构建右心室心肌病变动物模型的试剂盒及方法

1.本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及构建右心室心肌病变动物模型的试剂盒及方法。


背景技术：

2.扩张型心肌病(dcm)是一种原因未明的原发性心肌疾病。本病的特征为左或右心室或双侧心室扩大，并伴有心室收缩功能减退，伴或不伴充血性心力衰竭。室性或房性心律失常多见。病情呈进行性加重，死亡可发生于疾病的任何阶段。
3.右心室扩张型心肌病是一类主要累及到右心室，其临床表现差异较大，绝大多数患者可出现心悸，易疲劳，胸闷，头晕及晕厥，甚至突发猝死。少数患者可发生右心衰竭，低血压休克。该类患者常有心界扩大，胸骨左下缘可闻及1-2级收缩期杂音，出现病理性第三，四心音，第二音宽分裂及心动过速等。右心室心肌病预后极差，死亡率高，除了利尿等针对心衰的对症治疗外，临床上目前缺乏特异、有效的治疗方案。
4.既往研究中针对右心室心肌病的少许队列研究证实了dsc2与右心室心肌病的相关性。2013年brenda g等第一次在2个大的哈特莱特教派家系中报道了纯合突变的dsc2基因，c.1660c》t(p.q554x)，为无义突变为终止密码子，临床表现为左右心室皆受累的心肌病；2014年basil al-sabeq等报道了一个黎巴嫩家系中纯合突变的dsc2基因，c.712_714delgat(p.asp238del)，临床表现为典型的arvc；2015年alessandra lorenzon等报道了意大利家系中首次发现的纯合突变的dsc2基因，c.536a》g(p.d179g)，临床表现为左右心室皆受累的心肌病，尽管他们的研究通过构建突变体在细胞系上观察到dsc2突变对细胞连接造成影响，但并未在体内研究证实，并且具体机制并不明确。
5.桥粒是细胞间连接的主要方式，对维持上皮组织的正常形态和功能具有重要意义。桥粒胶蛋白(dsc)为钙粘蛋白超家族成员之一，与桥粒芯糖蛋白(dsg)合称为桥粒钙粘素(dc)，是组成桥粒的重要蛋白成分。dsc2蛋白是一种钙黏蛋白，属于跨膜蛋白，是桥粒的重要成分，在心肌、骨骼肌和消化道上皮中高表达，而桥粒是心肌细胞之间的重要连接，是闰盘的关键组成部分，桥粒不但可维持心肌组织结构和功能的完整性，增强心肌细胞承受机械应力时的黏附作用，还广泛参与到调控心肌细胞内外的信号转导途径。通过对dsc2蛋白晶体结构解析发现，dsc2可形成二聚体结构，早期桥粒的装配过程中，dsc2蛋白形成同源二聚体，而成熟桥粒的装配过程中dsc2蛋白和dsg2蛋白形成异源二聚体。其他桥粒相关蛋白(pkp2，dsp，dsg2和jup)等突变等已经证实和心肌病特别是arvc等发病机制有关，主要是影响心肌细胞的桥粒以及闰盘结构从而引起心肌病变有关。既往已有报道相关桥粒蛋白(pkp2,dsp,dsg2和jup)移码突变或无意突变造成的小鼠胚胎致死。
6.可以看到，目前缺乏一种安全有效的右心室扩张型心肌病动物模型构建试剂和方法。


技术实现要素：

7.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种安全有效、可构建单纯的右心室扩张型心肌病动物模型的试剂盒和方法，分别在dsc2基因的外显子4中c.411-412位点和外显子5中c.482-483位点插入目标序列和3xflag标签序列使dsc2基因发生移码突变，构建的模型动物出现单纯的右心室扩张型心肌病特征，有助于提高对右心室心肌病的病例进程认识和研究。
8.本发明的第一方面提供了一种构建右心室心肌病变动物模型的试剂盒，包括目标序列插入试剂和识别标签序列插入试剂；
9.目标序列插入试剂可使dsc2基因的c.411-412位点之间插入目标序列或其同源性99％以上的核苷酸序列；目标序列包括aagatgg；
10.识别标签序列插入试剂可使dsc2基因的c.482-483位点之间插入识别标签序列。
11.优选地，所述目标序列插入试剂包括以c.411-412位点为靶标设计的sgrna序列。
12.优选地，所述sgrna序列选自下述序列中的一种或多种：
13.表1
[0014] 名称grna序列(5
’→3’
)pamseq id no.1grna1tgggctcttgcatggcaacgtggseq id no.2grna2acgttgccatgcaagagcccaggseq id no.3grna3cagccgtgccaagagaagatgggseq id no.4grna4gataggagcccatcttctcttgg
