一种防治猕猴桃夏季溃疡病的微生物菌剂及其应用

1.本发明属于农业微生物领域，具体涉及一种防治猕猴桃夏季溃疡病的微生物菌剂及其应用。


背景技术：

2.猕猴桃(actinidia chinensis)，又称为奇异果，属于猕猴桃科(actinidiaceae)猕猴桃属(actinidia lindl.)，是一种多年生藤本植物，原产于我国长江上游山地，由于其有丰富的vc含量，营养价值高，而具有“水果之王”的美称。中国在20世纪70年代末首次进行猕猴桃的人工种植，这么多年来，中国种植猕猴桃面积已经达到11万hm2，主要产区位于陕西、四川、湖北、湖南等。猕猴桃溃疡病是猕猴桃上最严重的的病害之一，该病害给全世界的猕猴桃果园带来了毁灭性的伤害，造成了严重的经济损失。猕猴桃溃疡病具有强传染性、发病快、危害严重等特点，这种病害的病原菌主要为丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(pseudomonas syringae pv.actinidiae)。而近几年，出现了一种由胡萝卜软腐果胶杆菌猕猴桃亚种(pectobacterium actinidiae，p.actinidiae)导致的猕猴桃溃疡病，称其为猕猴桃夏季溃疡病，其发病症状与丁香假单胞菌猕猴桃致病变种引起的溃疡病十分相似，该病害首次于2006年在韩国被发现，随后，在中国江西、四川和浙江都有报道。目前对于由丁香假单胞菌猕猴桃致病变种导致的猕猴桃溃疡病的防治还是遵循“预防为主，综合防治”的策略方针，运用抗病品种的选育、农业防治、化学防治和生物防治来综合防治该病害。而对于由p.actinidiae导致的溃疡病目前还没有相关防治方法的报道。
3.由于化学防治存在着污染环境以及产生抗药性等缺点而抗病品种选育困难等原因，国内外越来越多的人将目光转到生物防治上来，目前最好的生防措施还是筛选对猕猴桃溃疡病具有拮抗作用的生防菌株。例如郭睿文在四川和湖南的猕猴桃果园的健康植株与病株上采集样品，从这些恶样品上分离菌株，经过鉴定以及抗菌实验后发现六株有效的生防菌株，其中3株是假单孢菌属(pseudomonas sp.)，另外3株是梭形芽孢杆菌属(lysinibacillus sp.)。另外还有很多学者筛选到溃疡病有着很好防效的内生真菌，如燕金宜等筛选得到一株黑孢菌属(nigrospora sp.)的内生菌株，命名为j2，具有良好的防治猕猴桃溃疡病的效果。在放线菌防治猕猴桃溃疡病方面，链霉菌属的菌株往往具有良好的防效。田雪莲等在猕猴桃植株根际土中分离得到288株放线菌，首先初筛出了16株具有良好防效的放线菌，再通过抑菌圈法进行复筛，得到一株放线菌具有很强的拮抗作用，命名为na-txl-1，该菌株在盆栽实验中也表现出了很好的防效。
4.目前，我国对于猕猴桃溃疡病的生物防治还处在初步探索阶段，可以运用在实际生产中的生物源菌剂还比较稀缺。生物源菌剂安全无害、能长期控制病原菌的生长，而且拥有对环境友好、无农药残留、不会产生抗药性等诸多优点，具有良好的发展前景，越来越受到大家的欢迎。在防治猕猴挑溃疡病的工作中，要做到将生物防治与其他防治措施合理的混合使用，取长避短，既符合现今“预防为主，综合治理”的植保方针，也解决实际生产中遇到的难题，这才是现代农业绿色植物保护的发展方向。


技术实现要素：

5.针对现有技术中没有对由p.actinidiae导致的猕猴桃溃疡病有较高防效的微生物菌剂这一现状，本发明的目的是提供一种防治由p.actinidiae导致的猕猴桃溃疡病的微生物菌剂及其应用。本发明从猕猴桃叶片中分离得到一株对p.actinidiae有拮抗作用的生防菌(paenibacillus alvei)yp143，将这种生防菌制备成微生物菌剂作用于猕猴桃溃疡病的防治，有望防止或减轻病原菌侵染造成的猕猴桃病害影响。因此，这种微生物菌剂具有可观的生产应用前景。
6.本发明的目的可通过如下技术方案实现：
7.第一方面，本发明请求保护一种蜂房类芽孢杆菌(paenibacillus alvei)yp143，2022年10月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为cgmccno.25893，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
