一种重组CAR19-IL24基因、慢病毒载体、CAR19-IL24-T细胞及应用

一种重组car19-il24基因、慢病毒载体、car19-il24-t细胞及应用
技术领域
1.本发明属于肿瘤细胞免疫技术领域，具体涉及一种重组car19-il24基因、慢病毒载体、car19-il24-t细胞及应用。


背景技术：

2.嵌合抗原受体t细胞免疫疗法(chimeric antigen receptor t-cellimmunotherapy)又称car-t细胞免疫疗法，是一种利用嵌合抗原受体t细胞来进行免疫治疗的新型疗法。嵌合抗原受体t细胞(car-t)即经过修饰改造在表面表达嵌合抗原受体(car)分子的t细胞。表达在t细胞膜上的car分子将对t细胞进行“重指导”，赋予其对表达car分子靶点的靶细胞的特异性识别和杀伤能力，从而特异性清除患者体内的肿瘤靶细胞。嵌合抗原受体(car)一般包括能识别某种肿瘤抗原的抗体的抗原结合部(通常来源于抗体抗原结合区域的scfv段)，一个胞外铰链区、一个跨膜区和一个胞内信号转导区(通常为共刺激信号结构域和cd3ζ胞内区)，这些构件按一定顺序偶联在一起即组成为一个嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,car)。
3.1993年以色列科学家zelig eshhar首次提出car-t概念；2011年美国宾夕法尼亚大学carl h.june教授团队应用car-t疗法在1例慢性淋巴细胞白血病(cll)患者的治疗中获得突破。2012年该团队成功应用car-t细胞治疗急性淋巴细胞性白血病(all)患者emily，迄今仍未复发。2013年《science》将car-t细胞免疫疗法评为全球十大科技突破之首。2017年已有两款car-t产品被美国fda批准进入临床应用，国内也有相应的car-t产品正在临床审批阶段。
4.迄今car-t细胞免疫疗法已经成为治疗人特定肿瘤的突破性方法。car-t细胞免疫疗法的治疗效果和重组car分子的设计密切相关，car分子决定了car-t细胞所适应的肿瘤类型以及car-t细胞治疗的效果。目前报道较多的car是第二代或第三代设计，它们的作用效果仍有待提高，如何进一步优化或这改进car设计是提高cart治疗效果的关键。目前已有研究报道，联合细胞因子il12，il15，il18和il33可以增强car-t的治疗效果，提示其它的白介素也可能增强cart的治疗效果。目前尚无自分泌il-24的car-t细胞产品。


