一种检测花生抗咪唑啉酮类除草剂基因AhALS-G1709T的引物与应用

一种检测花生抗咪唑啉酮类除草剂基因ahals-g1709t的引物与应用
技术领域
1.本发明涉及花生育种技术领域，具体的，涉及一种检测花生抗咪唑啉酮类除草剂基因ahals-g1709t的引物与应用。


背景技术：

2.花生是重要的油料作物和经济作物，在满足人类食用植物油需求中发挥关键作用。在我国，花生是食用植物油的第二大来源，是总产量最大的油料作物，其单位面积种植效益已跃居大宗农作物前列。近年来，随着现代农业生产的加快发展，花生生产正在向规模化、集约化、机械化、轻简化方向发展。然而，长期以来，田间杂草危害一直是困扰花生生产的技术难题，花生田杂草危害期长、防控难度大，严重影响花生的产量和品质，已成为实现我国花生高产、高质、高效发展的主要制约因素。除草剂已成为现代农业生产中防治杂草的关键技术，而且随着机械化和规模化水平提高对其依赖程度在不断增加。然而，花生上可供选择的安全、适用的除草剂种类有限，尤其是对花生安全的防阔叶杂草的除草剂更为稀缺，用药不当往往会对作物造成不同程度的药害。而且，目前生产上一些推广种植的花生品种对除草剂较为敏感，在轮作条件下上茬作物除草剂残留也会对茬口花生造成药害。因而，培育具有除草剂抗性的花生品种是防治花生田杂草危害的经济、有效途径。
3.咪唑乙烟酸是一种咪唑啉酮类内吸传导型选择性芽前及早期苗后除草剂，由于其活性高、用量低、杀草谱宽、选择性强，广泛用于花生等豆科作物田，能有效防除一年生禾本科杂草和阔叶杂草。咪唑乙烟酸除草的作用机理是以杂草体内的乙酰乳酸合成酶(als酶)为作用靶标，除草剂能与als酶形成复合物阻断底物进入酶活性位点通路，抑制als的活性，使支链氨基酸如亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸的合成受阻，导致植物死亡。由于als抑制剂类除草剂的作用靶标单一，在持续的除草剂选择压力下，诱导杂草体内基因表达发生变异或者基因突变，导致杂草对除草剂的敏感性降低，而产生抗药性杂草。据不完全统计，自1987年有抗als抑制剂类除草剂杂草的报道以来，至目前大约已有167种杂草对其产生了抗性。
4.抗性机制研究表明，植物als基因保守区发生错义突变会导致酶结构或空间构象发生变化，降低对除草剂的亲和力，进而产生抗性。所以，作物对咪唑啉酮类除草剂的抗性则来自als编码基因的一个或多个氨基酸变异而导致酶的结构变化。至今，已报道als抗除草剂位点主要有8个氨基酸残基：包括ala122，pro197，ala205，asp376，arg377，trp574和ser653。不同的氨基酸位点突变还会产生对多种除草剂的交互抗性，并显示出抗除草剂水平的差异。目前，主要通过培育抗除草剂作物来解决抗性杂草的危害问题。
5.抗除草剂作物的培育可通过转基因和非转基因两条途径。早期抗除草剂作物品种的培育主要是从自然界中直接选择抗性植株，在此基础上利用传统杂交育种，使抗除草剂性状遗传给后代，培育兼具抗除草剂的优良新品种。另外，还借助种子萌发或细胞培养过程进行人工诱变，获得除草剂抗性。近年来，植物转基因技术也为抗除草剂作物培育提供了一条崭新的途径。最近，除草剂抗性也成为作物基因编辑技术研究的热点农艺性状，利用基于
同源重组的crispr/cas9等系统对als等靶标酶编码基因的保守核苷酸序列进行定点编辑，获得具有特定除草剂抗性的新材料。总结国内外抗除草剂作物育种研究，不难发现，获得具有除草剂抗性的基因或种质是作物抗性育种的基础。目前在水稻、玉米、大麦等粮食作物和大豆、油菜、油葵等油料作物上，已经利用诱变、基因编辑等技术创制出大量基于als基因不同位点突变的抗性基因和种质资源，然后通过转基因导入其他常规品种或者通过杂交、回交等方法转育其他无抗性的品种或品系，提高了导入目标品种对除草剂的耐受性。然而，与其他作物相比较，花生除草剂抗性研究严重滞后，目前还没有关于抗除草剂花生基因克隆或者抗性种质创制的报道。前期研究中，通过体外定点突变技术，我们在花生中鉴定和筛选到一个抗咪唑啉酮类除草剂的als突变基因ahals-g1709t。利用基因枪介导在常规品种中过表达，阳性转基因t1代植株就能忍耐10倍推荐剂量的咪唑乙烟酸，喷药后无明显药害症状，仍能正常生长。花生抗性基因的发掘为花生抗药性机理研究和抗除草剂花生品种的培育提供了重要的基因资源。
6.花生抗性品种选育中，利用ahals-g1709t基因的方法是将含有该抗性基因的转基因材料与其他不具抗性的优良品种杂交或者回交，在分离世代通过除草剂抗性分离进行抗性个体鉴定和筛选，选出携带抗咪唑啉酮类除草剂基因的抗性单株。该选育途径易受外界条件影响，尤其是除草剂施用不当或喷药不均匀时极易造成选择错误，难以实现选育目标。另一方面，抗性性状为显性性状，在抗性基因杂合或纯合世代均表现为除草剂抗性，选育过程中容易出现抗性后代的抗性性状再分离，需要在下一代再选一次，因而选育周期长、工作量大。
7.利用目标抗性基因存在的单碱基变异(snp)，设计共显性的功能标记，可准确检测除草剂抗性基因，进行抗性性状标记辅助选择，是目前提高除草剂抗性品种选育效率和准确性的最优方法。针对已经发现的抗性基因变异位点，水稻、油菜等作物开发出了几种标记方法，如等位基因特异pcr法(as-pcr)、竞争性等位基因特异性pcr法(kasp)、扩增阻碍突变系统pcr法(arms-pcr)、dna片段测序法、酶切扩增多态性序列(caps)等。其中，caps标记技术将pcr扩增和酶切反应相结合，所需dna量极少，又可用琼脂糖电泳分析，具有操作简便、结果稳定可靠等特点，而且caps标记呈共显性，即可区分纯合基因型和杂合基因型，因而其能在广泛的遗传背景下有效追踪目标基因，重复性高。caps标记技术已在植物抗除草剂基因检测、作物抗性育种实践中广泛应用，获得了较为理想的效果。然而，栽培花生属于异源四倍体物种(aabb，2n＝4x＝40)，通过两个二倍体野生种a.duranensis(aa，2n＝20)和(bb，2n＝20)自然杂交后再经过染色体加倍形成，其基因组庞大，重复序列比例高，包括als在内的大量基因多以基因家族或者多拷贝的形式存在，这些同家族基因的具有高度的核酸水平上的同源性，功能分化的不同基因成员的序列一致性高，因而使得设计特异分子标记来检测花生除草剂抗性基因难度更大。迄今，国内外还没有发表过花生对除草剂抗性分子标记的相关报道。