8.第二方面，本发明还保护前文所述的蜂房类芽孢杆菌yp143在防治猕猴桃溃疡病或制备防治猕猴桃溃疡病的微生物菌剂中的应用。
9.在具体的实施方案中，所述猕猴桃溃疡病为猕猴桃夏季溃疡病。
10.第三方面，本发明还保护一种微生物菌剂，所述菌剂含有前文所述的蜂房类芽孢杆菌yp143或含有前文所述的蜂房类芽孢杆菌yp143的培养物。
11.术语“培养物”是指经人工接种和培养后，长有微生物群体的液体或固体产物的统称。即通过将微生物进行生长和/或扩增二获得的产物，其可以是微生物的生物学纯培养物，也可以含有一定量的培养基、代谢物或培养过程中产生的其他成分。
12.作为一种优选技术方案，该微生物菌剂中的活菌总浓度不低于1
×
107cfu/ml。
13.第四方面，本发明还保护前文所述的微生物菌剂在防治猕猴桃溃疡病中的应用。
14.在具体的实施方案中，所述猕猴桃溃疡病为猕猴桃夏季溃疡病。
15.第五方面，本发明还保护一种防治猕猴桃溃疡病的微生物菌剂的制备方法，包括如下具体步骤：将上述蜂房类芽孢杆菌yp143的种子菌液以1:500的体积比接种至lb发酵培养基中发酵培养，28
±
1℃，200～220rpm振荡培养12
±
3h，然后4000～6000rpm离心25～30min，取沉淀用灭菌水重悬使得制成菌悬液在600nm处的od值范围为0.2
±
0.05，成品微生物菌剂中活菌总浓度为1
×
107～1
×
108cfu/ml。
16.在具体的实施方案中，所述lb发酵培养基主要组分如下：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠5g，水1000ml，naoh溶液调节其ph至7.0-7.2，121℃灭菌20min备用。
17.在具体的实施方案中，所述蜂房类芽孢杆菌yp143的种子菌液的制备方法为：将保藏号为cgmcc no.25893的蜂房类芽孢杆菌yp143菌株接种到lb发酵培养基中28
±
1℃，200～220rpm振荡培养至600nm处的od值为0.8时结束培养。
18.当然，所述的防治猕猴桃夏季溃疡病的蜂房类芽孢杆菌yp143微生物菌剂的制备并不限于以上方法。凡是能够大量培养yp143，且保持其生防活性的方法均可用于制备本发明请求保护的微生物菌剂。
19.第六方面，本发明还保护一种防治猕猴桃溃疡病尤其猕猴桃夏季溃疡病的方法，用前文所述的蜂房类芽孢杆菌yp143，或前文所述的微生物菌剂，对猕猴桃苗进行处理。
20.在具体的实施方案中，可将蜂房类芽孢杆菌yp143制成菌剂，或利用前文所述的微生物菌剂，直接对猕猴桃苗进行喷雾处理。
21.更具体的，以猕猴桃树为例，将所述的微生物菌剂在温室环境下对猕猴桃树进行喷雾处理，每隔5d喷施一次，共喷施3次后接种病原菌，发病时开始统计病情。类芽孢杆菌yp143微生物菌剂对猕猴桃夏季溃疡病的防效为64.64％。
22.本发明的有益效果：
23.温室实验结果表明，本发明的蜂房类芽孢杆菌yp143(cgmcc no.25893)制成的微生物菌剂能显著降低猕猴桃夏季溃疡病的发生。利用蜂房类芽孢杆菌yp143微生物菌剂进行喷雾处理，对猕猴桃夏季溃疡病的防效为64.64％。
24.本发明专门针对猕猴桃夏季溃疡病，筛选了菌株并开发了微生物菌剂。由于是生物菌剂，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，不易产生抗性；对环境安全，无公害，无残留；专一性强，活性高，生产成本低，制备工艺简单。因而有利于猕猴桃的无公害生产，农民可以不用或减少其他化学农药的用量，这不仅可为农民节省开支，而且减少化学药剂的残留。
25.生物样品保藏信息
26.一株蜂房类芽孢杆菌yp143，分类命名为p.alvei，于2022年10月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为cgmcc no.25893。
具体实施方式
27.以下结合实施例对本发明做进一步详细说明。所用试剂或者仪器设备未注明生产厂商的，均视为可以通过市场购买的常规产品。
28.lb发酵培养基组分如下：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠5g，水1000ml，naoh溶液调节其ph至7.0-7.2，121℃灭菌20min备用。
29.实施例1蜂房类芽孢杆菌yp143的筛选
