一种桉树分化培养基及其应用的制作方法

1.本发明涉及植物组织培养技术领域，特别是涉及一种桉树分化培养基及其应用。


背景技术：

2.桉树(eucalyptus)是桃金娘科(myrtaceae)杯果木属(angophora)、伞房属(corymbia)和桉属(eucalyptus)3个属树种的统称，共有808个种和137个亚种或变种，共计945个分类群，是我国南方速生丰产林战略树种，在缓解木材等林产品短缺方面发挥着重要的作用。遗传控制、培育优良的抗性品种有利于桉树产业的可持续发展。为了研究桉树的基因功能和进行转基因育种，首先需要解决桉树再生体系的构建问题。
3.目前虽然有多篇论文已发表了桉树再生体系的构建方法，但是由于无性系不同、实验药品不可得、配方无法重复性等问题，导致桉树再生体系无法广泛应用推广，且目前针对尾巨桉dh3229、尾叶桉ldud26和尾叶桉zquc14的再生体系的构建过程中，存在不定芽诱导效果和褐化率高的问题。


技术实现要素：

4.为了解决上述问题，本发明提供了一种桉树分化培养基及其应用。本发明提供的桉树分化培养基，可以有效诱导尾巨桉dh3229、尾叶桉ldud26和尾叶桉zquc14的不定芽生成，10d左右可见(即肉眼可以看到)茎段形成愈伤组织，30d左右可见茎段两端膨大，60d左右可见茎段不定芽生成，此后茎段呈爆发式生长，而且茎段的褐化率仅为30％。
5.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
6.本发明提供了一种桉树分化培养基，所述桉树分化培养基以ms培养基为基础培养基，还包括以下浓度的组分：6-苄基氨基嘌呤0.5～2mg/l、激动素1～3mg/l、萘乙酸0.02～0.05mg/l和蔗糖15～30g/l。
7.优选的，所述桉树分化培养基的适用植物包括尾巨桉dh3229、尾叶桉ldud26或尾叶桉zquc14；
8.所述桉树分化培养基的适用植物为尾巨桉dh3229时，所述桉树分化培养基中激动素的浓度为1～1.5mg/l；
9.所述桉树分化培养基的适用植物为尾叶桉ldud26或尾叶桉zquc14时，所述桉树分化培养基中激动素的浓度为2mg/l。
10.本发明还提供了上述技术方案所述的桉树分化培养基在桉树组织培养中的应用。
11.优选的，所述应用包括诱导愈伤组织生成和/或诱导芽生成。
12.优选的，所述桉树包括尾巨桉dh3229、尾叶桉ldud26或尾叶桉zquc14。
13.本发明还提供了一种桉树的组织培养方法，包括以下步骤：
14.将外植体接种到桉树分化培养基上，进行诱导培养，得到不定芽；
15.所述外植体包括桉树苗的茎段；所述桉树分化培养基包括上述技术方案所述的桉树分化培养基。
16.优选的，所述茎段的长度为0.3～0.7cm。
17.优选的，所述诱导培养的方法包括：先暗培养3～6d后再进行光照培养；所述光照培养的条件包括：温度为25℃，光照强度为1000～1500lux，每天的光暗时间比为16h：8h。
18.优选的，所述诱导培养的方法还包括：当所述外植体出现失绿现象时，更换所述桉树分化培养基。
19.优选的，所述组织培养方法还包括：将所述不定芽转入生根培养基上，进行生根培养，得到完整的植株；所述生根培养基以1/2ms培养基为基础培养基，还包括吲哚乙酸0.1～0.2mg/l和琼脂5～7g/l。
20.有益效果：
21.本发明提供了一种桉树分化培养基，所述桉树分化培养基以ms培养基为基础培养基，还包括以下浓度的组分：6-苄基氨基嘌呤0.5～2mg/l、激动素1～3mg/l、萘乙酸0.02～0.05mg/l和蔗糖15～30g/l。本发明通过在ms培养基中添加适宜浓度的6-苄基氨基嘌呤、激动素和萘乙酸，配制得到的桉树分化培养基可以有效诱导尾巨桉dh3229、尾叶桉ldud26和尾叶桉zquc14的不定芽生成，且从外植体到不定芽生成过程中，无需改变培养基配方，采用本发明提供的桉树分化培养基可以直接将外植体诱导分化至不定芽，其中，诱导培养10d左右可见茎段形成愈伤组织，诱导培养30d左右可见茎段两端膨大，诱导培养60d左右可见茎段不定芽生成，此后茎段呈爆发式生长，而且茎段的褐化率仅为30％，为研究桉树的基因功能和进行转基因育种提供了技术支持。
附图说明