技术实现要素：

8.针对抗除草剂作花生育种技术的不足，本发明提出了一种检测花生抗咪唑啉酮类除草剂基因ahals-g1709t的引物与应用，填补了抗咪唑啉酮类除草剂花生选育中辅助选择分子标记的空白，解决现有技术中难以有效筛选花生抗咪唑啉酮类除草剂品种以及现有筛
选技术效率低、准确性差等问题。
9.本发明的技术方案如下：
10.本发明提出了一种检测花生抗咪唑啉酮类除草剂基因ahals-g1709t的caps分子标记引物，所述caps分子标记引物的核苷酸序列如seq id no1、seq id no2所示。
11.本发明还提出了所述的caps分子标记引物在花生育种中的应用。
12.本发明还提出了所述caps分子标记引物在鉴定抗咪唑啉酮类除草剂花生品种中的应用。
13.本发明还提出了所述的caps分子标记引物在鉴定花生抗咪唑啉酮类除草剂基因ahals-g1709t中的应用。
14.作为进一步的技术方案，所述应用包括以下步骤：
15.s1、提取待测花生基因组dna；
16.s2、采用所述caps分子标记引物对提取的待测花生基因组dna进行pcr扩增，得到扩增产物；
17.s3、将扩增产物用mfei限制性内切酶进行酶切，获得酶切产物；
18.s4、酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据酶切产物的带型判断待测花生的基因型。作为进一步的技术方案，所述根据酶切产物的带型判断待测花生的基因型包括以下情况：
19.1)、电泳检测酶切产物含有分子量为1065bp一种条带时，则待测花生为不含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t的纯合型除草剂敏感型花生；
20.2)、电泳检测酶切产物含有分子量为769bp、296bp两种条带时，则待测花生为含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t的纯合型抗性花生；
21.3)、电泳检测酶切产物含有分子量为1065bp、769bp和296bp三种条带时，则待测花生为含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t的杂合型抗性花生。
22.作为进一步的技术方案，所述s2中pcr扩增的反应体系以50μl计，包括：2
×
taq mastermix 20μl，上、下游引物各2.5μl，dna溶液5μl，ddh2o 20μl；所述s2中pcr扩增的反应程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸反应30s，共35个循环，72℃延伸10min。
23.作为进一步的技术方案，所述s3中酶切的反应体系以20μl计，包括：mfei限制性内切酶3μl，酶反应缓冲液1μl，pcr产物6μl，ddh2o 10μl，酶切的反应程序为：37℃静置酶切，酶切反应时间为1h。
24.作为进一步的技术方案，以不具有咪唑啉酮类除草剂抗性的品种为母本、以含有花生抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t的品种为父本进行杂交，得到f1单株，用所述caps分子标记引物，对f1单株进行抗性基因pcr扩增，将扩增产物用mfei限制性内切酶进行酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将f1单株中含有分子量为1065bp、769bp和296bp三种条带的单株判定为真杂种，即为含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t的杂合型植株，继续自交繁殖f2代；将f1单株中仅含有1065bp一种条带的单株判定为假杂种，为不含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t的纯合型除草剂敏感型母本株。
25.作为进一步的技术方案，用所述caps分子标记引物，对所述f2代植株进行抗性基因pcr扩增，将扩增产物用mfei限制性内切酶进行酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检
测，将f2代植株中含有分子量为769bp、296bp两种条带的单株继续自交，自交后代即为含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t的纯合型f3代种子；将f2代植株中含有分子量为1065bp、769bp和296bp三种条带的单株判定为含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t的杂合型的单株，可继续自交繁殖f3代，直至获得含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t纯合型单株。
26.作为进一步的技术方案，以含有花生抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t的品种为父本、以普通品种为母本进行杂交，获得f1，然后以普通品种为轮回亲本，在每次回交世代前，用所述caps分子标记引物，对各代植株进行抗性基因pcr扩增，将扩增产物用mfei限制性内切酶进行酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将含分子量为1065bp、769bp、296bp三种条带的携带含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t的杂合型单株与轮回亲本回交，通过多次回交，在最后一代自交的群体中用所述caps分子标记引物对抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t进行分子标记辅助基因型选择，选择含分子量为769bp、296bp两种条带的含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t的纯合型单株，即培育出抗咪唑啉酮类除草剂花生品种。
27.本发明的工作原理及有益效果为：
28.1、本发明中在国内首次开发了抗咪唑啉酮类除草剂花生选育的高效、准确、稳定、可靠的分子标记，并成功应用于抗性植物辅助选择育种中。
