，明胶不液化，纤维素水解、vp、甲基红、葡萄糖发醇、硝酸盐还原试验均为阴性。
9.该谷氨酰胺杆菌g2最适生长nacl浓度为6%，最高nacl耐受浓度为13%。
10.该谷氨酰胺杆菌g2具有聚磷、除臭和耐盐能力。
11.一种谷氨酰胺杆菌g2在堆肥和沼液处理中的应用。
12.一种利用谷氨酰胺杆菌g2进行堆肥和沼液处理后得到的固体或液体有机肥。
13.一种谷氨酰胺杆菌g2在治理富营养化水体、高盐富营养化水体或黑臭水体中的应用。
14.具体的应用中，所述谷氨酰胺杆菌g2的接种量为污染水体体积的1～5 %且谷氨酰胺杆菌g2含量不低于108个/ml。
15.一种谷氨酰胺杆菌g2在治理高盐富营养化水体中的应用。
16.本发明的有益效果在于：（1）利用本发明的谷氨酰胺杆菌g2，用于农业畜禽粪污等废弃物堆肥可以有效降低恶臭气体产生。（2）利用本发明的谷氨酰胺杆菌g2对沼液后处理，不仅可以回收磷，而且处理后的废物可生产有机肥，为植物提供磷肥。（3）利用本发明的谷氨酰胺杆菌g2，不仅可以提高富营养化废水除磷效率，而且可用于高盐含磷废水，有效减少恶臭污染，还可以为生物除磷、微生态除臭剂的开发提供优质的菌种资源，有着切实的经济、社会效益和广阔的应用前景。
附图说明
17.图1为谷氨酰胺杆菌g2的系统发育树。
18.图2 为nacl浓度对谷氨酰胺杆菌g2生长和除磷的影响。
具体实施方式
19.下面结合实施例和附图对本发明做进一步的说明。本发明保护范围不限于实施例，本领域技术人员在权利要求限定的范围内做出任何改动也属于本发明保护的范围。
20.实施例1谷氨酰胺杆菌g2分离和保藏谷氨酰胺杆菌 g2是从河北省邯郸市临漳县试验田土壤样品中，通过富集培养、传代、蓝白斑初筛、异染颗粒染色复筛等分离获得。
21.具体方法是：于试验田采集深度为0~20 cm的土壤样品，准确称取1 g加入100 ml富集培养基中，28 ℃ 180 r/min振荡培养2~3 d得到驯化菌液。连续传代5次稳定后，采用梯度稀释平板法获得不同形态单菌落，经多次划线纯化，转接到斜面于28℃条件下培养48 h，4℃冰箱保存备用。
22.采用蓝白斑筛选法对上述纯菌落进行聚磷菌的初筛。方法为：将在富集培养基平板上分离纯化得到的菌种点接到mops限磷、过磷平板中，28 ℃条件下培养2 d，观察蓝白斑生长情况。挑取在mops限磷、过磷平板上均显蓝色的菌落进行保存。
23.采用异染颗粒染色法对初筛得到的菌株进行复筛。异染颗粒采用albert染色法染色，异染粒呈黑色，菌体其他部分呈绿色。
24.采用培养基：富集培养基（/l）：乙酸钠5 g，牛肉膏3 g，蛋白胨 10 g，nacl 5 g， kh2po
4 0.02 g，ph7.0~7.2。
25.葡萄糖
‑ꢀ
mops培养基（10
×
）：mops 8.370 g，tricine 0.717 g，30 ml无菌水，10 mol/l koh调ph至7.4，定容到 44 ml；0.01 mol/l新鲜配置的feso
4 1 ml；按下列顺序加溶
液：nh4cl（1.9 mol/l）5 ml， k2so4（0.276 mol/l）1 ml，cacl2·
2h2o（0.02 mol/l）0.025 ml, mgcl2·
6h2o（2.5 mol/l）0.21 ml，nacl（5 mol/l）10 ml；微量元素混合液 0.02 ml，葡萄糖 0.1 g，微量thiamine 溶液1 ml，定容到 100 ml，用无菌滤器过滤后备用。
26.富磷培养基（/l）：乙酸钠0.5 g，牛肉膏 0.22 g， (nh4) 2
so
4 0.2 g，k2hpo
4 0.0147 g，caso
4 0.08 g，mgso
4 0.4 g，feso
4 0.002 g，ph7.0~7.2。
27.该菌株g2在富磷培养基上生长，菌体呈短小杆状，革兰氏染色呈阴性，无鞭毛，无芽孢；菌株菌落圆形、淡黄色，边缘整齐，隆起、表面光滑，粘稠。
28.菌株g2的生理生化鉴定试验参考《常见细菌系统鉴定手册》。需氧，过氧化氢酶阳性，不能移动。最适生长温度为25~28℃，最适生长ph为7.0~7.5，最适生长nacl浓度为6%，最高耐受13%。菌株吐温80、淀粉水解、吲哚、硫化氨和以精氨酸脱羧酶试验均呈阳性，明胶不液化，纤维素水解、vp、甲基红、葡萄糖发醇、硝酸盐还原试验均为阴性。