22.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
23.图1为尾巨桉dh3229的茎段在实施例2所述的桉树分化培养基上培养50d的结果；
24.图2为尾巨桉dh3229的茎段在实施例1所述的桉树分化培养基上培养50d的结果；
25.图3为尾叶桉ldud26的茎段在实施例3所述的桉树分化培养基上培养50d的结果；
26.图4为尾叶桉zquc14的茎段在实施例3所述的桉树分化培养基上培养50d的结果；
27.图5为尾叶桉zquc14的叶片在实施例3所述的桉树分化培养基上培养50d的结果。
具体实施方式
28.本发明提供了一种桉树分化培养基，所述桉树分化培养基以ms培养基为基础培养基，还包括以下浓度的组分：6-苄基氨基嘌呤0.5～2mg/l、激动素1～3mg/l、萘乙酸0.02～0.05mg/l和蔗糖15～30g/l。
29.在本发明中，所述桉树分化培养基的适用植物优选包括尾巨桉dh3229、尾叶桉ldud26或尾叶桉zquc14。
30.如无特殊说明，本发明对所述桉树分化培养基的各组分来源没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的市售商品即可。
31.本发明所述桉树分化培养基的基础培养基为ms培养基；所述ms培养基优选为ms固体培养基。
32.本发明所述桉树分化培养基以ms培养基为基础培养基，还包括6-苄基氨基嘌呤
(即6-ba)0.5～2mg/l，优选为0.5～1.5mg/l，更优选为1mg/l。
33.本发明所述桉树分化培养基以ms培养基为基础培养基，还包括激动素(即kt)1～3mg/l。在本发明中，所述激动素的浓度优选根据待培养的桉树品种而确定，包括：当所述待培养的桉树品种为尾巨桉dh3229时，所述桉树分化培养基中激动素的浓度优选为1～3mg/l，进一步优选为1或1.5mg/l，更优选为1mg/l；当所述待培养的桉树品种为尾叶桉ldud26或尾叶桉zquc14时，所述桉树分化培养基中激动素的浓度优选为2mg/l。本发明所述尾叶桉ldud26或尾叶桉zquc14保藏于广东省林业科学研究院组培室内，公开于文献【yang h,xu f,liao h,et al.transcriptome and metabolite analysis related to branch development in two genotypes of eucalyptus urophylla[j].molecular genetics and genomics,2021,296(5):1071-1083.】。
[0034]
本发明根据待培养的桉树品种，确定了最适的kt浓度，诱导培养得到的不定芽最多，且生长状态最好。
[0035]
本发明所述桉树分化培养基以ms培养基为基础培养基，还包括萘乙酸0.02～0.05mg/l，优选为0.03～0.05mg/l，更优选为0.05mg/l。
[0036]
本发明所述桉树分化培养基以ms培养基为基础培养基，还包括蔗糖15～30g/l，优选为15～25g/l，更优选为20g/l。
[0037]
在本发明中，所述桉树分化培养基的ph值优选为5.6～6.0，更优选为5.8。
[0038]
在本发明中，当所述待培养的桉树品种为尾巨桉dh3229时，所述桉树分化培养基以ms培养基为基础培养基，优选还仅含有以下浓度的组分：6-苄基氨基嘌呤0.5～2mg/l、激动素1～3mg/l、萘乙酸0.02～0.05mg/l和蔗糖15～30g/l；更优选还仅含有以下浓度的组分：6-苄基氨基嘌呤1mg/l、激动素1mg/l、萘乙酸0.05mg/l和蔗糖20g/l。
[0039]
在本发明中，当所述待培养的桉树品种为尾叶桉ldud26或尾叶桉zquc14时，所述桉树分化培养基以ms培养基为基础培养基，优选还仅含有以下浓度的组分：6-苄基氨基嘌呤1mg/l、激动素2mg/l、萘乙酸0.05mg/l和蔗糖20g/l。
[0040]
本发明通过在ms培养基中添加适宜浓度的6-苄基氨基嘌呤、激动素和萘乙酸，配制得到的桉树分化培养基可以有效诱导尾巨桉dh3229、尾叶桉ldud26和尾叶桉zquc14的不定芽生成，且从外植体到不定芽生成过程中，无需改变培养基配方，采用本发明提供的桉树分化培养基可以直接将外植体诱导分化至不定芽，且得到的不定芽最多，且生长状态最好。