29.本发明根据花生抗咪唑啉酮类除草剂基因ahals-g1709t编码区关键单核苷酸变异设计出与目标基因共分离的新型分子标记，该分子标记明显优于与抗咪唑啉酮类除草剂基因连锁的分子标记，是根据目的抗性基因ahals-g1709t内部引起咪唑啉酮类除草剂性状变异的dna序列差异开发出来的一种功能标记。因该功能标记是来自基因内的功能性基序，不需要进一步验证即可在不同的遗传背景下确定目标基因的有无，而且能实现对目标基因ahals-g1709t的100％准确选择，因此不会产生因遗传重组或交换而造成的错误检测结果。
30.2、本发明开发出高效检测花生抗咪唑啉酮类除草剂基因ahals-g1709t的caps分子标记方法，克服了在异源多倍体花生复杂基因组中难以设计有效分子标记的难题。
31.本发明搜索和挖掘了花生基因组内大量的als同源序列，进行了细致的核酸序列比对，根据花生a亚基因组和b亚基因组内ahals基因序列差异以及突变抗性基因关键位点的特征，发现了抗性基因ahals-g1709t编码区在起始密码子后1709位核苷酸为t，而敏感型普通ahals基因在该位点的核苷酸为g，抗性基因单核苷酸变异产生了一个mfei限制性内切酶位点(c^aattgg)，而普通野生型基因不含有该mfei内切酶位点(caatggg)。
32.此外，本发明在设计引物时，考虑到a亚基因组和b亚基因组编码区序列相似性极高，序列一致性达98.7％，仅存在27个碱基差异，为了保证检测的可靠性，充分考虑等位变异位点附近亚基因组间同源非等位基因的基因组序列差异，且使扩增片段尽可能在caps标记所需最佳范围内，将该两个ahals非等位基因第957位和第951位的c/t碱基差异设计在扩增正向引物的3
′
端，同时将两基因1974位和1980位的c/t差异设计在反向引物的3
′
端，以利于两基因的区分。综上，克服了花生异源四倍体多拷贝或者多个同源基因的干扰，设计出包含抗性基因突变位点且能保证特异性扩增ahals-g1709t及其等位基因的特异性caps分子标记。
33.3、本发明设计的花生抗咪唑啉酮类除草剂基因的分子标记检测方法操作简便，检
测结果简单、直观，容易分辨。
34.本发明可将少量待检测花生基因组进行普通pcr扩增后的产物用mfei限制性内切酶进行酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分离检测，如果电泳检测获得的酶切产物含有分子量为1065bp一种条带时，则为不含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t的纯合型除草剂敏感型花生；如果电泳检测获得的酶切产物含有分子量为769bp、296bp两种条带时，则含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t的纯合型抗性花生；如果电泳检测获得的酶切产物含有分子量为1065bp、769bp和296bp三种条带时，则为含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t的杂合型抗性花生。因此，采用本发明的caps分子标记引物在鉴定抗咪唑啉酮类除草剂花生种质时，在保证高特异性扩增的前提下，根据条带数即可准确判断出检测单株或者材料的抗性基因纯合型、杂合性和敏感纯合型类型。
35.本发明设计的标记具有共显性、位点特异性高的优点，大大提高了抗性种质筛选、抗性基因鉴定及育种选择效率，对加快培育抗除草剂花生新品种具有重要意义。
36.4、本发明的caps分子标记检测方法能有效用于抗咪唑啉酮类除草剂基因ahals-g1709t产生花生对咪唑啉酮类除草剂抗性的分子标记辅助选择育种。
37.传统的花生抗除草剂品种选育主要依赖于抗性表型的鉴定，不仅周期长且极易受环境条件和人为因素的影响，从而降低了目标基因的选择效率，且难以实现多优良基因的有效聚合。而利用一般的与目标基因紧密连锁的分子标记来选择基因型，往往又受到遗传交换的影响，造成错误的检测结果。采用基于ahals-g1709t抗性基因本身引起抗性变异的dna编码区内的变异位点设计基因功能标记进行分子标记辅助选择，可以在花生全生育期甚至种子阶段鉴定目标基因及其纯合性，且不受环境的影响，因而大大提高了选择的效率和准确性。该功能标记的开发不仅能大大提高抗性种质筛选、抗性基因鉴定及育种选择效率，而且使通过基因聚合手段培育聚合多个优异性状的抗除草剂新品种。该功能标记的育种利用将有利于抗除草剂花生新品种的选育，从而提高花生抗除草剂育种的技术水平。
附图说明
38.下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
39.图1为本发明实施例1中花生基因组内als基因家族编码区核苷酸序列相似性比对图；
40.图中所示序列为引物对seq id no1和seq id no2扩增片段，即ahals起始密码子下游+937bp至+2001bp区段。图中完全相同、基本相同和不同的核苷酸分别用黑色、灰色和白色背景表示。ahals-g1709t、ahals-jkd241、ahals-jkd2007为以花生材料jk8543-1#、jkd241、jkd2007基因组为模板的扩增产物，xm_025766235、xm_025824631、xm_025817806和xm_025760307为ncbi数据库中的花生乙酰乳酸合成酶ahals基因序列。
41.图2为本发明实施例1中caps标记引物对扩增花生基因组pcr产物琼脂糖电泳图；
42.图中，m，分子量标准marker5000，片段由大到小依次为5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、700bp、500bp、250bp和100bp；1，jk8543-1#基因组为模板扩增产物；2，jkd241基因组为模板扩增产物；3，jkd2007基因组为模板扩增产物；4，无模板扩增体系对照。
43.图3为本发明实施例3中caps分子标记对过表达ahals转基因拟南芥/过表达ahals-g1708t转基因拟南芥杂交后代单株及其亲本的基因型检测；
