基因工程微生物及制备天然安息香酸的方法与流程

1.本发明涉及一种基因工程菌及生物催化l-苯丙氨酸制备天然安息香酸的技术，属于生物技术领域。


背景技术：

2.安息香酸(benzoic acid)，学名苯甲酸，是最简单的芳香酸。安息香酸是一种重要的化工原料，可以用于纤维涤纶和尼龙等材料的合成，也可以用来生产治疗关节炎、支气管炎和皮肤病的药物。安息香酸的另一个主要的应用方向是食品领域，它是一种抵御真菌的天然防腐剂，常用于泡菜、果汁、化妆品和饲料的生产。安息香酸还可以作为食品的定香剂用于果汁饮料，以及熏香香精、食用香精和烟用香精。目前，安息香酸主要通过在高温高压下氧化甲苯获取，依赖于化学资源，并且能耗大。随着环保要求的提高和人们对于天然来源物质的追求，天然安息香酸的市场需求日益增长。天然安息香酸主要存在于安息香树的树脂中，在其他植物中的含量极低，通常低于0.001％。同时，植物中含有肉桂酸和香豆酸等多种芳香酸，给安息香酸的提取纯化带来了困难。因此，需要开发高效绿色合成苯甲酸的方法。
3.合成生物学和生物催化的发展给许多天然产物的生产提供了新的方式，多种高值天然产物已经成功利用微生物来进行合成，从而用于医药、化工和食品等领域。目前，关于安息香酸合成生物技术的研究还很少，2020年，otto等人在高产苯丙氨酸的台湾假单胞菌中表达了苯丙氨酸解氨酶和对香豆酸coa连接酶等五个酶，利用葡萄糖合成了1.9mm的安息香酸(otto,m.,et al.benzoate synthesis from glucose or glycerol using engineered pseudomonas taiwanensis.biotechnol.j.2020,15:2000211)；2020年，zhou等人构建了两种大肠杆菌，一种含有苯乙烯单加氧酶、环氧化物羟化酶和醇脱氢酶等七个酶，另一种含有苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸脱羧酶和苯乙烯单加氧酶等九个酶，分别将苯乙烯和苯丙氨酸转化为安息香酸(zhou,y.,et al.benzoic acid production via cascade biotransformation and coupled fermentation-biotransformation.biotechnol.bioeng.2020,117:2340-2350)；2020年，luo等人在大肠杆菌中表达了苯丙氨酸解氨酶、肉桂酰coa连接酶和肉桂酰coa水合酶等五个酶，另一条表达了羟基扁桃酸合成酶、羟基扁桃酸氧化酶、苯甲酰甲酸脱羧酶和苯甲醛脱氢酶，利用葡萄糖合成了安息香酸(luo,z.w.,et al.metabolic engineering of escherichia coli for the production of benzoic acid from glucose.metab.eng.2020,62:298-311)。但是，这些方法仍存在一定的局限，例如otto和luo等人开发的葡萄糖合成安息香酸的方法，产率和底物转化率低；zhou等人开发的方法需要引入过多的外源基因，给细胞造成了代谢负担，同时这些方法都需要依赖于还原力等辅因子，辅因子的不平衡也影响了合成效率。因此，亟需开发反应效率高和经济可持续的天然安息香酸绿色合成方法。


