用于蛋白质凝胶电泳的内源性荧光成像检测系统及方法

1.本发明涉及生物、生物医学分析和检测技术领域，尤其是涉及一种用于蛋白质凝胶电泳的内源性荧光成像检测系统。


背景技术：

2.凝胶电泳技术(poly acrylamide gel electrophoresis，page)是分子生物学、检验医学、蛋白组学等领域中广泛使用的蛋白分离鉴定手段，其具有装置简单，结果直观，且使用成本低廉等优势。然而，由于大多数蛋白质大分子在可见光区是无色的，电泳后蛋白区带的检测需利用可见染料或荧光试剂标记蛋白分子，这些检测方法存在以下问题，其一，繁杂的染色、脱色、孵育等操作步骤耗时费力，效率低下；其二，由于蛋白的氨基酸组成和结构不同，可能使不同蛋白分子被标记和染色的程度不均一，导致显色分布的异质性而影响后续检测；其三，银等一些染料与蛋白共价结合后，会导致蛋白活性或结构改变，与后续的蛋白制备、质谱鉴定等过程难以兼容。另外，染色、标记、脱色所使用的染料试剂、还原剂等对人体、环境有害，成本较高。因此，传统凝胶电泳难以满足现代分析检验的高效、安全、环保的需求。
3.为了解决这些问题，近三十年来，毛细管电泳以及微流控芯片电泳被广泛研究，并应用于蛋白、核酸等生物大分子分离分析，这些基于微纳尺寸通道的电泳分离，通常具有速度快、所需样品量低、试剂消耗小，设备微型化等特点，并且可以实现分离后待测物质的柱端/点检测。然而此方法也存在一定的局限性，比如，毛细管电泳或微流控芯片电往往使用尺寸和灵敏度较匹配的激光诱导荧光(laserinduce fluorescence，lif)检测器来检测蛋白，而大多数蛋白分子需要通过衍生化才具有荧光，增加了实验步骤和难度。
4.或利用蛋白等大分子的紫外吸收基团，可实现石英毛细管柱端或整柱的紫外吸光度的检测，然而因电泳芯片pmma、pc和pdms等基质材料uv透光性能较差，仍然缺少与芯片电泳兼容的紫外检测和成像技术装置。或利用有色蛋白(如肌红蛋白和血红蛋白)415nm波长吸收来实现在线检测(一种基于等电聚焦电泳技术的肉类品质鉴定方法，cn201910219220.6)，然而绝大多数蛋白为无色蛋白，因此这一检测技术应用面非常有限。在线uv-vis成像检测装置(cn202010596037.0)为芯片凝胶电泳在线检测提供了新模式，但因芯片需要放置在光源与创新设备之间无法与现有凝胶电泳技术兼容；并且深紫外ccd成像仪极其昂贵。
5.因此，亟待发展新创新分析技术解决包括芯片电泳在内的在线成像检测问题、以及便携式电泳分离检测问题。


技术实现要素：

6.本发明的目的就是提供一种用于蛋白凝胶电泳芯片的在线内源性荧光成像(intrinsic fluorescence imaging，ifi)检测装置，以此解决包括芯片电泳在内的在线成像检测问题、以及便携式电泳分离检测问题。
7.本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
8.本发明第一方面提供一种用于蛋白质凝胶电泳的内源性荧光成像检测系统，其特征在于，包括便携手提箱体、芯片电泳装置、成像检测装置和计算机终端，其中具体地：
9.芯片电泳装置，设于所述便携手提箱体内部；
10.成像检测装置，设于所述便携手提箱体内部且置于芯片电泳装置一侧，待所述芯片电泳装置中的芯片电泳结束后，所述成像检测装置采集蛋白条带图像，在成像的同时触发光源瞬时打开进行曝光，以此捕捉荧光信号图像；
11.计算机终端，与所述成像检测装置通信连接，对成像检测装置捕捉荧光信号图像进行处理并储存，得到凝胶电泳测试结果。
12.进一步地，所述成像检测装置包括装置外罩、设于装置外罩中的紫外敏感ccd相机、设于紫外敏感ccd相机一侧的光源组件。