44.图中，m，分子量标准marker2000，片段由大到小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp；不同的拟南芥单株酶切产物大小有1065bp、769bp、296bp三种片段或其组合；1，过表达ahals转基因拟南芥基因组为模板产物；2，过表达ahals-g1708t转基因拟南芥基因组为模板产物；3-22，分离群体单株基因组为模板的产物，其中3-8为部分f2单株不含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t的纯合型拟南芥，9-15为部分f2单株含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t的杂合型抗性拟南芥，16-21为含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t的纯合型抗性拟南芥，22为无产物的不含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t的单株。
45.图4为实施例4中caps分子标记对不同花生材料als基因型的检测电泳图；
46.图中，m，分子量标准marker2000，片段由大到小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp；不同的花生材料单株酶切产物大小有1065bp、769bp、296bp三种片段或其组合；1、6，无模板pcr扩增体系对照；2，jkd241基因组为模板的酶切产物；3，jkd2007基因组为模板的酶切产物；4，jk8543-1#基因组为模板的酶切产物；5，jk8543-2#基因组为模板的酶切产物。
47.图5为本发明实施例5中caps分子标记对jy4/jk8543-1#的f2分离群体部分单株als基因型的检测及其抗咪唑乙烟酸表型差异比较；
48.图中，m，分子量标准marker2000，片段由大到小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp和250bp；不同的分离单株酶切产物大小有1065bp、769bp和296bp三种片段或其组合；11#、17#、22#为对咪唑乙烟酸敏感型植株，3#、19#、30#为抗咪唑乙烟酸植株，10#、24#、43#为抗咪唑乙烟酸植株。
具体实施方式
49.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都涉及本发明保护的范围。
50.花生抗咪唑啉酮类除草剂基因ahals-g1709t，已在申请人的在先发明专利申请中公开，在先发明专利申请的申请号为202211090843.6。
51.下述实施例中，花生种质jkd241和jkd2007为河北科技大学分子育种团队保存花生种质；经琼脂糖凝胶dna回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，克隆载体puc-t购自康为世纪生物科技有限公司；咪唑乙烟酸除草剂购自衡水景美化学工业有限公司。
52.实施例1caps分子标记引物
53.检测花生抗咪唑啉酮类除草剂基因ahals-g1709t的caps分子标记引物的核苷酸序列如seq id no1、seq id no2所示，其设计方法包括以下步骤：
54.1、分析花生咪唑啉酮类除草剂靶标酶ahals编码基因
55.花生抗咪唑啉酮类除草剂基因ahals-g1709t来源于利用体外定点突变遗传转化获得的抗咪唑啉酮类除草剂花生，经提取花生基因组dna进行pcr扩增、克隆获得。与非抗性野生型ahals基因相比较，抗性突变体ahals-g1709t基因发生了1处单碱基突变，即其起始密码子第一个核苷酸下游1709bp位碱基由g变成了t，可以基于该突变位点的单碱基变异开
发基因编码区内snp的功能标记检测抗咪唑啉酮类除草剂基因ahals-g1709t。
56.首先，由于栽培种花生是通过两个二倍体野生种a.duranensis(aa，2n＝20)和(bb，2n＝20)自然杂交后再经过染色体加倍形成的异源四倍体(aabb，2n＝4x＝40)物种，其基因组相对复杂。在设计ahals-g1709t基因编码区特异引物之前，要考虑a、b亚基因组的同源基因序列在目标扩增区域的相似性，开发的引物应能排除高度相似的同源基因干扰。以acetolactate synthase为关键词在peanutbase数据库中检索栽培种花生基因组中als的所有同源基因，共找到4个als基因，包括arahy.881m8l(cha10：2637176-2639177)、arahy.kgmc0x(chb10：4862385-4864380)、arahy.07j3hr(cha3：136788820-136792630)、arahy.wpx6ia(chb3：139581455-139585266)。经核苷酸序列比对，发现抗性基因ahals-g1709t与arahy.881m8l是同一基因。在这4个基因中，arahy.881m8l和arahy.kgmc0x、arahy.07j3hr和arahy.wpx6ia在核苷酸水平上的同源性均高达98.0％以上，arahy.881m8l/arahy.kgmc0x与arahy.07j3hr/arahy.wpx6ia在核苷酸水平上序列差异较大，其同源性在50％左右。
57.在ncbi数据库中，利用拟南芥atals序列进行栽培花生同源基因序列检索，获得4个序列相似度较高的基因：xm_025766235、xm_025824631、xm_025817806和xm_025760307，其中xm_025766235/xm_025824631分别与arahy.881m8l/arahy.kgmc0x完全一致，为同一基因，而xm_025817806和xm_025760307与前2个基因核苷酸序列同源性在75％以下。
58.据上述比较，推测栽培种花生基因组中存在6个als基因，其核苷酸序列同源性较高，特别是arahy.881m8l(xm_025766235)和arahy.kgmc0x(xm_025824631)在核苷酸水平的同源性高达98％，使得在基因编码区内开发引物分别特异扩增该2个基因片段难度较大。为此，首先需要找到这2个基因的序列差异设计引物特异扩增ahals-g1709t基因(即arahy.881m8l)序列片段，而排除arahy.kgmc0x基因序列对检测抗性基因的干扰。
59.为了进一步证实上述数据库内的als基因序列及其差异，设计了如下引物对扩增als基因家族成员：
60.引物对1为f：5
′