技术实现要素：

4.有鉴于现有技术的上述不足，本发明提供了一种用于生产天然安息香酸的基因工程菌，使其能够进行辅因子内循环，从而实现稳定的将l-苯丙氨酸高效转化为安息香酸，具有重要的应用前景。
5.本发明采取的技术方案是：
6.一种基因工程菌，所述基因工程菌中含有用于表达l-氨基酸脱氨酶的基因、表达羟基扁桃酸合成酶的基因、表达扁桃酸脱氢酶的基因、表达苯甲酰甲酸脱羧酶的基因、表达苯甲醛脱氢酶的基因和表达nadh氧化酶的基因。
7.进一步的改进，所述l-氨基酸脱氨酶的氨基酸序列如seq id no:1所示，羟基扁桃酸合成酶的氨基酸序列如seq id no:2所示，扁桃酸脱氢酶的氨基酸序列如seq id no:3所示，苯甲酰甲酸脱羧酶的氨基酸序列seq id no:4所示，苯甲醛脱氢酶的氨基酸序列seq id no:5所示，nadh氧化酶的氨基酸序列seq id no:6所示。
8.进一步的改进，所述表达l-氨基酸脱氨酶的基因的核苷酸序列如seq id no:7所示，表达羟基扁桃酸合成酶的基因的核苷酸序列如seq id no:8所示，表达扁桃酸脱氢酶的基因的核苷酸序列如seq id no:9所示，表达苯甲酰甲酸脱羧酶的基因的核苷酸序列如seq id no:10所示，表达苯甲醛脱氢酶的基因的核苷酸序列如seq id no:11所示，表达nadh氧化酶的基因的核苷酸序列seq id no:12所示。
9.进一步的改进，所述l-氨基酸脱氨酶选自产粘变形菌；所述羟基扁桃酸合成酶选自异壁放线菌；所述扁桃酸脱氢酶选自热容芽孢杆菌；所述苯甲酰甲酸脱羧酶选自丁香假单胞菌；所述苯甲醛脱氢酶选自蒙氏假单胞菌；所述nadh氧化酶选自罗伊氏乳杆菌。
10.进一步的改进，所述基因工程菌为大肠杆菌kare。
11.进一步的改进，所述大肠杆菌kare通过大肠杆菌bl21(de3)敲除基因dkgb，yqhc，yqhd，yahk，yeae，dkga和yjgb得到。
12.进一步的改进，所述基因工程菌通过向大肠杆菌kare导入重组质粒prsfduet-laad-hmas、重组质粒petduet-mdh-bfd和重组质粒pcdfduet-badh-nox得到；重组质粒prsfduet-laad-hmas通过将表达l-氨基酸脱氨酶的基因和表达羟基扁桃酸合成酶的基因合成至prsfduet-1质粒得到；重组质petduet-mdh-bfd通过将表达扁桃酸脱氢酶的基因和表达苯甲酰甲酸脱羧酶的基因合成至petduet-1质粒得到；重组质pcdfduet-badh-nox通过将表达苯甲醛脱氢酶的基因和表达nadh氧化酶的基因合成至pcdfduet-1质粒得到。
13.一种制备天然安息香酸的方法，构建转化体系，转化体系中以l-苯丙氨酸作为底物，以权利要求1-7任一所述的基因工程菌作为转化菌体将l-苯丙氨酸转化为天然安息香酸。
14.进一步的改进，转化体系中，l-苯丙氨酸的终浓度为5～100mm，基因工程菌的添加的终浓度20g/l，ph 6～8，转化温度为25～45℃，转化时间6～16h。
15.本发明的有益效果为：
16.本发明提供了一种基因工程菌，并用于转化l-苯丙氨酸制备安息香酸。相对于目前安息香酸生物合成法而言，本发明提供了新的安息香酸高效合成路径，利用nadh氧化酶与扁桃酸脱氢酶和苯甲醛脱氢酶形成辅因子的再生循环，提高了底物转化效率，可以将l-苯丙氨酸高效转化为l-苯苷氨酸，是具有广泛应用前景的绿色生物合成技术。
17.以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
18.图1为本发明实施例2中lumy-e216转化l-苯丙氨酸制备安息香酸的合成途径示意图。
19.图2为本发明实施例3中lumy-e216生产安息香酸的产量图。
具体实施方式
20.下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步的说明：下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
21.本发明使用的菌株和生长条件如下：
22.克隆宿主dh5α和bl21(de3)购自invitrogen公司，所有大肠杆菌在含有100mg/l氨苄青霉素、卡那霉素或壮观霉素的lb培养基中，37℃培养。
23.其中，所述lb液体培养基配方是：蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，nacl 10g/l，ph 7.0；lb固体培养基在lb液体培养基中添加20g/l琼脂；121℃高温高压蒸汽灭菌20min。