13.进一步地，所述紫外敏感ccd相机的光敏侧朝向芯片电泳装置。
14.进一步地，所述光源组件包括设于装置外罩开口处的光源罩、设于光源罩上的深紫外led阵列。
15.进一步地，所述光源罩包括4块光源载板和光源罩外框；
16.所述光源罩外框固定于所述装置外罩开口处；
17.各片光源载板的一侧与紫外敏感ccd相机的边框连接，另一侧与所述紫外敏感ccd相机的边框连接。
18.进一步地，所述紫外敏感ccd相机上设有截止波长为280-488nm的带通滤光片，截止波长参数选取还需考虑led波长。
19.进一步地，所述深紫外led阵列包括多个阵列式设置的波长为240-300nm深紫外led灯珠。
20.进一步地，所述便携手提箱体的上设有可开闭开口，通过可开闭开口实现芯片电泳装置、成像检测装置的置入和拿出。
21.进一步地，所述便携手提箱体中还包括向有源器件供电的供电单元；
22.所述便携手提箱体为不透光材料。
23.本发明第二方面提供一种采用上述检测系统的蛋白质凝胶电泳内源性荧光在线成像检测方法，包括以下步骤：
24.将配置好的模式蛋白样品进样，将电泳芯片置于成像检测装置正前方，使深紫外led阵列光源辐照面的中心、紫外敏感ccd相机的中心轴在同一水平轴上，并置于一个不透明的便携箱中；
25.电泳芯片上样后，打开供电单元，开始电泳；
26.电泳结束时，启动ifi荧光成像采集，紫外敏感ccd相机捕捉的同时，触发led阵列光源自动开启，曝光，由计算机终端对所获荧光成像结果进行分析。
27.与现有传统和芯片凝胶电泳技术设备相比，本发明具有以下显著优点：
28.1、实现电泳后蛋白区带无标记快速成像检测。传统的page电泳后需要3小时固定染色和脱色，然后再用凝胶成像仪成像分析，耗时费力、费试剂、费空间。而采用本装置，无色蛋白区带无需传统固定、染色、脱色或衍生化等耗时手工步骤，即可直接成像检测，显著提升区带凝胶电泳效率。
29.2、提高芯片凝胶电泳检测灵敏度。利用深紫外led阵列光源，辐射光在一定面积内均匀性强，激发芯片凝胶中蛋白分子的色氨酸残基内源荧光，从而对蛋白条带在线成像并定量检测，其灵敏度优于传统考马斯亮蓝蛋白染色法和蛋白紫外吸光度成像检测。
30.3、实现蛋白芯片/传统凝胶电泳定量。传统蛋白凝胶电泳采用染色观测蛋白区带，能够实现半定量分析，但很难实现定量分析。本发明能够实现蛋白凝胶电泳的在线定量分析，并具有较好的线性范围和稳定性。
31.4、装置集成、便携、自动化。本系统的深紫外led阵列光源设计紧凑，可将芯片电泳装置插入其中，并使用锂电池为装置供电，实现了整个电泳和检测系统的小尺寸(38
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15
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15cm)，具有便携和现场应用能力，且电泳过程和在线成像均为自动化软件操作，相比于传统page技术，自动化程度大幅提升。
32.5、大幅度降低试剂耗材消耗。传统凝胶电泳需要蛋白核酸固定液、染色液和脱色液等。使用本技术方案中检测系统，蛋白成像无需使用染料、衍生试剂，且配合芯片凝胶电泳，极大减少化学试剂的消耗。
33.6、降低实验室室内污染。传统的page电泳固定、染色和脱色需要大量三氯乙酸、冰醋酸、乙醇和考马斯亮蓝等有机溶剂。造成实验室室内污染严重。
34.7、节省大量设备和空降。传统page电泳需要电泳电源、电泳槽、制胶架、摇床或自动染色仪、凝胶成像仪、以及台式计算机等。不仅各种设备多，而且占用实验面积大。
附图说明
35.图1为本发明中成像检测装置的结构透视图。
36.图2为本发明中成像检测装置的前视图和侧视图。