29.菌株g2的16s rdna序列测定：选取处于对数生长期的菌液，用天根公司细菌基因组dna提取试剂盒提取菌株基因组dna，以其为模板，进行pcr扩增。
30.扩增引物为：27f（5'-agagtttgatcctggctcag-3'）和1492r（5'-ggttacc ttgttacgactt-3'）。
31.pcr反应程序：98 ℃预变性5 mim，循环95 ℃ 35 s，55 ℃ 35 s，72 ℃40 s，35个循环，延伸8 min。
32.由上海生工公司进行pcr产物测序，菌株g2的16s rdna序列如seq id no.1所示。测序完成之后用dnaman软件构建系统发育树（具体见图1）。根据菌株形态学和16s rdna序列分析，菌株g2被鉴定为谷氨酰胺杆菌（glutamicibacter halophytocola）g2。将谷氨酰胺杆菌g2于2020年10月29日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行了保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmcc no. 20968，保藏日期为2020年10月29日。
33.实施例2 谷氨酰胺杆菌g2不同初始磷浓度条件下生长及除磷特性谷氨酰胺杆菌g2活化后，将浓度调整为1
×
10
10 cfu/ml，以体积比1%接种于初始磷质量浓度分别为2、5、8、10 mg/l的富磷液体培养基中，28℃180 r/min振荡培养48~72 h至菌液变浑浊。发酵液8000 r
·
min-1
离心10 min，取上清过0.22 μm滤膜测定培养前后培养液中磷质量浓度并计算各处理的除磷率。
34.测定方法：（1）菌浓测定：比浊法，采用分光光度计600 nm处吸光度值od
600
来表示菌体的细胞浓度。
35.（2）总磷：总磷采用gb 11893-1989《钼锑钪分光光度法测定》。
36.（3）除磷率：除磷率=（对照总磷量-上清总磷量）/对照总磷量
×
100%。
37.试验结果具体见表1，随着初始磷浓度的提高，磷去除率呈下降趋势，但是，当初始磷浓度为2 mg/l时，磷去除率达92%以上，初始磷浓度为5 mg/l时，磷去除率达85.18%。
38.表1不同初始磷浓度对菌株g2生长及除磷效果的影晌
。
39.实施例3谷氨酰胺杆菌g2除臭能力测定（1）除氨率测定取18 ml谷氨酰胺杆菌g2菌液（菌体含量1
×
10
8 cfu/ml）于2 l大烧杯中，并加入500 mg/l的氨水2 ml；再往大烧杯中放入装有20 ml 0.005 n硫酸吸收液的50 ml小烧杯，盖上双层塑料薄膜密封。以等量的无菌水作为对照，重复3次，置于28 ℃培养箱中培养。24 h后，取出小烧杯检测氨的浓度。
40.氨的测定方法：纳氏试剂比色法。
41.氨去除率：氨去除率=（对照吸收液中氨浓度-处理吸收液中氨浓度）/对照吸收液中氨浓度
×
100%。
42.结果发现，在24 h内，菌株g2的脱氨率达70%以上。
43.（2） 硫化氢去除率测定谷氨酰胺杆菌g2摇瓶培养，制成菌悬液（菌体含量1
×
10
8 cfu/ml），按10%的接种量接入含有100 ml基础发酵培养基的300 ml大试管中，另加入2 ml硫化氢质量浓度为1000 μg
·
ml-1
的硫化氢标准溶液，大试管内悬挂一个装有10 ml氢氧化镉－聚乙烯醇磷酸铵溶液的小容器用于吸收硫化氢气体。对照组不加菌液，加入等量的无菌水，每个处理做3个重复，置于28 ℃培养箱内避光恒温培养，48 h后测量吸收液中的硫化氢含量及大试管中残留的硫化氢含量，按照下述公式计算硫化氢去除率，硫化氢的测定用亚甲基蓝分光光度法。
44.硫化氢去除率=(对照吸收液中硫化氢浓度-处理吸收液硫化氢浓度)/对照吸收液中硫化氢浓度
×
100%。
45.结果发现，在48 h内谷氨酰胺杆菌g2的h2s去除率达65%以上。
46.实施例4谷氨酰胺杆菌g2耐盐除磷能力由图2可知，谷氨酰胺杆菌g2具有较高的耐盐性，当富磷培养（见实施例1）基中nacl的浓度为0%至6%时，随着nacl浓度的提高，菌株的繁殖能力逐渐增高，当nacl浓度为6%时，此菌株的od
600 nm