24.所有质粒均为petduet-1、prsfduet-1或pcdfduet-1(购自novagen公司)衍生质粒，用于表达目的基因。
25.实施例1安息香酸合成路径质粒的合成：
26.(1)利用在线软件jcat，根据大肠杆菌的密码子偏好性将产粘变形菌(proteus myxofaciens)中l-氨基酸脱氨酶(pmlaad)编码基因(laad)，异壁放线菌(actinoalloteichus cyanogriseus)中羟基扁桃酸合成酶(achmas)编码基因(hmas)，热容芽孢杆菌(bacillus caldolyticus)中扁桃酸脱氢酶(bcmdh)编码基因(mdh)，丁香假单胞菌(pseudomonas syringae)中苯甲酰甲酸脱羧酶(psbfd)编码基因(bfd)，蒙氏假单胞菌(pseudomonas monteilii)中苯甲醛脱氢酶(pmbadh)编码基因(badh)和罗伊氏乳杆菌(limosilactobacillus reuteri)中nadh氧化酶(lrnox)编码基因(nox)进行密码子优化，优化后laad的核苷酸序列如seq id no:7所示，hmas的核苷酸序列如seq id no:8所示，mdh的核苷酸序列如seq id no:9所示，bfd的核苷酸序列如seq id no:10所示，badh的核苷酸序列如seq id no:11所示，nox的核苷酸序列如seq id no:12所示。
27.(2)将步骤(1)中优化后的基因序列送金唯智公司(genewiz)进行基因合成，laad合成至prsfduet-1的bamhi和hindiii酶切位点中间，获得prsfduet-laad，hmas合成至prsfduet-laad的ndei和xhoi酶切位点中间，获得重组表达质粒prsfduet-laad-hmas；mdh合成至petduet-1的bamhi和hindiii酶切位点中间，获得petduet-mdh，bfd合成至petduet-bfd的ndei和xhoi酶切位点中间，获得重组表达质粒petduet-mdh-bfd；badh合成至pcdfduet-1的bamhi和hindiii酶切位点中间，获得petduet-mdh，nox合成至pcdfduet-badh的ndei和xhoi酶切位点中间，获得重组表达质粒pcdfduet-badh-nox。
28.实施例2lumy-e216生物催化剂的制备：
29.(1)获得基因工程菌lumy-e216：
30.为了避免大肠杆菌内源醇脱氢酶对苯甲醛转化，根据《分子克隆实验指南(第三版)》中描述的方法对大肠杆菌bl21(de3)进行基因敲除，敲除7个基因(dkgb，yqhc，yqhd，yahk，yeae，dkga，yjgb)，获得大肠杆菌kare。将3μl实施例1步骤(2)中得到重组质粒prsfduet-laad-hmas、petduet-mdh-bfd和pcdfduet-badh-nox通过热激的方法转化入大肠杆菌kare感受态细胞中。将热激后的菌液涂布到含有100mg/l氨苄青霉素、卡那霉素和壮观霉素的lb固体培养基平板上，37℃恒温培养箱中培养12小时。在平板上挑取单菌落至5ml lb液体培养基中，37℃摇床中培养，摇床转速为200转/分钟；将培养后的菌液进行pcr扩增验证，获得基因工程菌株lumy-e216，如图1所示，lumy-e216可用于转化苯丙氨酸制备安息香酸。
31.(2)制备基因工程菌lumy-e216的全细胞催化剂：
32.将步骤(1)获得的基因工程菌lumy-e216，用接种环接种到50ml lb液体培养基(含有100mg/l氨苄青霉素、卡那霉素和壮观霉素)中进行菌株活化，37℃过夜培养；随后，按照1％(体积比)接种量将活化后的菌液接种到5l lb液体培养基(含有100mg/l氨苄青霉素、卡那霉素和壮观霉素)中，37℃，200rpm，培养3-5小时至od
600
达到0.6-0.8，加入0.2mm iptg，16℃，200rpm，诱导培养16h；收集所得的培养液，4℃，3500rpm，离心15分钟收集菌体，并用磷酸盐缓冲液将菌体洗涤2次后备用。
33.实施例3lumy-e216转化l-苯丙氨酸制备安息香酸：
34.以实施例2步骤(1)收集的lumy-e216菌体为催化剂构建反应体系，菌体添加量为终浓度20g/l，加入100mm的苯丙氨酸，ph＝8，反应条件为30℃，搅拌转速为200rpm，16h。用hplc法检测安息香酸的生成量，使用agilent1260液相色谱仪，色谱柱为eclipse xdb-c18柱(4.6
×