30.蜂房类芽孢杆菌yp143(cgmcc no.25893)菌株广西壮族自治区桂林市资源县中峰村果园采集的猕猴桃根中分离得到。取猕猴桃根3g，切成1cm小段，放在含1％次氯酸钠的平板中浸泡5min，然后到70％酒精的平板中浸泡1-2min，最后再使用无菌水清洗3次。取消好毒的样品于灭过菌的研钵中，加入27ml无菌的0.85％ nacl进行研磨，将研磨液通过4层的灭菌纱布过滤，再用无菌的0.85％ nacl对滤液进行梯度稀释。取稀释了10倍的稀释液0.1ml涂于lb平板上，28℃下培养48h，挑取单菌落进行纯培养，经反复转接得到纯化菌株。将纯化后的菌株用50％甘油保存于-80℃超低温冰箱中。
31.鉴定方法：通过形态特征，生理生化实验和16s rdna序列分析对该菌株进行鉴定。
32.形态学特征：革兰氏阳性菌，杆状，产芽孢，菌落为圆形，乳白色，有光泽，表面光滑。
33.16s rrna基因扩增和序列分析：蜂房类芽孢杆菌yp143在lb培养基中28℃培养至对数期，以12000r/min离心10min收集菌体，按细菌dna提取试剂盒(vazyme，中国)操作说明提取菌株yp143的dna，以提取的dna产物为模板，通过27f和1492r引物进行扩增。引物序列：
34.27f：agagtttgatcctggctcag；
35.1492r：ggttaccttgttacgactt。
36.基因组dna中扩增出16s rdna基因片段。pcr产物送上海美吉生物医药科技有限公
司进行测序。测序结果如下：
37.ccacaggccggcggcctaatacatgcaagtcgagcggacttgatggagtgcttgcactcctgatggttagcggcggacgggtgagtaacacgtaggtaacctgcccataagactgggataacccacggaaacgtgagctaataccagataggcattttcctcgcatgagggagatgagaaaggcggagcaatctgccacttatggatggacctgcggcgcattagctagttggtaaggtaacggcttaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgccagggaagaacgcctaggagagtaactgctcttagggtgacggtacctgagaagaaagccccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggggcgagcgttgtccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggcggcaatgtaagttgggtgtttaaacctagggctcaaccttgggtcgcatccaaaactgcatagcttgagtacagaagaggaaagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactttctgggctgtaactgacgctgaggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgaatgctaggtgttaggggtttcgatacccttggtgccgaagttaacacattaagcattccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacggggacccgcacaagcagtggagtatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacattctgaatgaccgtcctagagatagggctttc，如seq id no：1所示。
38.通过blast软件对测定16s rrna基因序列进行同源性比较，结果见表1，菌株yp143与genbank中报导的蜂房类芽孢杆菌p.alvei(mw876134)的亲缘关系最近，同源性为97.21％，因此，将该菌株鉴定为蜂房类芽孢杆菌(paenibacillus alvei)。
39.表1yp143测序结果比对
40.上述蜂房类芽孢杆菌yp143，分类命名为paenibacillus alvei，于2022年10月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为cgmcc no.25893。
41.实施例2微生物菌剂的制备