[0015]
优选地，所述识别标签序列插入试剂包括以c.482-483位点为靶标设计的sgrna序列。
[0016]
优选地，所述识别标签序列为3xflag序列，3xflag序列如seq id no.5所示：
[0017]
gactacaaagaccatgacggtgattataaagatcatgacatcgattacaaggatgacgatgacaag。
[0018]
优选地，所述右心室心肌病变包括右心室扩张型心肌病、右心衰竭、心肌凋亡、心肌纤维化中的一种或多种。
[0019]
本发明的第二方面提供了一种dsc2蛋白的移码突变体，所述移码突变体的氨基酸序列如seq id no.6所示：
[0020]
maavgsmrsgspafglghlltlailalasdackevvlqvpselpaekfvgrvnlmdclksadivhlsdpdfqvledgsvyttssvvlssgqrsftiwlfstdsqeereisvhlegpvevlnkrphtekvlsrakrrwkmgsyplfharefigslptfpstdpvdykdhdgdykdhdidykddddk。
[0021]
本发明的第三方面提供了一种编码dsc2蛋白的移码突变体的基因，包括如seq id no.7所示的目标序列插入后基因片段：
[0022]
gtttgaatgtctggggatgaagtagttatcaaccttaacttttttgtcttctaaatcaaggtactaaataaaagaccgcatacagagaaggttctcagccgtgccaagagaagatggaagatgggctcctatcccttgttccatgctagagaattcattgggtcccttcccacttttccttcaacaggtatagtttactttggctgt；
[0023]
和，如seq id no.8所示的识别标签序列插入后基因片段：
[0024]
catatgtcttatgtttatactatctgctctttagatccagtcgactacaaagaccatgacggtgattataaagatcatgacatcgattacaaggatgacgatgacaagtgacacagctcaaaactatagcatatactattccatcagaggtccaggagttgataaagaacctctaaacttattttatgtggaaagagatactggaaacctgtattgcactggt
cgtgtagatcgtgagcagtatgagtcctttgaggtaacgtctgaagatcatgtgttgtattaaaagaaagctgggga
[0025]
本发明的第四方面提供了一种构建右心室心肌病变动物模型的方法，包括使用前述技术方案所述试剂盒使目标动物的dsc2蛋白功能丧失。
[0026]
优选地，包括以下步骤：
[0027]
(1)以c.411-412位点和目标序列aagatgg为靶标构建目标序列插入试剂；以c.482-483位点和3xflag标签序列为靶标构建3xflag标签插入试剂；
[0028]
(2)将目标序列插入试剂、3xflag标签插入试剂和cas9蛋白混合并导入小鼠受精卵中，导入后的受精卵移入母鼠孕育，培养得到f0代小鼠；
[0029]
(3)筛选f0代小鼠中的阳性突变，将阳性突变小鼠进行自交和杂交得到f1代小鼠，筛选纯合子f1代小鼠为右心室扩张型心肌病动物模型。
[0030]
与现有技术相比，本发明的有益效果：
[0031]
在who的心肌病分类中往往将一部分无显著心率失常的心肌病也归于致心律失常性右室心肌病(arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy,arvc)，但实际上其病理机制和治疗方案可能完全不同，由于目前对于arvc小鼠模型各具特色，但也存在多种缺陷和问题，且对于单纯的右心室扩张性心肌病模型的小鼠目前尚未有关报道。因此，针对右心室扩张性心肌病及其心肌病诱发的的右心衰模型可以成为未来复制动物模型的趋势。这种精准复制动物模型的建立对提高右心室心肌病的病理进程的认识，并探索有效治疗的最佳策略至关重要。
[0032]