—tctgcaaccttcaaaaatggcg—3
′
和r：5
′
—accataatacaaaaccattcatc—3
′
，扩增xm_025817806；
61.引物对2为f：5
′
—tctgcaaccttcaaaaatggcg—3
′
和r：5
′
—gcataccataatacaaaaccattag—3
′
，扩增xm_025760307；
62.引物对3为f：5
′
—atggctgccactgcttcca—3
′
和3：5
′
—ggatatcaatattttgttctgccatcg—3
′
，扩增xm_025766235；
63.引物对4为f：5
′
—atggctgccactgcttcca—3
′
和r：5
′
—ggatatcaatattttgttctgccatca—3
′
，扩增xm_025824631。
64.先采用ctab法提取常规花生种质jkd241和jkd2007的dna，然后利用上述4对引物对pcr扩增4种除草剂敏感型花生同源性高的als编码基因序列；扩增产物经琼脂糖凝胶dna回收试剂盒纯化、回收，连接于克隆载体puc-t，热激转化感受态dh5α菌株。利用蓝白斑筛选和单菌落pcr鉴定，将阳性单克隆送华大基因公司测序，序列比对结果如图1所示。
65.2、设计检测花生抗咪唑啉酮类除草剂基因ahals-g1709t的caps分子标记引物
66.由于栽培种花生基因组中，存在ahals同源基因序列且序列的相似度高达98％，需要在ahals-g1709t突变位点位置t1709或对应野生型基因g1709的两端找到一对上下游引
物可以特异扩增花生ahals-g1709t片段。结合实施例1的序列比对结果，采用primer premier6.0软件，将设计的上下游引物序列分别锚定在xm_025766235和xm_025824631核苷酸序列的2个snp位点位置上。理论上，若花生样品中的snp位点与特异性引物的3
′
末端相匹配即能进行有效的pcr扩增，反之则不能进行有效pcr扩增。基于上述，在充分考虑等位变异位点附近亚基因组间同源非等位基因的基因组序列差异的基础上，使扩增片段尽可能在caps标记所需最佳范围内，将该两个ahals非等位基因第957位和第951位的c/t碱基差异设计在扩增正向引物的3
′
端，同时将两基因1974位和1980位的c/t差异设计在反向引物的3
′
端，以利于两基因的区分。这样即可消除xm_025824631基因序列对pcr扩增结果的干扰。由此，开发出一个能够检测花生抗咪唑啉酮类除草剂基因ahals-g1709t的caps分子标记引物，该caps分子标记引物的核苷酸序列为：
67.seq id no1：5'—aggaggtttgttgagcttacc—3'；
68.seq id no2：5'—tcaatattttgttctgccatcgc—3'。
69.该引物的pcr扩增产物片段大小为1065bp。
70.采用jk8543-1#、jkd241、jkd2007三个花生品系进行引物扩增效果验证，具体方法为：
71.(1)ctab法提取幼嫩叶片dna。
72.(2)在a300 fast thermal cycler pcr仪上，使用实施例1的caps分子标记引物对提取的dna进行pcr扩增。pcr扩增的反应体系为：2
×
tiangen taq mastermix ii(a)20μl，上、下游引物各2.5μl(10μmol/l)，dna溶液5μl(20ng/μl)，加ddh2o至50μl；pcr扩增的反应程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸反应30s，共35个循环，72℃延伸10min。
73.pcr扩增产物经1％琼脂糖凝胶检测，结果如图2所示，扩增产物片段大小与预期相符。
74.pcr产物直接测序结果也表明，该扩增产物为目的基因的核苷酸序列。
75.实施例2caps分子标记引物在鉴定花生抗咪唑啉酮类除草剂基因ahals-g1709t以及鉴定抗咪唑啉酮类除草剂花生品种中的应用。
76.根据图1可知，除草剂敏感型花生的als基因在g1709位点区域的保守性很强，对应序列均为“caatggg”，而抗除草剂基因ahals-g1709t在区域的相应序列为“caattgg”，恰好能够作为mfei限制性内切酶识别和剪切的序列(“c^aattgg”)，而前者野生型ahals则不能作为mfei限制性内切酶识别的位点。因此，可根据酶切产物的电泳检测结果判断待测花生抗性基因型。具体方法为：
77.(1)提取待测花生基因组dna。
78.(2)采用实施例1的caps分子标记引物对提取的待测花生基因组dna进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；pcr扩增的反应体,和反应程序同实施例1。
79.(3)将扩增产物用mfei限制性内切酶进行酶切，获得酶切产物；酶切的反应体系以20μl计，包括：mfei限制性内切酶3μl，酶反应缓冲液1μl，pcr产物6μl，ddh2o 10μl，酶切的反应程序为：37℃静置酶切，酶切反应时间为1h。
80.(4)酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据酶切产物的带型判断待测花生的基因型，包括以下情况：
81.①
电泳检测酶切产物含有分子量为1065bp一种条带时，则待测花生为不含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t的纯合型除草剂敏感型花生；
82.②
电泳检测酶切产物含有分子量为769bp、296bp两种条带时，则待测花生为含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t的纯合型抗性花生；
83.③
电泳检测酶切产物含有分子量为1065bp、769bp和296bp三种条带时，则待测花生为含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t的杂合型抗性花生。
84.实施例3caps分子标记引物在花生育种中的应用—筛选ahals-g1709t转基因后代纯合体
85.将野生型非抗性基因ahals的拟南芥品种和抗性突变基因ahals-g1709t转基因过表达t3代纯系拟南芥品种进行杂交，得到f1单株，将f1单株套袋自交，得到f2世代分离群体。