42.本实施例提供了两个菌剂的制备方法，分别如下：
43.方法1：
44.将蜂房类芽孢杆菌yp143(cgmcc no.25893)菌株接种到lb培养液中28℃，200rpm振荡培养12h后，每隔2h在超净工作台中取样测其在600nm处的od值，当od值为0.8时结束培养，此菌液作为种子菌液。把种子菌液以1:500体积比接种至lb发酵培养液中发酵培养，28℃，210rpm培养12h，然后4000rpm离心30min，取沉淀用灭菌水进行稀释使得制成菌悬液在600nm处的od值为0.2，即得微生物菌剂，成品微生物菌剂中活菌总浓度为1
×
107～1
×
108cfu/ml。
45.方法2：
46.将蜂房类芽孢杆菌yp143(cgmcc no.25893)菌株接种到lb培养液中28℃，220rpm振荡培养10h后，每隔2h在超净工作台中取样测其在600nm处的od值，当od值为0.8时结束培养，此菌液作为种子菌液。把种子菌液以1:500体积比接种至lb发酵培养液中发酵培养，28℃，200rpm培养13h，然后6000rpm离心20min，取沉淀用灭菌水进行稀释使得制成菌悬液在
600nm处的od值范围为0.2，即得微生物菌剂，成品微生物菌剂中活菌总浓度为1
×
107～1
×
108cfu/ml。
47.实施例3蜂房类芽孢杆菌yp143对猕猴桃夏季溃疡病病原菌的平板拮抗
48.将分离到的蜂房类芽孢杆菌yp143(cgmcc no.25893)菌株接种到lb培养液中28℃，220rpm振荡培养12h，以分离到的病原菌株为靶标菌，采用滤纸片法测定其抑菌活性。将预先灭过菌的滤纸片(d＝5mm)放置于均匀涂布有p.actinidiae病原菌的lb平板中，28℃培养48h后，测定抑菌圈直径大小为21.67
±
2.5mm。
49.实施例4离体试验微生物菌剂对猕猴桃夏季溃疡病的防效
50.从猕猴桃植株中截取枝龄相似、粗细相近的约10cm长的健康枝条，枝条两端用沾水的棉花保湿，处理后的枝条放入加了两层湿纸巾的托盘中，放在温度为26-28℃，相对湿度90％的人工气候箱中。设置4个处理：a.健康枝条；b.健康枝条+蜂房类芽孢杆菌yp143微生物菌剂；c.健康枝条+病原菌(p.actinidiae)；d.健康枝条+蜂房类芽孢杆菌yp143微生物菌剂+病原菌(p.actinidiae)。接种方式为打孔接种，b、c、d处理为打孔接种，蜂房类芽孢杆菌yp143微生物菌剂中有效yp143浓度为1
×
107cfu/ml，使用棉花进行保湿，24h后在枝条接种浓度为1
×
107cfu/ml的病原菌(p.actinidiae)菌悬液。每天观察发病情况并记录，待病症明显后通过测定离体枝条病斑长度计算防治效果，防治效果＝(对照病斑长度-处理病斑长度)/对照病斑长度*100％。
51.在微生物制菌处理14d后，对照组和实验组的发病情况见表2。
52.表2蜂房类芽孢杆菌yp143微生物菌剂的离体枝条生防效果
53.结果显示yp143微生物菌剂在离体枝条上对猕猴桃夏季溃疡病有较好的生物防治效果。用yp143微生物菌剂处理的离体枝条后，溃疡病病情指数为32.50，相对于对照组的82.22，生防效率达60.47％。
54.实施例5温室试验微生物菌剂对猕猴桃夏季溃疡病的防效
55.实验：温室试验微生物菌剂对猕猴桃夏季溃疡病的防效(2020.2-2020.10)
56.地点：广西特色作物研究院
57.试验用广西特色作物研究院培育的一年生猕猴桃盆栽，品种为红阳，设各生防菌株发酵液和清水对照共14个处理，每个处理重复3次。采用喷雾处理的方法，喷施蜂房类芽孢杆菌yp143微生物菌剂(1
×
107cfu/ml)，每隔5d喷施一次。共喷施3次后，在第7d采用针刺法接种病原菌菌株(1
×
107cfu/ml)，每个处理接种60个部位，接菌之后注意保湿48h，之后进入常规化管理。在接种7d后测量病斑的直径，并计算发病率和防治效果。
58.表3病害分级标准
[0059][0060]
病情指数＝[σ(病级枝条数
×
代表级植)/(最高病级
×
调查总枝条数)]
×
100％；
[0061]
生防效果(％)＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]
×
100％。
[0062]
注：计算不同处理的病情指数及防效并利用ibm spss statistics 23数据分析软件进行差异显著性分析及多重比较。