如图1所示，本发明意外发现，在dsc2基因的c.411-412位点插入目标序列aagatgg能使dsc2外显子4发生移码突变，基因翻译提前终止；在dsc2基因的c.482-483位点插入识别标签序列(如3xflag标签序列)，能够用于后续相关dsc2抗体实验的检测。因此，本发明提供了一种包括目标序列插入试剂和3xflag标签插入试剂的试剂盒，用于构建右心室心肌病变动物模型。本发明提供的试剂盒可定向诱导得到单纯的右心室扩张型心肌病及右心衰模型动物，插入对应序列后的动物模型随着年龄增长自身出现右心室扩大、右心室纤维新计划以及中晚期右心室心力衰竭等右心室心肌病的表现，对于右心室扩张型心肌病的研究具有重要意义
[0033]
发明人通过多次实验验证，本发明提供所述构建右心室心肌病变动物模型的试剂盒及方法能够稳定的实现诱导，且杂合子不会出现心脏扩大等相关表现。
附图说明
[0034]
图1为本发明构建右心室心肌病变动物模型的原理示意图；
[0035]
图2为本发明插入目标序列和3xflag标签序列前后的dsc2基因序列对照图；
[0036]
其中，绿色字体为鼠源dsc2基因外显子4，红色字体为鼠源dsc2基因外显子5，黄色标记区域分别为插入位点c.411_412和c.482_483位点，深蓝色标记为目标序列aagatgg，浅蓝色标记为3xflag标签序列；
[0037]
图3为小鼠心脏纵切大体标本masson染色图；
[0038]
其中，左侧为野生型小鼠心脏纵切大体标本masson染色图，右侧为本发明构建后的右心室扩张型心肌病模型小鼠心脏纵切大体标本masson图；
[0039]
图4为小鼠心脏masson染色40倍镜放大结果图；
[0040]
其中，左侧为野生型小鼠心脏masson40倍镜放大染色结果图，右侧为本发明构建后的右心室扩张型心肌病模型小鼠心脏masson40倍镜放大染色结果图；
[0041]
图5为小鼠心肌压力收缩结果图；
[0042]
其中，左侧为wt小鼠与ki小鼠等容收缩期压力的结果图，右侧为wt小鼠与ki小鼠等容舒张期压力的结果图；
[0043]
图6为小鼠心脏tunel染色结果图；
[0044]
其中，左侧为野生型小鼠心脏tunel染色结果图，右侧为本发明构建后的右心室扩张型心肌病模型小鼠心脏tunel染色结果图。
具体实施方式
[0045]
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。所有原料未注明合成方法的均购自探索平台、阿拉丁、sigma-aldrich等厂家，均为分析纯。
[0046]
实施例1
[0047]
一、右心室扩张型心肌病小鼠模型的构建
[0048]
鼠源dsc2基因有4个转录本，人源dsc2基因有3个转录本。选择人源dsc2-201(enst00000251081.8)和鼠源dsc2-201(ensmust00000039247.10)转录本，对比人源和鼠源基因的同源性，在鼠源dsc2-201的外显子4制作a138fs定点突变，在c.411_412插入aagatgg(目标序列)，导致dsc2基因翻译提前终止，同时在鼠源dsc2基因的c.482_483插入3
×
flag。
[0049]
插入前dsc2小鼠氨基酸序列(seq id no.9)如下(划线部分为目标序列插入位点前的氨基酸序列)：
[0050]
maavgsmrsgspafglghlltlailalasdackevvlqvpselpaekfvgrvnlmdclksadivhlsdpdfqvledgsvyttssvvlssgqrsftiwlfstdsqeereisvhlegpvevlnkrphtekvlsrakrrwapipcsmlenslgpfplflqqiqsdtaqnytiyysirgpgvdkeplnlfyverdtgnlyctgrvdreqyesfeltafattpdgytpeyplpllikiedendnypiftqklysftvqensrigsivgevcatdldepdtmhtrlrysileqspsppmlftmhpstgvitttsaqldrelidkyqllikvqdmdgqyfglhttakciitiedvndnlptftrttyvtsveentvnveilrltvqdkdlvnspnwranytilkgnengnfkivtdpktnegilcvikpldyeerqqvtlqigvvneapytreasskspmstatvtvtvtnqdegpecippmqtvriqenvpvgtrndgykaydpetrsssgiryrklsdprgwvtvnedsgsitifraldreaetvrngiynitvlaldadgrsctgtlgiiledvndngpfipkqtvvickatmssaeivavdlddpvngppfdfslessdsevqrmwrltrindtaarlsyqndpsfgsyavpirvtdrlglssvttlnvlvcdcitesdctlrsgertgyadvrlgpwailaillgiallfcilftlvcsvsraskqqkilpddlaqqnlivsnteapgddkvystnglttqtmgasgqtafttmgtgvksggqetiemvkggqqtldsrrgagyhhhtldpcrgghvevdnyrhtysewynfiqprlgdetirghtlikn