[0041]
本发明还提供了上述技术方案所述的桉树分化培养基在桉树组织培养中的应用。
[0042]
在本发明中，所述应用优选包括诱导愈伤组织生成和/或诱导芽生成；所述桉树包括优选包括尾巨桉dh3229、尾叶桉ldud26或尾叶桉zquc14。
[0043]
本发明还提供了一种桉树的组织培养方法，包括以下步骤：
[0044]
将外植体接种到桉树分化培养基上，进行诱导培养，得到不定芽；
[0045]
所述外植体包括桉树苗的茎段；所述桉树分化培养基包括上述技术方案所述的桉树分化培养基。
[0046]
本发明将外植体接种到桉树分化培养基上，进行诱导培养，得到不定芽。本发明所述外植体包括桉树苗的茎段；所述桉树苗优选包括无菌苗；所述茎段优选包括含有腋芽的茎段；所述茎段的长度优选为0.3～0.7cm，进一步优选为0.4～0.6cm。本发明选择茎段作为外植体可以提高不定芽的诱导成功率，选择适宜长度的茎段可以降低褐化率。
[0047]
在本发明中，所述诱导培养的方法优选包括：先暗培养3～6d后再进行光照培养；所述暗培养的天数优选为3～6d，进一步优选为4～5d，更优选为4d；所述光照培养的温度优选为25℃；所述光照培养的光照强度优选为1000～1500lux，进一步优选为1200～1400lux，更优选为1300lux；所述光照培养的每天的光暗时间比优选为16h：8h。
[0048]
在本发明中，在进行诱导培养时，当所述外植体出现失绿现象时，优选更换为新配置的上述技术方案所述桉树分化培养基；所述更换的频率优选为每3～4周更换一次，更优选为3周。
[0049]
得到不定芽后，本发明优选将所述不定芽转入生根培养基上，进行生根培养，得到完整的植株；所述生根培养基优选以1/2ms培养基为基础培养基，优选还包括吲哚乙酸0.1～0.2mg/l和琼脂6g/l，更优选为吲哚乙酸0.2mg/l和琼脂6g/l；所述生根培养基的ph值优选为5.6～6.0，更优选为5.8。
[0050]
在本发明中，所述生根培养的温度优选为25℃；所述生根培养的光照强度优选为1000～1500lux，进一步优选为1200～1400lux，更优选为1300lux；所述生根培养的每天的光暗时间比优选为16h：8h。
[0051]
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种桉树分化培养基及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0052]
实施例1
[0053]
一种桉树分化培养基(记为t2)，以ms固体培养基为基础培养基，还仅含有以下浓度的组分：6-苄基氨基嘌呤1mg/l、激动素1mg/l、萘乙酸0.05mg/l和蔗糖20g/l；所述桉树分化培养基的ph值为5.8。
[0054]
实施例2
[0055]
一种桉树分化培养基(记为t3)，以ms固体培养基为基础培养基，还仅含有以下浓度的组分：6-苄基氨基嘌呤1mg/l、激动素1.5mg/l、萘乙酸0.05mg/l和蔗糖20g/l；所述桉树分化培养基的ph值为5.8。
[0056]
实施例3
[0057]
一种桉树分化培养基(记为t4)，以ms固体培养基为基础培养基，还仅含有以下浓度的组分：6-苄基氨基嘌呤1mg/l、激动素2mg/l、萘乙酸0.05mg/l和蔗糖20g/l；所述桉树分化培养基的ph值为5.8。
[0058]
对比例1
[0059]
一种桉树分化培养基(记为t5)，以ms培养基为基础培养基，还仅含有以下浓度的组分：6-苄基氨基嘌呤2mg/l、激动素1mg/l、萘乙酸0.05mg/l和蔗糖20g/l；所述桉树分化培养基的ph值为5.8。
[0060]
对比例2
[0061]
一种桉树分化培养基(记为t6)，以ms固体培养基为基础培养基，还仅含有以下浓度的组分：6-苄基氨基嘌呤2mg/l、激动素1.5mg/l、萘乙酸0.05mg/l和蔗糖20g/l；所述桉树分化培养基的ph值为5.8。
[0062]
对比例3
[0063]
一种桉树分化培养基(记为t7)，以ms固体培养基为基础培养基，还仅含有以下浓度的组分：6-苄基氨基嘌呤2mg/l、激动素2mg/l、萘乙酸0.05mg/l和蔗糖20g/l；所述桉树分
