溴标记质谱法检测痕量多胺及多肽的方法

1.本发明属于化学分析检测技术领域，涉及溴标记质谱法检测痕量多胺及多肽的方法。


背景技术：

2.多胺广泛存在于植物、动物和微生物中，是一类重要的活性物质。常见的多胺有：腐胺、尸胺、精胺和亚精胺等，是生物活性细胞中内源性的和不可缺少的组成部分，在蛋白质合成、细胞增殖分化、脑发育、神经生长和再生的调控、核酸功能调节等方面有着重要的作用。张宁等测定了9种补气药中的11个生物胺类成分，发现9种补气药中均含有腐胺与亚精胺。由于多胺类成分无紫外吸收，且含量较低，极性较大，在色谱柱上难以保留，分离分析较困难，因此常用衍生化的方法对其进行测定。常用的多胺衍生试剂包括丹磺酰氯、邻苯二甲醛、苯甲酰氯、9-氯甲酸芴甲酯、荧光胺等。
3.液相色谱-质谱联用法(hplc-ms)在水产品、酒类、豆制品、调味料及动物源性食品中应用较多。前处理有液液萃取法、丹磺酰氯衍生法、固相萃取法等，利用质谱较高的灵敏度，测定样品中的多胺。但未见液相色谱-质谱联用法测定多胺在中药分析中的应用，尤其是在复杂中药体系中所含痕量生物胺的分析。因此很有必要利用液相色谱-质谱联用法较高的灵敏度优势，建立一种适合痕量多胺和多肽的测定方法。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供溴标记质谱法检测痕量多胺及多肽的方法，提高了多胺、多肽的检测灵敏度和准确率。
5.本发明所采用的技术方案是，溴标记质谱法检测痕量多胺及多肽的方法，具体按照以下步骤实施：
6.步骤1，将衍生试剂与非质子溶剂混合均匀，形成衍生试剂溶液；
7.步骤2，将多胺溶液或者多肽溶液加入到衍生试剂溶液中，振摇、用微孔滤膜滤过，取续滤液，进行质谱分析；
8.步骤3，绘制待测多胺对照品或者多肽对照品的工作曲线；
9.步骤4，将待测样品与衍生试剂溶液混合进行衍生化反应，按照步骤2的方法进行质谱分析，在步骤3的工作曲线上查出样品中多胺或者多肽的含量。
10.本发明的特点还在于，
11.步骤1中，衍生试剂溶液的质量分数为0.01％-1％。
12.步骤1中，所述衍生试剂为异硫氰酸4-溴苯酯、四溴苯酐、溴代试剂1中的任意一种。
13.溴代试剂1的制备过程为：将溴代邻氨基苯甲酸和甲苯混合，然后滴加socl2，于80℃下搅拌2h，反应结束后旋转蒸发除去多余的socl2和甲苯，得到溴代试剂1。
14.步骤3中，具体为：将待测多胺对照品或者多肽对照品配制成系列浓度，按照步骤2
的衍生化过程进行质谱分析，以质谱离子信号强度为纵坐标，以多胺对照品溶液浓度或者多肽对照品溶液浓度为横坐标，绘制工作曲线。
15.本发明的有益效果是：本发明利用溴同位素特征(br 79,81，两个同位素质量相差2，丰度为50.54：49.46，几乎为1：1)，使得被标记的化合物容易在质谱图上辨识，即被标记物在质谱图上会显示双峰、强度几乎相等、质量数差2。另外，质谱法检测灵敏度很高，就使得该方法特别适合痕量成分的识别和检测。利用衍生化反应来限定对某一类成分进行标记，避免了大部分复杂背景成分的干扰。
附图说明
16.图1是溴代试剂1与正丙胺反应产物的质谱图；
17.图2是溴代试剂1与正丙胺的反应过程图；
18.图3是溴代试剂1与乙醇胺反应产物的质谱图；
19.图4是溴代试剂1与乙醇胺的反应过程图；
20.图5是溴代试剂1与正辛胺反应产物的质谱图；
