一种甘薯U6启动子、表达盒、重组表达载体及其应用的制作方法

一种甘薯u6启动子、表达盒、重组表达载体及其应用
技术领域
1.本发明属于生物技术和基因工程领域，具体涉及一种甘薯u6启动子、表达盒、重组表达载体及其应用。


背景技术：

2.基因编辑是现代生物学发展历史上的一项革命性的技术，它已经广泛地运用到医学、动物、植物、昆虫、微生物等多个领域(adiego-p
é
rez et al.,2019；mills et al.,2020；tanihara et al.,2021)。基因编辑技术的发展经历了锌指核酸酶(zfns)、转录激活样效应因子核酸酶(talen)和成簇规律间隔短回文重复(crispr/cas9)系统3个阶段。目前，crispr/cas9系统由于其高效、便捷、易操作等优点，已经成为进行基因功能研究与种质遗传改良的主要工具，并运用于作物的各个品质性状的改良(jiang et al.,2017；bandyopadhyay.,2019)。
3.crispr/cas9系统是通过sgrna将cas9蛋白带到靶点对dna进行切割产生特异性双链断裂(double strand break,dbs)，然后通过非同源末端连接或同源重组来修复dsb，从而产生碱基的突变、缺失，进而造成基因突变(pickar-oliver and gersbach,2019)。u6rna是双子叶植物中的一种非编码小rna，它所对应的u6启动子是crispr/cas9系统中的重要元件，已被广泛用来驱动sgrna的转录(cong et al.,2013)。研究表明，u6启动子的转录活性会决定sgrna的表达水平，从而影响基因的编辑效率(wei et al.,2016)。为了提高在不同物种中的基因编辑效率，人们对植物内源的u6启动子开展了相关研究。gao et al(2015)利用自身的内源启动子成功建立了适用于烟草的crispr/cas9系统。在苹果愈伤组织中，卞书讯等(2020)使用内源性u6启动子，可以大大提高sgrna的表达水平。唐志强等(2022)克隆了3个金银花u6启动子，并筛选出一个具有高效转录活性的启动子。
4.目前，u6启动子已在多个植物开展了相关研究，但是还没有关于甘薯内源u6启动子的报道。因此，甘薯内源u6启动子的分离和鉴定对于开展并完善甘薯crispr/cas9基因编辑研究具有重要的意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的之一是提供一种甘薯u6启动子，该启动子可以驱使luc基因在烟草和甘薯中表达。
6.为实现上述目的，本发明提供了一种甘薯u6启动子，所述甘薯u6启动子为ibu6p-1或ibu6p-2，所述启动子ibu6p-1的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述启动子ibu6p-2的核苷酸序列如seq id no.2所示。
7.本发明的目的之二是提供一种表达盒。
8.为实现上述目的，本发明提供了一种表达盒，所述表达盒包含上述甘薯u6启动子ibu6p-1或甘薯u6启动子ibu6p-2。
9.本发明的目的之三是提供一种重组表达载体。
10.为实现上述目的，本发明提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体包含上述甘薯u6启动子ibu6p-1或甘薯u6启动子ibu6p-2。
11.进一步的，所述重组表达载体为将上述甘薯u6启动子ibu6p-1或甘薯u6启动子ibu6p-2插入植物表达载体中，并连接于载体目的基因序列上游得到。
12.优选的，所述植物表达载体为pgreenii 0800，所述目的基因为luc基因；所述重组表达载体为pgreenii 0800::ibu6p-1或pgreenii 0800::ibu6p-2。
13.本发明目的之四是提供上述甘薯u6启动子在调控luc基因表达中的应用。
14.为实现上述目的，本发明提供了上述甘薯u6启动子在调控luc基因表达中的应用，具体包括以下步骤：
15.(1)将上述甘薯u6启动ibu6p-1或甘薯u6启动ibu6p-2启动子插入pgreenii 0800载体中，并连接于luc基因上游，得到重组表达载体pgreenii 0800::ibu6p-1或pgreenii 0800::ibu6p-2；
16.(2)将所得到重组表达载体通过农杆菌介导的方法对烟草叶片和甘薯愈伤组织分别进行瞬时转化和遗传转化，并鉴定甘薯u6启动子的活性；在烟草叶片和甘薯愈伤组织中，甘薯u6启动子ibu6p-1或甘薯u6启动子ibu6p-2驱动重组质粒中的luc基因的表达。
17.与现有技术方案相比，本发明具有以下优点：
18.(1)本发明首次分离了甘薯u6启动子序列，提供的启动子序列可以驱动luc基因在烟草和甘薯中的表达；
19.(2)本发明所提供的seq id no.2所示的核苷酸序列ibu6p-2与拟南芥u6启动子atu6p相比可以更好地驱动luc基因大量表达，是一种能高效表达sgrna的启动子，能较好地应用于甘薯的crispr/cas9基因编辑技术研究中。
附图说明
20.图1为本发明甘薯u6启动子和对照拟南芥u6启动子的pcr扩增电泳图；m，marker；1、ibu6p-1；2、ibu6p-2；3、atu6p；
21.图2为本发明甘薯u6启动子序列比对分析图；箭头为u6rna的转录起始位点；
22.图3为本发明重组表达载体pgreenii 0800::u6p重组载体双酶切电泳图；m，marker；1，ibu6p-1；2，ibu6p-2；3，atu6p；
23.图4为本发明甘薯u6启动子转录活性比较示意图；(a)pgreenii 0800::ibu6p-1、pgreenii 0800::ibu6p-2和pgreenii 0800::atu6p的荧光亮度数值比较统计图；(b)pgreenii 0800::ibu6p-1、pgreenii 0800::ibu6p-2和pgreenii 0800::atu6p在烟草叶片中的荧光成像检测图；
24.图5为本发明在甘薯愈伤组织中驱动luc表达荧光检测图，(a)atu6p、(b)ibu6p-1、(c)ibu6p-2，白色箭头为荧光信号发光点。
具体实施方式
25.以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
26.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
27.实施例1
28.甘薯u6启动子ibu6p-1和ibu6p-2的分离