值最大，此菌株的最适宜生长nacl浓度是6%。当nacl浓度处于8%至15%时，随着nacl浓度的提高，此菌株的od
600 nm
值显著降低。同时当nacl的浓度范围是0%至6%时，随着nacl浓度的提高上清液去磷率有较为显著的提高，当nacl浓度大于8%，生长量及上清液的去磷率均开始下降。
47.实施例5-7 谷氨酰胺杆菌g2在人工合成废水中的除磷效果谷氨酰胺杆菌g2活化后，将浓度统一调整为1
×
10
10 cfu/ml，以体积比1~5%分别接种于人工合成废水中（废水配方见表2），28 ℃ 180 r/min振荡培养48 h。取菌液适量，经8000 rpm离心10 min，过0.22 μm滤膜，按总p测定法测定上清液的磷含量，并与未接菌的人工合成废水的值对照，计算p的去除率。
48.表2 人工合成废水配方
。
49.试验结果具体见表3。在含磷废水中，投加1%-5%的谷氨酰胺杆菌g2，随着添加菌量的增加，磷去除率呈增高趋势，但磷去除率均达80%以上。
50.表3谷氨酰胺杆菌g2除磷效率测定。
51.实施例8 谷氨酰胺杆菌g2对黑臭富营养水体的模拟处理试验菌种的扩大培养：谷氨酰胺杆菌g2活化培养24 h后，取培养液离心，收集菌体，无菌水洗涤2次，制成1
×
10
9 cfu/ml的菌悬液。
52.室外大桶模拟处理试验：取6个25 l的聚氯乙烯大桶，装入 20 l 试验水样，以不加菌为对照处理，每个处理三次平行。投加上述接种液后，接种量5%，动态监测水质指标变化情况（从水面下10 cm处取测试水样）。
53.表4 模拟富营养化黑臭水体水质指标处理前后比较。
54.试验具体结果见表4，磷浓度由5.68 mg/l降低至0.75 mg/l，去除率达86.80%，恶臭基本消除。
55.实施例9-10实施例9采用的是猪场粪水厌氧发酵沼液、实施例10采用的是奶牛场粪水厌氧发酵沼液。
56.具体处理步骤如下：（1）将固液分离后的沼液，倒入反应器中。
57.（2）在反应器中投加质量比为1~10%的g2的菌剂，搅拌混匀，保持20-48 h。
58.（3）处理沼液离心，得到滤后固体，将滤后固体用于缓释有机肥料或人工育苗基质
的生产。
59.结果见表5，在沼液中投加不同量菌剂后，总磷的浓度均显著下降，去除率大于80%。
60.表5谷氨酰胺杆菌g2处理沼液结果。
61.根据上述的实施例对本发明作了详细描述。需说明的是，以上的实施例仅仅为了举例说明发明而已。在不偏离本发明的精神和实质的前提下，本领域技术人员可以设计出本发明的多种替换方案和改进方案，其均应被理解为在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种谷氨酰胺杆菌（glutamicibacter halophytocola）g2，其特征在于，其保藏编号为cgmcc no. 20968。2.根据权利要求1所述的谷氨酰胺杆菌g2，其特征在于，其具有聚磷能力。3.根据权利要求1所述的谷氨酰胺杆菌g2，其特征在于，其具有除臭能力。4.根据权利要求1所述的谷氨酰胺杆菌g2，其特征在于，其具有耐盐能力。5.根据权利要求1所述的谷氨酰胺杆菌g2，其特征在于，其兼具聚磷能力、除臭耐盐能力。6.一种如权利要求1所述的谷氨酰胺杆菌g2在堆肥和沼液处理中的应用。7.一种利用权利要求1所述的谷氨酰胺杆菌g2进行堆肥和沼液处理后得到的固体或液体有机肥。8.一种如权利要求1所述的谷氨酰胺杆菌g2在治理富营养化水体、高盐富营养化水体或黑臭水体中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述谷氨酰胺杆菌g2的接种量为污染水体体积的1～5 %，且谷氨酰胺杆菌g2含量不低于108个/ml。

技术总结
本发明公开了一种谷氨酰胺杆菌（Glutamicibacter halophytocola）G2，保藏编号为CGMCC No.20968，该菌株具有较高的聚磷、除臭能力和耐盐性能，本发明同时公开了该菌株在有机废弃物堆肥、沼液、富营养化水体、黑臭水体治理等方面的应用。体治理等方面的应用。体治理等方面的应用。


技术研发人员：程辉彩 习彦花
受保护的技术使用者：河北省科学院生物研究所
技术研发日：2022.01.11
技术公布日：2023/7/25