技术实现要素：

5.本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种重组car19-il24基因、慢病毒载体、car19-il24-t细胞及应用。
6.为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
7.一种重组car19-il24基因，所述重组car19-il24基因的序列如seq id no.1所示。
8.一种慢病毒载体，所述慢病毒载体携带上述重组car19-il24基因，慢病毒载体序列如seq id no.2所示。
9.一种表达重组car19-il24基因的t细胞，所述表达重组car19-il24基因的t细胞由
上述慢病毒载体转导至t细胞中制备而成。
10.一种t细胞，所述t细胞共同表达car和il24。
11.优选地，所述t细胞是将car的表达基因与il24的表达基因连接后，构建于同一载体的同一表达框中，再将载体转导至t细胞制备而成。
12.优选地，其特征在于，所述t细胞是将car的表达基因与il24构建于同一载体的不同表达框中，再将载体转导至t细胞制备而成。
13.下面对本发明作进一步说明：
14.本发明所述的重组car19-il24基因联合了白介素24(il-24)和嵌和抗原受体(car)，包含编码如下部分的核酸序列：胞外区的特异性识别肿瘤抗原的抗体的抗原结合部分，跨膜部分和胞内区的cd28胞浆功能区、41bb胞浆功能区和cd3zeta胞浆功能区，这些胞内区可以任意顺序连接，以及可以自分泌的il-24。使用所述的重组car19-il24基因及含有该重组car19-il24基因的载体转染t细胞的效率较高，且经转染后的阳性t细胞具有较好的增殖能力。此外，以特异性识别cd19分子的car19.il-24为例，本发明所述的重组car19.il24基因对b细胞肿瘤抗原cd19分子的特异性高，促使car19.il24-t细胞特异性地杀伤cd19+的b细胞肿瘤。
15.本发明前期实验结果以及分析得知，il-24的表达能增强了cart治疗潜能。一方面，il24可以增强t细胞的增殖和活化。t细胞增殖和活化潜能是影响cart产品治疗效果的关键因素之一，具有更强增殖和活化潜能的t细胞，更容易在体外培养和回输到患者体内后大量扩增，并且更有利于在体内长期维持抗肿瘤活性。另一方面，il24对多种肿瘤细胞展现出抗肿瘤作用，如引起肿瘤细胞特异性凋亡，抗肿瘤血管生成，抑制肿瘤细胞侵袭和转移等。此外，il24分子比较小，比较容易向car序列中添加il24表达框。基于上述实验和分析结果，本发明首次提出融合il24的增强型car19(car19-il24)结构设计，并构建携带该序列的慢病毒载体lv-car19-il24，随后制备了表达重组car19-il24基因的car-t细胞。其目的在于证实该car19-il24设计的有效性和安全性，为car19-il24-t细胞的临床应用奠定基础。
16.以特异识别cd19分子的car19.il-24为例：
17.1)本发明首先根据已有报道以及生物信息学方式查找到特异识别cd19分子的car19，t2a，il24cds序列，通过基因合成car序列，car19-il24序列。
18.2)通过分子克隆技术将car19序列和car19-il24序列连入慢病毒载体addgene：#12252。二者之间通过t2a连接(以上各段dna序列暂未附录)。
19.3)采集正常人志愿者外周血密度梯度离心分离单个核细胞(pbmc)，然后负向分选获得总t细胞(pant细胞)，使用cd3/28磁珠刺激并添加il-2进行体外扩增。
20.4)包装携带重组car19-il24基因的慢病毒，转导经cd3/28磁珠刺激24小时的pant细胞，制备表达重组car19-il24基因的增强型cart细胞。
21.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
22.1)通过测序证实构建好的慢病毒载体序列元件均无突变。
23.2)利用慢病毒载体制备的il24增强的car19.il-24-t细胞相比car19-t细胞具有更高的抗肿瘤活性。t细胞在经过慢病毒转导之后，通过pcr鉴定，确定成功整合了car序列，通过流式细胞术，western blot，q-pcr检测确定成功表达car分子。
24.3)通过细胞增殖能力检测确定car19.il-24-t细胞具有更强的增殖能力。
25.4)通过体外共培养细胞毒性检测确定car19.il-24-t细胞有更强的肿瘤杀伤效果。另外，根据本发明的思路，可以选择不同的car胞外区-胞内结构域与il24组合，以适应不同的肿瘤细胞类型。可以选择不同的连接原件将il-24与car分子以不同的顺序构建在同一个表达框。可以将il-24和car分开放置于不同的表达框共同表达在t细胞。
26.总之，本发明联合白介素24和嵌合抗原受体以在肿瘤免疫治疗应用中获得更好的治疗效果，利用本发明可以有效制备car19-il24-t细胞，其表达靶向肿瘤抗原的嵌合抗原受体和白介素24。与cd19-cart细胞相比，car19-il24-t细胞有更强的杀瘤功能和更好的增殖能力。并证实car19-il24-t细胞是一种安全、特异、有效的cart细胞，具有重要的临床应用价值。
附图说明
27.图1为car19和car19-il24示意图；
28.图2为使用western blot检测car19和car19-il24在细胞内的蛋白表达水平图；
29.图3为使用倒置荧光显微镜观察car19-il24-t细胞gfp表达图；
30.图4为使用flow cytometry检测car19-t和car19-il24-t表面的car19分子；
31.图5为car19.il-24-t细胞的功能检测结果图；图中，e：效用细胞，分别lv-car19-il24转导的car19-il24-t细胞，lv-car19转导的car19-t细胞，和同批次的转导lv-gfp的t细胞；t：靶细胞，为cd19阳性的raji细胞；利用annexin-v apc+检测cd19阳性细胞(即raji细胞)的凋亡情况，纵坐标表示靶细胞的凋亡比例；
32.图6为使用pcr从已有的含il-24序列的质粒扩增il-24图；
33.图7为菌液pcr鉴定条件图。
具体实施方式
34.1.car19表达框以及慢病毒载体的构建
35.(1)根据已有报道以及生物信息学方式查找到特异识别cd19分子的fmc63scfv序列，设计跨膜区以及胞内信号转导区序列并基因合成序列(car19)，car19序列两端设计有bbs1酶切位点，该序列装载于puc57质粒(puc57-car19)。
36.(2)bbsi酶切puc57-car19，将分别在car19序列5’和3’端产生bamh1和agei粘性末端。同时使用bamh1和agei双酶切二代慢病毒载体质粒phq-009。(附酶切体系)