29.(1)甘薯基因组dna的制备
30.取种植于温室的两个月大的甘薯(徐紫薯8号)嫩叶，采用ctab法提取基因组dna，经分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测后于-20℃保存。
31.(2)甘薯u6启动子的克隆和序列分析
32.根据ncbi中提供的甘薯近缘野生种ipomoea trifida的全基因组序列，设计扩增甘薯u6启动子的引物。引物序列如下：
33.引物1：5
’–
tttattttattttttcggttttga-3’(seq id no.3)
34.引物2：5
’–
attcttgttcttcaatgg-3’(seq id no.4)
35.引物3：5
’–
agaatgcgtggcctttagta-3’(seq id no.5)
36.引物4：5
’–
agcatgttcttccatg-3’(seq id no.6)
37.以步骤1中准备好的dna为模板，用正向引物1和反向引物2扩增ibu6p-1启动子片段，用正向引物3和反向引物4扩增ibu6p-2启动子片段。
38.pcr反应体系如下：1
×
primestar buffer(mg
2+
plus)，0.2mm dntps，1.0u primestar max dna聚合酶(三者均购自大连takara公司)，100ng cdna，正、反向引物各0.45um，ddh2o补充至终体积50ul。热循环参数为：98℃ 1min；98℃ 20sec，55℃ 20sec，72℃ 90sec，35个循环；72℃ 5min，1个循环；4℃保存，反应是在ptc-225pcr仪上完成。扩增产物在水平电泳槽上1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，见图1。
39.将pcr产物连接到peast-t blunt载体(北京，全式金)上，进行ta克隆并进行测序，获得ibu6p-1片段长度为526bp，其序列为seq id no.1；ibu6p-2片段长度532bp，其序列为seq id no.2。然后与已公布的拟南芥u6启动子片段atu6p进行比对分析，发现具有保守的use(upstream sequence element)和tata-box顺式元件，可以用来调控sgrna的表达，见图2。
40.实施例2
41.植物重组表达载体的构建
42.将实施例1中的ibu6p-1和ibu6p-2通过同源重组的方法分别插入含有luc报告基因的植物表达载体pgreenii 0800::luc中，转化大肠杆菌感受肽细胞后通过pcr方法来确定阳性重组表达载体。另外，将阳性菌落经液体lb培养后提取质粒，并进行酶切验证和测序分析。酶切结果表明，重组载体pgreenii 0800::ibu6p-1、pgreenii 0800::ibu6p-2和pgreenii 0800::atu6p酶切后出现两条带，大小与预期结果一致，见图3。同时测序结果也与各个u6启动子序列完全一致，说明u6启动子表达载体构建成功。
43.实施例3
44.甘薯u6启动子ibu6p-1或甘薯u6启动子ibu6p-2驱动重组质粒中的luc基因的表达
45.(1)农杆菌介导的烟草瞬时转化
46.将实施例2中构建的含有luc基因的植物重组表达载体pgreenii 0800::ibu6p-1和pgreenii 0800::ibu6p-2转化农杆菌eha105，将转化后的农杆菌进行筛选培养，并进行菌落pcr鉴定。
47.然后，分别将pgreenii 0800::ibu6p-1、pgreenii 0800::ibu6p-2和对照载体pgreenii 0800::atu6p通过农杆菌介导转化的方法注射烟草叶片，并以pgreenii-0800::
luc空载为阴性对照；待72h后对注射烟草叶片部分进行荧光素酶活性检测，并对荧光信号数据进行统计分析，发现ibu6p-2的荧光信号最强，其次为atu6p，而ibu6p-1的荧光信号最弱，见图4。具体方法如下：
48.①
将pgreenii 0800::ibu6p-1、pgreenii 0800::ibu6p-2和pgreenii 0800::atu6p转化农杆菌；
49.②
将新活化的农杆菌单克隆接种到含有相应抗生素10ml的yep或lb中，28℃，200rpm过夜；
50.③
当菌液od值介于0.6-1.0之间时，4000rpm、5min离心收集农杆菌；
51.④
用2ml induction medium(10mm mes-koh ph 5.7、10mm mgcl2、200um乙酰丁香酮(as))诱导液轻柔重悬农杆菌，然后再次离心收集菌液；
52.⑤
重复步骤4；
53.⑥
所得沉淀用1ml induction medium重悬od值为0.3，并室温放置1-4h；
54.⑦
用不加针头的注射器将侵染液注射进6-8周大的本氏烟草叶片中；
55.⑧
将瞬时转化的烟草叶片经100mm荧光素钾盐溶液浸染5min后在化学发光仪上进行观察拍照与分析。
56.(2)农杆菌介导的甘薯愈伤组织遗传转化
57.将上述含有pgreenii 0800::ibu6p-1、pgreenii 0800::ibu6p-2和pgreenii 0800::atu6p的农杆菌同样在抗性lb培养基中振荡至菌液od600值为0.8，然后用含有100umas的ms+2,4-d液体培养基重悬菌体至od600为0.5。将准备好的甘薯愈伤组织放入其中，暗培养30min后，超声波处理30s。然后将侵染的愈伤组织在ms+2,4-d+as的固体培养基中28℃暗培养72h，再用无菌水重复清洗甘薯愈伤4次后放在ms+2,4-d培养基上。最后，利用100mm荧光素钾盐溶液对甘薯愈伤组织进行化学发光，并用荧光显微镜进行观察和拍照，发现转化了pgreenii 0800::atu6p表达盒的甘薯愈伤组织中的荧光信号最低(图5a)，而在含有pgreenii 0800::ibu6p-1和pgreenii 0800::ibu6p-2表达盒的甘薯愈伤组织中的荧光信号均高于pgreenii 0800::atu6p，尤其是转化了pgreenii 0800::ibu6p-2表达盒的甘薯愈伤组织，其发光点的数量和强度最高(图5b和5c)。
58.由此可以说明，本发明所提供的seq id no.2所示的核苷酸序列ibu6p-2与拟南芥u6启动子atu6p相比可以更好地驱动luc基因大量表达，是一种能高效表达sgrna的启动子，能较好地应用于甘薯的crispr/cas9基因编辑技术研究中。