37.图3、4为本发明中成像检测装置用于芯片电泳的整体结构示意图。
38.图5为本发明中单片深紫外led成像page的非均匀性实验。
39.图6为本发明中四片深紫外led成像同一bsa浓度斑点的均匀性实验。
40.图7本发明中成像检测装置用于三种标准模式蛋白(丙种球蛋白γ-glb(箭头1)、牛血清蛋白bsa(箭头2)和蛋清溶菌酶lz(箭头3)芯片凝胶电泳-ifi成像分析余线性范围实验、以及重现性实验。
41.图8为本发明中芯片凝胶电泳-ifi成像检测装置与经典平板电泳-考马斯亮蓝染色法的人血清的二种电泳模式结果对比图。
42.图9为本发明中芯片凝胶电泳-ifi成像检测装置分离三种模式蛋白纯品与混样的实验对比图。
43.图10为本发明中芯片凝胶电泳-ifi成像检测装置分离血清白蛋白与传统page-考马斯亮蓝染色的灵敏度对比图。
44.在图1～2中：光源罩1、深紫外led阵列2、紫外敏感ccd相机3、装置外罩4。
45.在图3、4中：成像检测装置5、供电单元6、计算机端7、便携手提箱体8、芯片电泳装置9。
具体实施方式
46.本发明的设计了一种用于蛋白凝胶电泳芯片的在线内源性荧光成像
(intrinsicfluorescence imaging，ifi)检测装置，设计思路如下。设计一深紫外阵列光源用于激发蛋白分子普遍存在的色氨酸残基内源荧光，避免了使用可见染料、荧光染料及化学衍生；设计一与深紫外阵列光源集成的紫外成像装置，解决传统和芯片凝胶电泳无法实现普适性的蛋白免标记成像检测的问题；设计的在线成像分析检测装置可以与蛋白凝胶电泳芯片适配和集成，解决了电泳分离后待测蛋白区带的快速、直接、成像检测问题。
47.本发明的目的通过以下技术方案实现：
48.1、设计一种深紫外激发阵列光源，包括：由若干个275nm深紫外led灯珠组成的阵列面光源；由四块阵列面光源构成的罩式深紫外激发光源，光源功率50～200w，面光源均匀辐照范围为4.0～15.0cm(长度)
×
4.0～15.0cm(宽度)；
49.2、设计一与深紫外激发阵列光源集成为一体的成像装置，包括：一紫外敏感型ccd相机；一截止波长365nm的带通滤光片；一密闭外壳将罩式光源和成像装置集成；
50.3、设计一供电和控制模块，包括：一组锂电池(12v)；一个增压模块(直流供电100～200v)；控制软件和数据系统。
51.利用上述装置对芯片电泳分离后的蛋白区带进行检测的方法，包括如下步骤：
52.(1)芯片电泳结束后，通过控制模块采集蛋白条带图像，在成像的同时触发光源瞬时打开，曝光时间10ms～30sec，捕捉荧光信号图像。
53.(2)获得成像结果后，通过计算机软件记录和分析。计算机软件为市面上采购，在此不再赘述。
54.本发明可以实现电泳芯片中蛋白区带的直接在线成像检测，且装置使用简单、集成化、便携化。
55.下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本技术方案中如未明确说明的部件型号、材料名称、连接结构、控制方法、算法等特征，均视为现有技术中公开的常见技术特征。
56.在图5中：当使用单片深紫外led光源做ifi成像分析时表现出来的激发光源的非均匀性。
57.在图6中：当使用四片深紫外led光源做ifi成像分析时表现出来的激发光源的均匀性。在插图a1和a2中，非变性bsa浓度为2.0μg/μl；在插图b1和b2中，非变性bsa浓度为0.2μg/μl；在插图c1c2中，非变性bsa浓度为0.02μg/μl。
58.在图7中：插图a为本发明成像检测装置用于三种标准模式蛋白(丙种球蛋白γ-glb(箭头1)、牛血清蛋白bsa(箭头2)和蛋清溶菌酶lz(箭头3)芯片凝胶电泳分离获得的ifi成像分析及线性范围实验测试。插图b为本发明成像检测装置用于三种标准模式蛋白(γ-glb、bsa和lz)芯片凝胶电泳分离的ifi成像分析的重现性和一致性实验测试。