86.对杂交亲本及f2分离群体采用caps分子标记引物进行抗咪唑啉酮类除草剂基因鉴定，具体方法为：
87.(1)采用ctab法提取杂交亲本及f2分离群体的部分单株dna。
88.(2)使用实施例1的caps分子标记引物，在a300 fast thermal cycler pcr仪上，对提取杂交亲本及f2分离群体的部分单株dna进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；pcr扩增的反应体系和反应程序同实施例1。
89.(3)pcr扩增产物经1％琼脂糖凝胶检测后，将剩余的pcr扩增产物分为2份，其中1份送华大基因测序公司测序，另外1份用mfei限制性内切酶进行酶切处理。酶切反应体系和反应程序同实施例2。
90.(3)酶切产物用2.5％浓度的琼脂糖凝胶电泳检测，采用120v电压，电泳1.5h。
91.酶切产物的电泳结果如图3所示，具体分析如下：
92.①
转花生野生型非抗性基因ahals的拟南芥父本植株仅含有分子量为1065bp的条带，即为不含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t的纯合型除草剂敏感型转基因拟南芥；
93.②
转花生突变型抗性基因ahals-g1709t的拟南芥母本植株酶切产物含有分子量为769bp和296bp的2条带，即为含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t的纯合型抗性转基因拟南芥；
94.③
f2分离群体中检测到7株样品的酶切产物含有分子量为1065bp、769bp和296bp三种条带，即为含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t的杂合型抗性转基因拟南芥，另有6个植株中仅检测到分子量为1065bp的条带，即为不含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t的纯合型除草剂敏感型转基因拟南芥；有6个单株中酶切产物含有分子量为769bp和296bp的2条带，即为含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t的纯合型抗性转基因拟南芥；有2个单株中没有检测到任何条带，即为分离出的野生型拟南芥。
95.pcr产物的测序结果显示：使用实施例1的caps分子标记引物扩增pcr产物为花生ahals基因片段而非其他的非特异性扩增，在抗性与非抗性转基因拟南芥中存在单碱基突变g/t。
96.为了验证基因型和表型是否具有一致性，在人工培养条件下，对上述检测的转基因拟南芥按照10倍田间推荐剂量(750g a.i./hm2)喷施5％咪唑乙烟酸除草剂。3周后的处
理结果表明，携带抗性基因ahals-g1709t的纯合体和杂合体植株均未发生药害症状，而不含ahals-g1709t抗性基因的拟南芥植株全部黄化，最终枯死。这说明用caps标记可以准确检测转基因ahals-g1709t的植物中是否含有抗咪唑啉酮类除草剂基因ahals-g1709t，还可以有效区分花生抗咪唑啉酮类除草剂基因ahals-g1709t的3种不同基因型，同时也说明突变所产生的除草剂抗性由显性基因所控制。
97.实施例4caps分子标记引物在花生育种中的应用—鉴定抗咪唑啉酮类除草剂花生种质
98.以过表达抗性基因ahals-g1709t的2个抗咪唑乙烟酸除草剂的转基因纯系jk8543-1#和jk8543-2#、以及常规种质jkd241、jkd2007为材料，ctab法提取花生基因组dna，使用实施例1的caps分子标记引物，在a300 fast thermal cycler pcr仪上对花生基因组dna进行pcr扩增、酶切、产物检测、测序验证，其中pcr扩增、酶切、产物检测以及测序验证等步骤同实施例3。
99.pcr产物的酶切结果如图4所示，具体分析如下：
100.①
jk8543-1#和jk8543-2#的酶切产物均含有分子量为769bp和296bp的2条带，即为含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t的纯合型抗性花生材料；
101.②
jkd241和jkd2007的酶切产物均仅含有分子量为1065bp的条带，即为不含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t的纯合型除草剂敏感型花生材料。
102.caps标记检测结果与pcr扩增产物测序结果相一致，引物对扩增的pcr产物为特异的花生ahals基因片段，在抗性与非抗性花生材料ahals基因在读码框+1709位存在单碱基突变g/t。
103.为了验证基因型和表型是否具有一致性，在人工培养条件下，对上述检测的转基因拟南芥按照10倍田间推荐剂量(750g a.i./hm2)喷施5％咪唑乙烟酸除草剂。3周后的处理结果表明，携带抗性基因ahals-g1709t的纯合体和杂合体植株均未发生药害症状，而不含ahals-g1709t抗性基因的拟南芥植株全部黄花最终枯死。为了验证基因型和表型是否具有一致性，在田间对上述检测的花生材料按照10倍田间推荐剂量(750g a.i./hm2)喷施5％咪唑乙烟酸除草剂。2周后的处理结果显示，携带抗性基因ahals-g1709t的花生植株均未发生药害症状，而不含ahals-g1709t抗性基因的花生全部黄化，最终枯死。
104.以上结果说明，开发的caps标记可以准确检测花生种质资源中是否含有抗咪唑啉酮类除草剂基因ahals-g1709t，在抗性花生新品种和新品系选育中，该caps标记能够提高抗性基因的选择效率，加快育种进程。
105.实施例5caps分子标记引物在花生育种中的应用—鉴定花生抗咪唑啉酮类除草剂基因ahals-g1709t
106.采用普通花生jy4为母本，ahals-g1709t转基因纯系jk8543-1#为父本进行杂交，获得f1种子，f1自交获得137个f2单株。
107.在f1、f2世代的苗期植株长到2-3复叶时，分别按单株用ctab法提取幼嫩叶片的dna，用于鉴定ahals的基因型。
108.接着，按照10倍田间剂量(750g a.i./hm2)对植株均匀喷施5％咪唑乙烟酸除草剂，用于鉴定群体单株不同基因型对咪唑乙烟酸除草剂的抗性，鉴定方法同实施例3。