化培养基的ph值为5.8。
[0064]
对比例4
[0065]
一种桉树分化培养基(记为t8)，以ms固体培养基为基础培养基，还仅含有以下浓度的组分：6-苄基氨基嘌呤3mg/l、激动素1mg/l、萘乙酸0.05mg/l和蔗糖20g/l；所述桉树分化培养基的ph值为5.8。
[0066]
对比例5
[0067]
一种桉树分化培养基(记为t9)，以ms固体培养基为基础培养基，还仅含有以下浓度的组分：6-苄基氨基嘌呤3mg/l、激动素1.5mg/l、萘乙酸0.05mg/l和蔗糖20g/l；所述桉树分化培养基的ph值为5.8。
[0068]
对比例6
[0069]
一种桉树分化培养基(记为t10)，以ms固体培养基为基础培养基，还仅含有以下浓度的组分：6-苄基氨基嘌呤3mg/l、激动素2mg/l、萘乙酸0.05mg/l和蔗糖20g/l；所述桉树分化培养基的ph值为5.8。
[0070]
对比例7
[0071]
一种桉树分化培养基(记为t1)，为ms固体培养基，所述ms固体培养基的ph值为5.8。
[0072]
对比应用例1
[0073]
分别以尾巨桉dh3229，尾叶桉纯种ldud26和尾叶桉纯种zquc14三种组培增殖无性系为材料；所述尾叶桉纯种ldud26和尾叶桉纯种zquc14公开于文献【yang h,xu f,liao h,et al.transcriptome andmetabolite analysis related to branch development in two genotypes of eucalyptus urophylla[j].molecular genetics and genomics,2021,296(5):1071-1083.】；所述材料的培养方法为：选择保存在省林科院种质资源圃的尾叶桉种质生长健壮、无病害的茎段组织通过升汞、酒精消毒，无菌纯水清洗后接种至启动培养基上，在温度为25℃，光照强度1300lux条件下培养15d后选择无菌、绿色的茎段组织放置于增殖培养基，每月分株增殖，增殖培养的条件为温度为25℃，光照强度1300lux；所述启动培养基的配方为：以ms培养基为基础培养基，还仅含有6-ba 0.5mg/l和iba 0.2mg/l；所述启动培养基的ph值为5.8；所述增殖培养基的配方为以ms培养基为基础培养基，还仅含有6-ba 0.01mg/l和naa 0.01mg/l；所述增殖培养基的ph值为5.8；
[0074]
三种材料均进行如下实验：
[0075]
将所述材料转移至iba生根培养基上，每瓶接种5株无菌苗，保证充足的养分；所述iba生根培养基以1/2ms培养基为基础培养基，还仅含有吲哚乙酸0.2mg/l和琼脂6g/l；
[0076]
待无菌苗茎秆粗壮(即茎秆直径在0.2cm以上时)、叶片肥大(即叶片宽0.4cm以上，长度1.5cm以上)时剪下；分别将茎段和叶片进行处理，处理方法如下：茎段剪成0.4～0.6cm的带腋芽的小段，叶片剪掉叶柄，在中间划开叶柄1～2刀；
[0077]
将处理后的茎段和叶片分别转移实施例1～3(即t2～t4)和对比例1～7(即t5～t10和t1)所述的桉树分化培养基上，先暗培养4～6d，再转移至一般培养条件下，所述一般培养条件为：温度为25℃，光照强度1300lux，每天光暗时间比为16h：8h；当处理后的茎段和叶片失绿后，立即更换新配制的桉树分化培养基，具体为每隔3周更换新的桉树分化培养基，观察和统计在桉树分化培养基上培养50d的茎段和叶片的诱导情况和褐化率，结果见图
1～5和表1～3。
[0078]
表1尾巨桉dh3229在不同桉树分化培养基上的褐化率(％)
[0079][0080][0081]
表2尾叶桉纯种ldud26在不同桉树分化培养基上的褐化率(％)
[0082]
组别t2t3t4t5t6t7t8t9t10t1总处理茎段个数(个)78129101010999褐化茎段个数(个)28666510939茎段褐化率(％)291005066605010010033100总处理叶片个数(个)101112710111081310褐化叶片个数(个)101112710111081310叶片褐化率(％)100100100100100100100100100100
[0083]