59.在图8中：插图a为使用芯片凝胶电泳及本荧光成像检测装置分离分析8个成人血清样本(a-h)；插图b为使用经典平板凝胶电泳及考马斯亮蓝染色法分离分析8个成人血清样本(a-h)。
60.在图9中：插图a为变性bsa、lz和γ-glb标样经芯片凝胶电泳-ifi成像分析结果；插图b为变性bsa、lz和γ-glb混样经芯片凝胶电泳-ifi成像分析结果。
61.在图10中：插图a为bsa标样经传统page电泳后经ifi成像分析结果；插图b为bsa标样经传统page电泳后考马斯亮蓝染色普通光学成像的分析结果。
62.实施例1
63.标准模式蛋白的芯片凝胶电泳-ifi荧光成像检测
64.芯片电泳-ifi荧光成像检测装置系统如图3、4所示。首先挑选三种模式蛋白三种标准模式蛋白(丙种球蛋白γ-glb、牛血清蛋白bsa和蛋清溶菌酶lz，配制成一定浓度梯度，将配置好的模式蛋白样品进样。
65.之后，将电泳芯片置于成像检测装置1正前方，使其与图1和图2中led阵列光源2所辐照的面的中心、ccd相机3的中心在同一水平轴上。
66.然后，如图3、4所示，使所有部件置于一个不透明的便携箱中5。电泳芯片上样后，打开供电单元6，设置100v恒压模式，时间6min，开始电泳。
67.电泳结束时，启动ifi荧光成像采集，ccd相机捕捉的同时，触发led阵列光源自动开启，曝光时间320ms，由计算机终端3对所获荧光成像结果进行分析。
68.结果如图5所示，插图a为三种标准模式蛋白(丙种球蛋白γ-glb(箭头1)、牛血清蛋白bsa(箭头2)和蛋清溶菌酶lz(箭头3)芯片电泳-ifi成像分析及线性范围实验。线性范围在0.02-2.0μg/ul。插图b为本发明成像检测装置用于三种标准模式蛋白(γ-glb、bsa和lz的重现性和一致性实验测试。
69.实验证明，本发明系统不仅能够用于蛋白凝胶电泳的定量分析，而且具有较好的线性范围、稳定性和一致性。
70.实施例2
71.人血清蛋白的芯片凝胶电泳-荧光成像检测
72.芯片电泳-荧光成像检测装置系统如图3、4所示。首先将电泳芯片置于成像检测装置1正前方，使其与图1和图2中led阵列光源2所辐照的面的中心、ccd相机3的中心在同一水平轴上。
73.然后，如图3、4所示，使所有部件置于一个不透明的便携箱中5。电泳芯片上样后，打开供电单元6，设置100v恒压模式，时间6min，开始电泳。
74.电泳结束后，进行荧光成像采集，ccd相机捕捉的同时，触发led阵列光源自动开启，曝光时间320ms，由计算机终端3对所获荧光成像结果进行分析。
75.结果如图5所示，首先，芯片电泳-荧光成像检测(插图a)与平板电泳-考马斯亮蓝染色(插图b)分离检测人血清蛋白获得的蛋白条带位置分布具有较高的一致性。
76.同时，可以观察到，使用考马斯亮蓝染色法的平板凝胶中的一较弱蛋白条带(插图b中箭头1)，在芯片电泳荧光成像检测中可以清晰的观察到(插图a中箭头1)，条带信号强度明显增强，并且，插图a中箭头2所示区域比插图b中相同区域多分辨出1-3个条带。以上对比结果表明，本装置相比于传统平板电泳及考马斯亮蓝染色法具有更好的检测灵敏度，且方法简单、快速，无需染色、衍生等操作，实现了电泳后蛋白的快速在线成像检测。