150mm)，柱温30℃，柱温30℃，检测波长215nm，流动相a为水(含1％三氟乙酸)，流动相b为乙腈(含1％三氟乙酸)，流速为1ml/min，梯度洗脱程序为：0分钟，95％流动相a+5％流动相b；8分钟，20％流动相a+80％流动相b；10分钟，20％流动相a+80％流动相b；14分钟，95％流动相a+5％流动相b，流速1ml/min。如图2所示，苯丙氨酸经基因重组菌转化后获得8.43g/l的安息香酸。
35.以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌中含有用于表达l-氨基酸脱氨酶的基因、表达羟基扁桃酸合成酶的基因、表达扁桃酸脱氢酶的基因、表达苯甲酰甲酸脱羧酶的基因、表达苯甲醛脱氢酶的基因和表达nadh氧化酶的基因。2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述l-氨基酸脱氨酶的氨基酸序列如seq id no:1所示，羟基扁桃酸合成酶的氨基酸序列如seq id no:2所示，扁桃酸脱氢酶的氨基酸序列如seq id no:3所示，苯甲酰甲酸脱羧酶的氨基酸序列seq id no:4所示，苯甲醛脱氢酶的氨基酸序列seq id no:5所示，nadh氧化酶的氨基酸序列seq id no:6所示。3.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述表达l-氨基酸脱氨酶的基因的核苷酸序列如seq id no:7所示，表达羟基扁桃酸合成酶的基因的核苷酸序列如seq id no:8所示，表达扁桃酸脱氢酶的基因的核苷酸序列如seq id no:9所示，表达苯甲酰甲酸脱羧酶的基因的核苷酸序列如seq id no:10所示，表达苯甲醛脱氢酶的基因的核苷酸序列如seq id no:11所示，表达nadh氧化酶的基因的核苷酸序列seq id no:12所示。4.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述l-氨基酸脱氨酶选自产粘变形菌；所述羟基扁桃酸合成酶选自异壁放线菌；所述扁桃酸脱氢酶选自热容芽孢杆菌；所述苯甲酰甲酸脱羧酶选自丁香假单胞菌；所述苯甲醛脱氢酶选自蒙氏假单胞菌；所述nadh氧化酶选自罗伊氏乳杆菌。5.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为大肠杆菌kare。6.如权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌kare通过大肠杆菌bl21(de3)敲除基因dkgb，yqhc，yqhd，yahk，yeae，dkga和yjgb得到。7.如权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌通过向大肠杆菌kare导入重组质粒prsfduet-laad-hmas、重组质粒petduet-mdh-bfd和重组质粒pcdfduet-badh-nox得到；重组质粒prsfduet-laad-hmas通过将表达l-氨基酸脱氨酶的基因和表达羟基扁桃酸合成酶的基因合成至prsfduet-1质粒得到；重组质petduet-mdh-bfd通过将表达扁桃酸脱氢酶的基因和表达苯甲酰甲酸脱羧酶的基因合成至petduet-1质粒得到；重组质pcdfduet-badh-nox通过将表达苯甲醛脱氢酶的基因和表达nadh氧化酶的基因合成至pcdfduet-1质粒得到。8.一种制备天然安息香酸的方法，其特征在于，构建转化体系，转化体系中以l-苯丙氨酸作为底物，以权利要求1-7任一所述的基因工程菌作为转化菌体将l-苯丙氨酸转化为天然安息香酸。9.如权利要求8所述的制备安息香酸的方法，其特征在于，转化体系中，l-苯丙氨酸的终浓度为5～100mm，基因工程菌的添加的终浓度20g/l，ph 6～8，转化温度为25～45℃，转化时间6～16h。

技术总结
本发明公开了一种基因工程菌及制备天然安息香酸的方法，本发明提供的基因工程菌可以催化L-苯丙氨酸制备安息香酸。基因工程菌中引入新的安息香酸高效合成路径，利用NADH氧化酶与扁桃酸脱氢酶和苯甲醛脱氢酶形成辅因子的再生循环，提高了底物转化效率，可以将L-苯丙氨酸高效转化为L-苯苷氨酸，是具有广泛应用前景的绿色生物合成技术。景的绿色生物合成技术。景的绿色生物合成技术。


技术研发人员：邵慧 阎冬 蔡毅
受保护的技术使用者：上海光玥生物科技有限公司
技术研发日：2022.10.14
技术公布日：2023/7/26