表3尾叶桉纯种zquc14在不同桉树分化培养基上的褐化率(％)
[0084]
组别t2t3t4t5t6t7t8t9t10t1总处理茎段个数(个)1091210106127812褐化茎段个数(个)109451067786茎段褐化率(％)10010033501001005810010050总处理叶片个数(个)71110810111310119褐化叶片个数(个)71110810111310119叶片褐化率(％)100100100100100100100100100100
[0085]
统计结果为：8～12d可见茎段与叶片形成愈伤组织，30d左右可见茎段两端膨大，60d左右可见茎段芽生，此后茎段呈爆发式生长。各个无性系之间最适培养基稍有差异。无性系dh3229较适配方为t2培养基，该培养基芽每个茎段平均产芽6个，其次为t3配方。无性系ldud26的较适配方为t4培养基。无性系zquc14较适配方为t4培养基，在此配方下，诱导芽的生长状态最好，数量最多。各个无性系叶片未成功诱导出芽。
[0086]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

技术特征：
1.一种桉树分化培养基，其特征在于，所述桉树分化培养基以ms培养基为基础培养基，还包括以下浓度的组分：6-苄基氨基嘌呤0.5～2mg/l、激动素1～3mg/l、萘乙酸0.02～0.05mg/l和蔗糖15～30g/l。2.根据权利要求1所述的桉树分化培养基，其特征在于，所述桉树分化培养基的适用植物包括尾巨桉dh3229、尾叶桉ldud26或尾叶桉zquc14；所述桉树分化培养基的适用植物为尾巨桉dh3229时，所述桉树分化培养基中激动素的浓度为1～1.5mg/l；所述桉树分化培养基的适用植物为尾叶桉ldud26或尾叶桉zquc14时，所述桉树分化培养基中激动素的浓度为2mg/l。3.权利要求1或2所述的桉树分化培养基在桉树组织培养中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用包括诱导愈伤组织生成和/或诱导芽生成。5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述桉树包括尾巨桉dh3229、尾叶桉ldud26或尾叶桉zquc14。6.一种桉树的组织培养方法，其特征在于，包括以下步骤：将外植体接种到桉树分化培养基上，进行诱导培养，得到不定芽；所述外植体包括桉树苗的茎段；所述桉树分化培养基包括权利要求1或2所述的桉树分化培养基。7.根据权利要求6所述的组织培养方法，其特征在于，所述茎段的长度为0.3～0.7cm。8.根据权利要求6或7所述的组织培养方法，其特征在于，所述诱导培养的方法包括：先暗培养3～6d后再进行光照培养；所述光照培养的条件包括：温度为25℃，光照强度为1000～1500lux，每天的光暗时间比为16h：8h。9.根据权利要求8所述的组织培养方法，其特征在于，所述诱导培养的方法还包括：当所述外植体出现失绿现象时，更换所述桉树分化培养基。10.根据权利要求6所述的组织培养方法，其特征在于，所述组织培养方法还包括：将所述不定芽转入生根培养基上，进行生根培养，得到完整的植株；所述生根培养基以1/2ms培养基为基础培养基，还包括吲哚乙酸0.1～0.2mg/l和琼脂5～7g/l。

技术总结
本发明涉及植物组织培养技术领域，特别是涉及一种桉树分化培养基及其应用。本发明通过在MS培养基中添加适宜浓度的6-苄基氨基嘌呤、激动素和萘乙酸，配制得到的桉树分化培养基可以有效诱导尾巨桉DH3229、尾叶桉LDUD26和尾叶桉ZQUC14的不定芽生成，且从外植体到不定芽生成过程中，无需改变培养基配方，采用本发明提供的桉树分化培养基可以直接将外植体诱导分化至不定芽，其中，诱导培养8～12d可见茎段形成愈伤组织，诱导培养35～35d可见茎段两端膨大，诱导培养50～60d左右可见茎段不定芽生成，此后茎段呈爆发式生长，而且茎段的褐化率仅为25％，为研究桉树的基因功能和进行转基因育种提供了技术支持。提供了技术支持。提供了技术支持。


技术研发人员：杨晓慧 潘文 廖焕琴 杨会肖 张卫华 徐放
受保护的技术使用者：广东省林业科学研究院
技术研发日：2023.05.12
技术公布日：2023/7/26