77.上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种用于蛋白质凝胶电泳的内源性荧光成像检测系统，其特征在于，包括：便携手提箱体(8)；芯片电泳装置(9)，设于所述便携手提箱体(8)内部；成像检测装置(5)，设于所述便携手提箱体(8)内部且置于芯片电泳装置(9)一侧，待所述芯片电泳装置(9)中的芯片电泳结束后，所述成像检测装置(5)采集蛋白条带图像，在成像的同时触发光源瞬时打开进行曝光，以此捕捉荧光信号图像；计算机终端(7)，与所述成像检测装置(5)通信连接，对成像检测装置(5)捕捉荧光信号图像进行处理并储存，得到凝胶电泳测试结果。2.根据权利要求1所述的一种用于蛋白质凝胶电泳的内源性荧光成像检测系统，其特征在于，所述成像检测装置(5)包括装置外罩(4)、设于装置外罩(4)中的紫外敏感ccd相机(3)、设于紫外敏感ccd相机(3)一侧的光源组件。3.根据权利要求2所述的一种用于蛋白质凝胶电泳的内源性荧光成像检测系统，其特征在于，所述紫外敏感ccd相机(3)的光敏侧朝向芯片电泳装置(9)。4.根据权利要求2所述的一种用于蛋白质凝胶电泳的内源性荧光成像检测系统，其特征在于，所述光源组件包括设于装置外罩(4)开口处的光源罩(1)、设于光源罩(1)上的深紫外led阵列(2)。5.根据权利要求4所述的一种用于蛋白质凝胶电泳的内源性荧光成像检测系统，其特征在于，所述光源罩(1)包括4块光源载板和光源罩外框；所述光源罩外框固定于所述装置外罩(4)开口处；各片光源载板的一侧与紫外敏感ccd相机(3)的边框连接，另一侧与所述紫外敏感ccd相机(3)的边框连接。6.根据权利要求2所述的一种用于蛋白质凝胶电泳的内源性荧光成像检测系统，其特征在于，所述紫外敏感ccd相机(3)上设有截止波长为280-488nm的带通滤光片。7.根据权利要求4所述的一种用于蛋白质凝胶电泳的内源性荧光成像检测系统，其特征在于，所述深紫外led阵列(2)包括多个阵列式设置的波长为240-300nm深紫外led灯珠。8.根据权利要求1所述的一种用于蛋白质凝胶电泳的内源性荧光成像检测系统，其特征在于，所述便携手提箱体(8)的上设有可开闭开口，通过可开闭开口实现芯片电泳装置(9)、成像检测装置(5)的置入和拿出。9.根据权利要求1所述的一种用于蛋白质凝胶电泳的内源性荧光成像检测系统，其特征在于，所述便携手提箱体(8)中还包括向有源器件供电的供电单元(6)；所述便携手提箱体(8)为不透光材料。10.一种采用如权利要求1至9中任意一项检测系统的蛋白质凝胶电泳内源性荧光在线成像检测方法，其特征在于，包括以下步骤：将配置好的模式蛋白样品进样，将电泳芯片置于成像检测装置正前方，使深紫外led阵列光源辐照面的中心、紫外敏感ccd相机(3)的中心轴在同一水平轴上，并置于一个不透明的便携箱中(5)；电泳芯片上样后，打开供电单元(6)，开始电泳；电泳结束时，启动ifi荧光成像采集，紫外敏感ccd相机(3)捕捉的同时，触发led阵列光源自动开启，曝光，由计算机终端(7)对所获荧光成像结果进行分析。

技术总结
本发明涉及一种用于蛋白质凝胶电泳的内源性荧光成像检测系统及方法，其中该系统包括便携手提箱体、芯片电泳装置、成像检测装置和计算机终端，其中芯片电泳装置设于所述便携手提箱体内部；成像检测装置设于所述便携手提箱体内部且置于芯片电泳装置一侧，待所述芯片电泳装置中的芯片电泳结束后，所述成像检测装置采集蛋白条带图像，在成像的同时触发光源瞬时打开进行曝光，以此捕捉荧光信号图像；计算机终端与所述成像检测装置通信连接，对成像检测装置捕捉荧光信号图像进行处理并储存，得到凝胶电泳测试结果。与现有技术相比，本发明具有集成化、快速、简便、在线成像检测、高通量以及低消耗等多种优点。低消耗等多种优点。低消耗等多种优点。


技术研发人员：曹成喜 薛静晶 张强 刘伟文 田佑吏 曹毅仁 刘小平
受保护的技术使用者：上海交通大学
技术研发日：2022.10.31
技术公布日：2023/7/26