109.将caps分子标记结果与目标基因测序结果进行比较分析，具体如下：
110.①
f1代单株的酶切后电泳产物出现2类带型，一类具有分子量为1065bp的单条带，其相应的测序结果为ahals基因的+1709bp碱基均为g；另一类则具有分子量为1065bp、769bp和296bp的3条带，其相应的测序结果为ahals基因的+1709bp均为套峰(碱基g/t)。由此判断后者具有3条带型的为真杂种，在ahals的+1709位点处含有母本、父本的基因型，即含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t的杂合型后代，而前者仅含有母本ahals-g1709的基因型，即不含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t的纯合型除草剂敏感的母本基因型。喷施咪唑乙烟酸抗药性鉴定结果也表现出2种表现类型，即上述单条带类型植株对咪唑乙烟酸均敏感，喷药后植株黄化萎蔫，药害明显；而上述3条带类型植株均能正常生长，未出现除草剂药害症状。
111.②
f2单株的电泳产物出现3种类型的条带，一类是含有分子量为1065bp单条带，其ahals基因测序+1709bp碱基为g；一类是含分子量为1065bp、769bp和296bp的3个条带，其ahals基因的测序+1709bp为套峰(碱基g/t)；还有一类是有分子量为769bp和296bp的2个条带，其ahals基因的测序+1709bp为碱基t。从喷施咪唑乙烟酸后的表型直观来看，如图5所示，上述3种基因型分离单株中，第1类基因型，即不含抗性基因ahals-g1709t的纯合基因型单株全部黄化萎蔫，其他两种基因型，即含有抗性基因ahals-g1709t的杂合基因型或纯合基因型单株都不出现除草剂药害的症状。
112.综上说明，应用的caps分子标记可以有效对花生抗性基因ahals-g1709t的3种基因型进行准确鉴定，同时表明ahals-g1709t突变所产生的除草剂抗性由显性基因控制。
113.实施例6caps分子标记引物在花生育种中的应用-培育含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t纯合型单株
114.以不具有咪唑啉酮类除草剂抗性的品种为母本、以含有花生抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t的品种为父本进行杂交，得到f1单株，用实施例1的caps分子标记引物，对f1单株进行抗性基因pcr扩增，将扩增产物用mfei限制性内切酶进行酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将f1单株中含有分子量为1065bp、769bp和296bp三种条带的单株判定为真杂种，即为含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t的杂合型植株，继续自交繁殖f2代；将f1单株中仅含有1065bp一种条带的单株判定为假杂种，为不含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t的纯合型除草剂敏感型母本株。
115.用实施例1的caps分子标记引物，对f2代植株进行抗性基因pcr扩增，将扩增产物用mfei限制性内切酶进行酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将f2代植株中含有分子量为769bp、296bp两种条带的单株继续自交，自交后代即为含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t的纯合型f3代种子；将f2代植株中含有分子量为1065bp、769bp和296bp三种条带的单株判定为含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t的杂合型的单株，可继续自交繁殖f3代，直至获得含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t纯合型单株。
116.实施例7caps分子标记引物在花生育种中的应用—培育出抗咪唑啉酮类除草剂花生品种
117.以含有花生抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t的品种为父本、以普通品种为母本进行杂交，获得f1，然后以普通品种为轮回亲本，在每次回交世代前，用实施例1的caps分子标记引物caps分子标记引物，对各代植株进行抗性基因pcr扩增，将扩增产物用mfei限制性内切酶进行酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将含分子量为1065bp、
769bp、296bp三种条带的携带含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t的杂合型单株与轮回亲本回交，通过多次回交，在最后一代自交的群体中用所述caps分子标记引物对抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t进行分子标记辅助基因型选择，选择含分子量为769bp、296bp两种条带的含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t的纯合型单株，即培育出抗咪唑啉酮类除草剂花生品种。