[0051]
插入后移码突变的dsc2小鼠氨基酸序列(seq id no.6)如下(划线部分为目标序列插入位点前的氨基酸序列，加粗部分为插入的3xflag氨基酸序列)：
[0052]
maavgsmrsgspafglghlltlailalasdackevvlqvpselpaekfvgrvnlmdclksadivhlsdpdfqvledgsvyttssvvlssgqrsftiwlfstdsqeereisvhlegpvevlnkrphtekvlsrakrrwkmgsyplfharefigslptfpstdpvdykdhdgdykdhdidykddddk
[0053]
按照图1所示，通过crispr-cas9技术构建在c.411_412之间插入aagatgg碱基后，引起后续的氨基酸移码突变，产生截短的蛋白，造成dsc2的不表达，构建得到dsc2 ki小鼠(右心室扩张型心肌病小鼠模型)。
[0054]
移码突变前后的核苷酸序列对比如图2所示。小鼠在目标序列插入前的部分基因片段如seq id no.10所示：
[0055]
gtttgaatgtctggggatgaagtagttatcaaccttaacttttttgtcttctaaatcaaggtactaaataaaagaccgcatacagagaaggttctcagccgtgccaagagaagatgggctcctatcccttgttccatgctagagaattcattgggtcccttcccacttttccttcaacaggtatagtttactttggctgt。
[0056]
目标序列插入后基因片段如seq id no.7所示，为c.411_412之间插入aagatgg碱基后的移码突变体部分编码基因片段：
[0057]
gtttgaatgtctggggatgaagtagttatcaaccttaacttttttgtcttctaaatcaaggtactaaataaaagaccgcatacagagaaggttctcagccgtgccaagagaagatggaagatgggctcctatcccttgttccatgctagagaattcattgggtcccttcccacttttccttcaacaggtatagtttactttggctgt。
[0058]
小鼠在标签序列插入前的部分基因片段如seq id no.11所示：
[0059]
catatgtcttatgtttatactatctgctctttagatccagtctgacacagctcaaaactataccatatactattccatcagaggtccaggagttgataaagaacctctaaacttattttatgtggaaagagatactggaaacctgtattgcactggtcgtgtagatcgtgagcagtatgagtcctttgaggtaacgtctgaagatcatgtgttgtattaaaagaaagctgggga。
[0060]
目标序列插入后基因片段如seq id no.8所示，为c.482_483插入3
×
flag标签序列后的移码突变体部分编码基因片段：
[0061]
catatgtcttatgtttatactatctgctctttagatccagtcgactacaaagaccatgacggtgattataaagatcatgacatcgattacaaggatgacgatgacaagtgacacagctcaaaactatagcatatactattccatcagaggtccaggagttgataaagaacctctaaacttattttatgtggaaagagatactggaaacctgtattgcactggtcgtgtagatcgtgagcagtatgagtcctttgaggtaacgtctgaagatcatgtgttgtattaaaagaaagctgggga。
[0062]
二、右心室扩张型心肌病小鼠模型验证