37.(3)胶回收phq-009骨架7379bp和car19序列1534bp。使用t4dnaligase连接构建质粒phq-010，连接时间室温(25℃)不超过10min或者16℃水浴过夜。(附连接体系)
38.(4)取连接产物5μl，使用stbl3进行转化。(附stbl3转化体系)
39.(5)14小时后挑取单克隆进行菌液pcr鉴定。(附菌液pcr体系与条件)
40.(6)取菌液pcr阳性克隆进行sanger测序鉴定。
41.(7)取sanger测序鉴定序列与理论序列一致的克隆进行质粒大提phq-010，其为含有car19序列的二代慢病毒载体质粒。
42.2.car19.il-24表达框以及慢病毒载体的构建
43.(1)使用pcr从已有的含il-24序列的质粒扩增il-24，利用上下游引物分别引入xmai和hindiii酶切位点。(附质粒pcr体系与条件见表1，使用pcr从已有的含il-24序列的
质粒扩增il-24见图6)
44.表1
[0045][0046]
(2)将pcr产物进行胶回收纯化723bp。使用t4dna ligase连入pgem-t-easy载体。根据od值和骨架及片段长度估算连接体系中加入的量，以插入片段:骨架的摩尔量比值在3:1～10:1之间配制体系(见表2)：
[0047]
表2
[0048][0049]
(3)取连接产物5μl，使用dh5α进行转化，进行“蓝白”筛选。
[0050]
取dh5α感受态置于冰浴中溶解5min。
[0051]
向其中加入5μl连接产物/100μl感受态。
[0052]
冰水中静置30min。
[0053]
42℃水浴90s。不要摇动
[0054]
快速转移到冰水中冷却3min。
[0055]
加不含amp抗性的培养基900μl，置于37℃摇床-转速150rpm*45min。
[0056]
准备蓝白筛选用的平板(含iptg/x-gal的氨苄抗性平板)：将10μl的100mm iptg和40μl20mg/ml x-gal涂到氨苄抗性平板的表面上，并在室温避光正置30分钟使之吸收后备用。取适量f)中的菌液涂布到g)中平板，置于37℃温箱，倒置培养14小时。
[0057]
(4)挑取白色克隆进行sanger测序验证。取sanger测序鉴定序列与理论序列一致的克隆进行质粒大提phq-040。
[0058]
(5)使用xma1和hindiii双酶切phq-040；使用age1和hindiii双酶切puc57-car19。按下表配制phq-040反应体系(见表3)：
[0059]
表3
[0060][0061]
按下表配制puc57-car19反应体系(表4)：
[0062]
表4
[0063][0064]
(6)胶回收phq-040中的il-24序列723bp和puc57-car19骨架4290bp。使用t4dnaligase连接构建质粒phq-036，连接时间室温(25℃)不超过10min或者16℃水浴过夜。(附连接体系)
[0065]
根据od值和骨架及片段长度估算连接体系中加入的量，以插入片段:骨架的摩尔量比值在3:1～10:1之间配制体系(表5)：
[0066]
表5
[0067][0068]
(7)取连接产物5μl，使用dh5α进行转化。(附dh5α转化体系)
[0069]
a)取dh5α感受态置于冰浴中溶解5min。
[0070]
b)向其中加入5μl连接产物/100μl感受态。
[0071]
c)冰水中静置30min。
[0072]
d)42℃水浴90s。不要摇动
[0073]
e)快速转移到冰水中冷却3min。
[0074]
f)加不含amp抗性的培养基900μl，置于37℃摇床-转速150rpm*45min。
[0075]
g)取适量f)中的菌液涂布到amp抗性平板，置于37℃温箱，倒置培养14小时。
[0076]
(8)14小时后挑取单克隆进行菌液pcr鉴定。(附菌液pcr体系与条件，pcr条件图见图7)
[0077]
将单克隆用无菌小tip挑取至300μl lb培基，置于37℃摇床-转速150rpm*45min后用于下述pcr(表6)：
[0078]
表6
[0079][0080]
(9)取菌液pcr阳性克隆进行sanger测序鉴定。
[0081]
(10)取sanger测序鉴定序列与理论序列一致的克隆进行质粒大提phq-036。
[0082]
(11)使用bbs1酶切phq-036，胶回收car19.il-24序列2215bp；同时使用bamh1和age1双酶切二代慢病毒载体质粒phq-009，胶回收phq-009骨架7379bp；使用t4dna ligase连接构建质粒phq-035，其为含有car19.il-24序列的二代慢病毒序列。
[0083]
3 car 19和car19.il-24慢病毒制备(见表7)：
[0084]
表7
[0085][0086]
4.car 19-t细胞和car19.il-24-t细胞制备
[0087]
(1)采集正常人志愿者外周血密度梯度离心分离单个核细胞(pbmc)，然后负向分选获得总t细胞(pant细胞)，使用cd3/28磁珠刺激并添加il-2进行体外扩增。
[0088]
(2)car 19和car19.il-24慢病毒分别转导经cd3/28磁珠刺激24小时的pant细胞，制备car19-t细胞和表达重组car19.il-24基因的增强型cart细胞。
[0089]
5.car19.il-24-t细胞的检测
[0090]
car表达水平检测
[0091]
见图2，car19箭头指示的是car19蛋白的位置，il24箭头指示的是il24蛋白位置。结合蛋白marker：26616(thermofisher)指示，提示细胞内表达的car19，car19-il24与预期的car19蛋白和il24蛋白大小相符。
[0092]
见图3，使用慢病毒载体lv-car19-il24转导t细胞后，其携带的gfp将在细胞内表达。左图为明场图像，右图为同一视野下的荧光图像。提示慢病毒载体lv-car19-il24转导的t细胞表达gfp，指示病毒转导的成功和car19-il24的表达。
[0093]
见图4，使用慢病毒载体lv-car19，lv-car19-il24转导t细胞后，其携带的car19分子将在t细胞表面表达。利用apc偶联的抗体检测car19分子，图中的m1区为明显的阳性信号，提示car19分子在t细胞表面有较高的表达水平，左图提示慢病毒载体lv-car19转导后有55.96％的t细胞表达car19分子，右图提示lv-car19-il24转导后有63.8％的t细胞表达car19分子。
[0094]
6.car19.il-24-t细胞的功能检测
[0095]
细胞毒性检测
[0096]
图5显示，当e:t的细胞比例为5-8时，car19-il24-t细胞和car19-t细胞均能显示促靶细胞凋亡的效果，更重要的是，car19-il24-t的促凋亡效果较car19-t明显更好。