118.以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种检测花生抗咪唑啉酮类除草剂基因ahals-g1709t的caps分子标记引物，其特征在于，所述caps分子标记引物的核苷酸序列如seq id no1、seq id no2所示。2.权利要求1所述的caps分子标记引物在花生育种中的应用。3.权利要求1所述的caps分子标记引物在鉴定抗咪唑啉酮类除草剂花生品种中的应用。4.权利要求1所述的caps分子标记引物在鉴定花生抗咪唑啉酮类除草剂基因ahals-g1709t中的应用。5.根据权利要求2-4任意一项所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：s1、提取待测花生基因组dna；s2、采用所述caps分子标记引物对提取的待测花生基因组dna进行pcr扩增，得到扩增产物；s3、将扩增产物用mfei限制性内切酶进行酶切，获得酶切产物；s4、酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据酶切产物的带型判断待测花生的基因型。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述根据酶切产物的带型判断待测花生的基因型包括以下情况：1)、电泳检测酶切产物含有分子量为1065bp一种条带时，则待测花生为不含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t的纯合型除草剂敏感型花生；2)、电泳检测酶切产物含有分子量为769bp、296bp两种条带时，则待测花生为含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t的纯合型抗性花生；3)、电泳检测酶切产物含有分子量为1065bp、769bp和296bp三种条带时，则待测花生为含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t的杂合型抗性花生。7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述s2中pcr扩增的反应体系以50μl计，包括：2
×
taq mastermix 20μl，上、下游引物各2.5μl，dna溶液5μl，ddh2o 20μl；所述s2中pcr扩增的反应程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸反应30s，共35个循环，72℃延伸10min；所述s3中酶切的反应体系以20μl计，包括：mfei限制性内切酶3μl，酶反应缓冲液1μl，pcr产物6μl，ddh2o 10μl，酶切的反应程序为：37℃静置酶切，酶切反应时间为1h。8.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，以不具有咪唑啉酮类除草剂抗性的品种为母本、以含有花生抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t的品种为父本进行杂交，得到f1单株，用所述caps分子标记引物，对f1单株进行抗性基因pcr扩增，将扩增产物用mfei限制性内切酶进行酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将f1单株中含有分子量为1065bp、769bp和296bp三种条带的单株判定为真杂种，即为含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t的杂合型植株，继续自交繁殖f2代；将f1单株中仅含有1065bp一种条带的单株判定为假杂种，为不含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t的纯合型除草剂敏感型母本株。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，用所述caps分子标记引物，对所述f2代植株进行抗性基因pcr扩增，将扩增产物用mfei限制性内切酶进行酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将f2代植株中含有分子量为769bp、296bp两种条带的单株继续自交，自交后代即为含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t的纯合型f3代种子；将f2代植株中含
有分子量为1065bp、769bp和296bp三种条带的单株判定为含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t的杂合型的单株，可继续自交繁殖f3代，直至获得含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t纯合型单株。10.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，以含有花生抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t的品种为父本、以普通品种为母本进行杂交，获得f1，然后以普通品种为轮回亲本，在每次回交世代前，用所述caps分子标记引物，对各代植株进行抗性基因pcr扩增，将扩增产物用mfei限制性内切酶进行酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将含分子量为1065bp、769bp、296bp三种条带的携带含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t的杂合型单株与轮回亲本回交，通过多次回交，在最后一代自交的群体中用所述caps分子标记引物对抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t进行分子标记辅助基因型选择，选择含分子量为769bp、296bp两种条带的含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因ahals-g1709t的纯合型单株，即培育出抗咪唑啉酮类除草剂花生品种。

技术总结
本发明涉及花生育种技术领域，提出了一种检测花生抗咪唑啉酮类除草剂基因AhALS-G1709T的引物与应用，所述CAPS分子标记引物的核苷酸序列如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2所示，所述CAPS分子标记引物应用于花生育种时，可以鉴定花生抗咪唑啉酮类除草剂基因AhALS-G1709T以及鉴定抗咪唑啉酮类除草剂花生品种。通过上述技术方案，解决了现有技术中难以有效筛选花生抗咪唑啉酮类除草剂品种以及现有筛选技术效率低、准确性差等问题。准确性差等问题。准确性差等问题。


技术研发人员：陈四龙 许贤 王鸿梅
受保护的技术使用者：河北科技大学
技术研发日：2022.11.28
技术公布日：2023/7/26