[0063]
1.dsc2 ki小鼠模型右心室大小
[0064]
通过多聚甲醛固定小鼠心脏后，纵切小鼠心脏，masson染色后，结果如图3所示，与野生型相比较，dsc2 ki的小鼠右心室明显变大，室壁变薄，右心室壁出现纤维化。
[0065]
2.dsc2 ki小鼠模型心肌纤维化情况
[0066]
将纵切小鼠masson染色的标本放至显微镜下，用40倍镜观察心脏纤维化情况。结果如图4所示，与野生型相比较，dsc2 ki的小鼠心肌纤维化较为严重。
[0067]
3.dsc2 ki小鼠模型心肌压力收缩情况
[0068]
通过将压力导丝至于wt小鼠或ki小鼠的心室内，观测小鼠压力，结果如图5所示，可以看出，与野生型相比dsc2 ki小鼠相应的右心室心肌收缩能力下降，右心室压力降低。
[0069]
4.dsc2 ki小鼠模型心肌凋亡水平
[0070]
通过tunel染色观察小鼠心肌凋亡水平，结果如图6所示，，与野生型相比dsc2 ki小鼠相应心肌凋亡水平增加。
[0071]
综上所述，本发明成功构建了dsc2基因敲入的小鼠模型，可用于后续对右心室心
肌疾病及右心室心功能异常等相关疾病提供一种便捷的，不需要其他手术或药物诱导的小鼠模型。目前尚未有合适的小鼠模型来监测小鼠右心室舒张功能指标的模型，dsc2基因敲入小鼠可用于测量右心室收舒张功能的模型。dsc2基因敲入小鼠可有效的激活凋亡相关通路，可用于对于凋亡相关通路及分子机制的研究，且作为开发凋亡通路调控试剂和药物。dsc2基因敲入小鼠可有效的激活纤维化相关通路，可用于对于纤维化相关通路及分子机制的研究，且作为开发纤维化通路调控试剂和药物。
[0072]
本发明以移码突变造成的dsc2基因敲入小鼠诱导的右心室心肌病模型为实验疾病对象，在不做任何药物和手术处理下，单纯的dsc2基因敲入片段，便可有效的诱导右心室心肌病。其具体优点如下：
[0073]
1)创新点：本发明发现一个新的诱导右心室扩张性心肌病及右心衰模型小鼠。该小鼠模型在尚未有任何外界干预处理的基础上，单纯的dsc2基因敲入便可随着小鼠年龄的增长，小鼠自身出现右心室扩大，右心室心肌纤维化，以及中晚期右心室心力衰竭等右心室心肌病的表现。由此可以认为，该小鼠可以作为后续对右心室扩张性心肌病的分子机制研究中一种有效的模型小鼠。
[0074]
2)可靠性：重复多次试验发现，dsc2基因敲入小鼠能成功的诱导出右心室心肌病模型，而杂合子却没有心脏扩大等相关的表现，进一步证明，当dsc2基因敲入能有效的诱导出右心室心肌病模型。
[0075]
3)推广前景：在who的心肌病分类中往往将一部分无显著心率失常的心肌病也归于致心律失常性右室心肌病(arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy,arvc)，但实际上其病理机制和治疗方案可能完全不同，由于目前对于arvc小鼠模型各具特色，但也存在多种缺陷和问题，且对于单纯的右心室扩张性心肌病模型的小鼠目前尚未有关报道。因此，针对右心室扩张性心肌病及其心肌病诱发的的右心衰模型可以成为未来复制动物模型的趋势。这种精准复制动物模型的建立对提高右心室心肌病的病理进程的认识，并探索有效治疗的最佳策略至关重要。
[0076]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
[0077]
[0078]
[0079]
[0080]
[0081]
[0082]
[0083]
[0084]

技术特征：
1.一种构建右心室心肌病变动物模型的试剂盒，其特征在于，包括目标序列插入试剂和识别标签序列插入试剂；目标序列插入试剂可使dsc2基因的c.411-412位点之间插入目标序列或其同源性99％以上的核苷酸序列；目标序列包括aagatgg；识别标签序列插入试剂可使dsc2基因的c.482-483位点之间插入识别标签序列。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述目标序列插入试剂包括以c.411-412位点为靶标设计的sgrna序列。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述sgrna序列选自下述序列中的一种或多种：如seq id no.1所示的grna1：tgggctcttgcatggcaacg，其识别靶点处序列为tgg；如seq id no.2所述的grna2：acgttgccatgcaagagccc，其识别靶点处序列为agg；如seq id no.3所示的grna3：cagccgtgccaagagaagat，其识别靶点处序列为ggg；如seq id no.4所示的grna3：gataggagcccatcttctct，其识别靶点处序列为tgg。