技术特征：
1.一种甘薯u6启动子，其特征在于，所述甘薯u6启动子为ibu6p-1或ibu6p-2，所述启动子ibu6p-1的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述启动子ibu6p-2的核苷酸序列如seq id no.2所示。2.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒包含权利要求1所述的甘薯u6启动子ibu6p-1或甘薯u6启动子ibu6p-2。3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求1所述的甘薯u6启动子ibu6p-1或甘薯u6启动子ibu6p-2。4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为将权利要求1所述的甘薯u6启动子ibu6p-1或甘薯u6启动子ibu6p-2插入植物表达载体中，并连接于载体目的基因序列上游得到。5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述植物表达载体为pgreenii 0800，所述目的基因为luc基因；所述重组表达载体为pgreenii0800::ibu6p-1或pgreenii 0800::ibu6p-2。6.根据权利要求1所述的甘薯u6启动子在调控luc基因表达中的应用。7.根据权利要求6所述的甘薯u6启动子在调控luc基因表达中的应用，其特征在于，包括以下步骤：(1)将权利要求1所述的甘薯u6启动ibu6p-1或甘薯u6启动ibu6p-2启动子插入pgreenii 0800载体中，并连接于luc基因上游，得到重组表达载体pgreenii0800::ibu6p-1或pgreenii 0800::ibu6p-2；(2)将所得到重组表达载体通过农杆菌介导的方法对烟草叶片和甘薯愈伤组织分别进行瞬时转化和遗传转化，并鉴定甘薯u6启动子的活性；在烟草叶片和甘薯愈伤组织中，甘薯u6启动子ibu6p-1或甘薯u6启动子ibu6p-2驱动重组质粒中的luc基因的表达。

技术总结
一种甘薯U6启动子、表达盒、重组表达载体及其应用，甘薯U6启动子为核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的IbU6p-1或核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的IbU6p-2。表达盒和重组表达载体分别包含甘薯U6启动子IbU6p-1或IbU6p-2。本发明从甘薯中克隆到的2个IbU6p启动子并连接到含有LUC报告基因的pGreenII0800载体上，通过农杆菌瞬时转化烟草叶片以及甘薯愈伤组织，发现所克隆的2个IbU6p启动子均具有转录活性，其中IbU6p-2的转录活性要明显高于AtU6p，可以作为甘薯内源U6启动子应用于甘薯CRISPR/Cas9编辑系统，提高在甘薯中的基因编辑效率。提高在甘薯中的基因编辑效率。提高在甘薯中的基因编辑效率。


技术研发人员：唐维 李强 张允刚 王欣 后猛 闫会 宋炜涵 李臣 高闰飞
受保护的技术使用者：江苏徐淮地区徐州农业科学研究所（江苏徐州甘薯研究中心）
技术研发日：2023.05.25
技术公布日：2023/7/27