[0063]
在微生物制菌处理21d后，对照组和实验组的发病情况见表3。
[0064]
表4微生物菌剂对猕猴桃夏季溃疡病的生防效果
[0065][0066]
结果显示yp143微生物菌剂在温室条件下对猕猴桃夏季溃疡病有较好的生物防治效果。用yp143微生物菌剂剂处理的猕猴桃树苗，溃疡病病情指数为20.09，相对于对照组的56.82，生防效率达64.64％。
[0067]
综上所述，本发明采用的微生物菌剂效果较好，能够有效防治猕猴桃夏季溃疡病，市场应用前景广阔。
[0068]
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。

技术特征：
1.一种蜂房类芽孢杆菌(paenibacillus alvei)yp143，2022年10月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为cgmcc no.25893，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。2.权利要求1所述的蜂房类芽孢杆菌yp143在防治猕猴桃溃疡病中的应用，优选的，所述猕猴桃溃疡病为猕猴桃夏季溃疡病。3.权利要求1所述的蜂房类芽孢杆菌yp143在制备用于防治猕猴桃溃疡病的微生物菌剂中的应用，优选的，所述猕猴桃溃疡病为猕猴桃夏季溃疡病。4.一种微生物菌剂，其特征在于，该微生物菌剂中包含权利要求1所述的蜂房类芽孢杆菌yp143或含有权利要求1所述的蜂房类芽孢杆菌yp143的培养物，优选的，该微生物菌剂中的活菌总浓度不低于1
×
107cfu/ml。5.权利要求4所述的微生物菌剂在防治猕猴桃溃疡病中的应用，优选的，所述猕猴桃溃疡病为猕猴桃夏季溃疡病。6.一种防治猕猴桃溃疡病的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下具体步骤：将权利要求1所述的蜂房类芽孢杆菌yp143的种子菌液以1:500的体积比接种至lb发酵培养基中发酵培养，28
±
1℃，200～220rpm振荡培养12
±
3h，然后4000～6000rpm离心25～30min，取沉淀用灭菌水重悬使得制成菌悬液在600nm处的od值范围为0.2
±
0.05，成品微生物菌剂中活菌总浓度为1
×
107～1
×
108cfu/ml。7.根据权利要求6所述的用于防治猕猴桃溃疡病的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述lb发酵培养基主要组分如下：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠5g，水1000ml，naoh溶液调节其ph至7.0-7.2，121℃灭菌20min备用。8.根据权利要求6或7所述的用于防治猕猴桃溃疡病的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述蜂房类芽孢杆菌yp143的种子菌液的制备方法为：将蜂房类芽孢杆菌yp143菌株接种到lb发酵培养基中28
±
1℃，200～220rpm振荡培养至600nm处的od值为0.8时结束培养。9.权利要求6-8任一所述的制备方法制备得到的微生物菌剂。10.一种防治猕猴桃溃疡病的方法，其特征在于，用权利要求1所述的蜂房类芽孢杆菌yp143，或权利要求4所述的微生物菌剂，或权利要求9所述的微生物菌剂，对猕猴桃苗进行处理；优选的，所述猕猴桃溃疡病为猕猴桃夏季溃疡病；优选的，所述微生物菌剂使用时，对猕猴桃苗进行喷雾处理。

技术总结
本发明公开了一种防治猕猴桃夏季溃疡病的微生物菌剂及其应用，该微生物菌剂用菌为蜂房类芽孢杆菌(Paenibacillus alvei)YP143，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2022年10月12日，保藏编号为CGMCC No.25893。用蜂房类芽孢杆菌YP143制成的微生物菌剂，对防治由Pectobacterium actinidiae引起的猕猴桃夏季溃疡病有较好效果，防效达到64.64％。防效达到64.64％。


技术研发人员：刘红霞 袁志香 赵迎 章丽丹
受保护的技术使用者：南京农业大学
技术研发日：2023.05.29
技术公布日：2023/7/27