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述识别标签序列插入试剂包括以c.482-483位点为靶标设计的sgrna序列。5.根据权利要求1或4所述的试剂盒，其特征在于，所述识别标签序列为3xflag序列，3xflag序列如seq id no.5所示：gactacaaagaccatgacggtgattataaagatcatgacatcgattacaaggatgacgatgacaag。6.根据权利要求1-5任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述右心室心肌病变包括右心室扩张型心肌病、右心衰竭、心肌凋亡、心肌纤维化中的一种或多种。7.一种dsc2蛋白的移码突变体，其特征在于，所述移码突变体的氨基酸序列如seq id no.6所示：maavgsmrsgspafglghlltlailalasdackevvlqvpselpaekfvgrvnlmdclksadivhlsdpdfqvledgsvyttssvvlssgqrsftiwlfstdsqeereisvhlegpvevlnkrphtekvlsrakrrwkmgsyplfharefigslptfpstdpvdykdhdgdykdhdidykddddk。8.一种编码权利要求7所述移码突变体的基因，其特征在于，包括如seq id no.7所示的目标序列插入后基因片段：gtttgaatgtctggggatgaagtagttatcaaccttaacttttttgtcttctaaatcaaggtactaaataaaagaccgcatacagagaaggttctcagccgtgccaagagaagatggaagatgggctcctatcccttgttccatgctagagaattcattgggtcccttcccacttttccttcaacaggtatagtttactttggctgt；和，如seq id no.8所示的识别标签序列插入后基因片段：catatgtcttatgtttatactatctgctctttagatccagtcgactacaaagaccatgacggtgattataaagatcatgacatcgattacaaggatgacgatgacaagtgacacagctcaaaactatagcatatactattccatcagaggtccaggagttgataaagaacctctaaacttattttatgtggaaagagatactggaaacctgtattgcactggtcgtgtagatcgtgagcagtatgagtcctttgaggtaacgtctgaagatcatgtgttgtattaaaagaaagctgggga。9.一种构建右心室心肌病变动物模型的方法，其特征在于，包括使用权利要求1-6任意一项所述试剂盒使目标动物的dsc2蛋白功能丧失。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以c.411-412位点和目标序列aagatgg为靶标构建目标序列插入试剂；以c.482-483
位点和3xflag标签序列为靶标构建3xflag标签插入试剂；(2)将目标序列插入试剂、3xflag标签插入试剂和cas9蛋白混合并导入小鼠受精卵中，导入后的受精卵移入母鼠孕育，培养得到f0代小鼠；(3)筛选f0代小鼠中的阳性突变，将阳性突变小鼠进行自交和杂交得到f1代小鼠，筛选纯合子f1代小鼠为右心室扩张型心肌病动物模型。

技术总结
本发明提供了一种构建右心室心肌病变动物模型的试剂盒及方法，分别在DSC2基因的外显子4中c.411-412位点和外显子5中c.482-483位点插入目标序列和识别标签序列(如3xFlag标签序列)使DSC2基因发生移码突变，构建的模型动物出现单纯的右心室扩张型心肌病特征，有助于提高对右心室心肌病的病例进程认识和研究。提高对右心室心肌病的病例进程认识和研究。


技术研发人员：戴宇翔 龚惠 邹妍 黄晨兴 常书褔 葛均波
受保护的技术使用者：复旦大学附属中山医院
技术研发日：2022.10.12
技术公布日：2023/7/26