技术特征：
1.一种联合白介素24(il-24)和嵌合抗原受体(car)的重组car19-il24基因，其包含编码如下部分的核酸序列：胞外区的特异性识别肿瘤抗原的抗体的抗原结合部分，跨膜部分和胞内区的cd28胞浆功能区、41bb胞浆功能区和cd3zeta胞浆功能区。2.根据权利要求1的重组car19-il24基因，其中所述重组car19-il24基因还包含编码il-24的核酸序列，优选地所述il-24是能够自分泌的il-24。3.根据权利要求1或2的重组car19-il24基因，其中所述胞外区的特异性识别肿瘤抗原的抗体的抗原结合部分是特异性识别cd19分子的抗体的抗原结合部分。4.根据权利要求1至3任一项的重组car19-il24基因，其中所述重组car19-il24基因的序列如seq id no.1所示。5.一种载体，其携带权利要求1至4任一项所述的重组car19-il24基因。6.根据权利要求5的载体，其是重组慢病毒载体，优选地所述慢病毒载体的序列如seq id no.2所示。7.一种t细胞，其共同表达car和il24。8.根据权利要求7的t细胞，其中所述t细胞携带根据权利要求1至4任一项所述的重组car19-il24基因或者根据权利要求5或6所述的载体，或者通过导入根据权利要求1至4任一项所述的重组car19-il24基因或者根据权利要求5或6所述的载体而制成。9.根据权利要求7或8的t细胞，其中所述t细胞是将car的表达基因与il24的表达基因连接后，构建于同一载体的同一表达框中，再将载体转导至t细胞而制成。10.根据权利要求7或8的t细胞，其中所述t细胞是将car的表达基因与il24构建于同一载体的不同表达框中，再将载体转导至t细胞而制成。11.根据权利要求1至4任一项所述的重组car19-il24基因、根据权利要求5或6所述的载体、或者根据权利要求7至10任一项所述的t细胞用于特异性杀伤cd19
+
的肿瘤的用途。

技术总结
本发明公开了一种重组CAR19-IL24基因、慢病毒载体、CAR19-IL24-T细胞及应用，属于肿瘤细胞免疫技术领域。利用本发明可以有效制备CAR19-IL24-T细胞，其表达靶向肿瘤抗原的嵌合抗原受体和白介素24，有良好的肿瘤杀伤能力。CAR19-IL24-T细胞是一种安全、特异、有效的CART细胞，具有重要的临床应用价值。具有重要的临床应用价值。


技术研发人员：梁德生 刘雄昊 胡乾 邬玲仟 刘慕君
受保护的技术使用者：中南大学
技术研发日：2018.12.12
技术公布日：2023/7/26