21.图6是溴代试剂1与正辛胺的反应过程图；
22.图7是溴代试剂1与十二胺反应产物的质谱图；
23.图8是溴代试剂1与十二胺的反应过程图；
24.图9是溴代试剂1与3,4-二甲基苯胺反应产物的质谱图；
25.图10是溴代试剂1与3,4-二甲基苯胺的反应过程图；
26.图11是四溴苯酐与十二胺反应产物的质谱图；
27.图12是四溴苯酐与十二胺的反应过程图；
28.图13是异硫氰酸4-溴苯酯与十二胺反应产物的质谱图；
29.图14是异硫氰酸4-溴苯酯与十二胺的反应过程图；
30.图15是异硫氰酸4-溴苯酯与腐胺反应产物的质谱图；
31.图16是异硫氰酸4-溴苯酯与腐胺的反应过程图；
32.图17是异硫氰酸4-溴苯酯与尸胺反应产物的质谱图；
33.图18是异硫氰酸4-溴苯酯与尸胺的反应过程图；
34.图19是三种含溴化合物与多胺类化合物发生衍生化反应方程式；
35.图20是溴代试剂1与丙氨酸反应产物的质谱图；
36.图21是四溴苯酐与丙氨酸反应产物的质谱图；
37.图22是四溴苯酐与丙氨酸的反应过程图；
38.图23是四溴苯酐与缬氨酸反应产物的质谱图；
39.图24是四溴苯酐与缬氨酸的反应过程图；
40.图25是异硫氰酸4-溴苯酯与丙氨酸反应产物的质谱图；
41.图26是异硫氰酸4-溴苯酯与丙氨酸的反应过程图；
42.图27是异硫氰酸4-溴苯酯与缬氨酸反应产物的质谱图；
43.图28是异硫氰酸4-溴苯酯与缬氨酸的反应过程图；
44.图29是异硫氰酸4-溴苯酯与赖氨酸反应产物的质谱图；
45.图30是异硫氰酸4-溴苯酯与赖氨酸的反应过程图。
具体实施方式
46.下面结合具体实施方式和附图对本发明进行详细说明。
47.本发明溴标记质谱法检测痕量多胺及多肽的方法，具体按照以下步骤实施：
48.步骤1，将三个衍生试剂分别与非质子溶剂混合均匀，形成三个衍生试剂溶液；
49.衍生试剂溶液的质量分数为0.01％-1％；
50.衍生试剂分别为异硫氰酸4-溴苯酯、四溴苯酐和溴代试剂1；
51.溴代试剂1的制备过程为：将溴代邻氨基苯甲酸和甲苯混合，然后滴加socl2，于80℃下搅拌2h，反应结束后旋转蒸发除去多余的socl2和甲苯，得到溴代试剂1；
52.步骤2，将多胺溶液或者多肽溶液加入到任意一个衍生试剂溶液中，振摇10min，得到多胺溴标记衍生物或者多肽溴标记衍生物，用0.22μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，进行质谱分析；
53.色谱条件为：流动相a为0.1％甲酸溶液，流动相b为乙腈，80％b等度洗脱；流速0.3ml
·
min-1
；柱温：30℃；进样量：2μl。
54.质谱条件为，离子化方式：电喷雾离子源(esi)，正离子或负离子模式；离子源温度300℃；脱溶剂管温度：250℃；加热块温度：400℃；雾化气流量3.0l
·
min-1
；干燥气流量：10.0l
·
min-1
；加热气流量：10.0l
·
min-1
；检测方式：全扫描模式(scan)。
55.步骤3，将待测多胺对照品或者多肽对照品配制成系列浓度，按照步骤2的衍生化过程进行质谱分析，以质谱离子信号强度为纵坐标，以多胺对照品溶液浓度或者多肽对照品溶液浓度为横坐标，绘制工作曲线；
56.步骤4，将待测样品与任意一个衍生试剂溶液混合进行衍生化反应，按照步骤2的方法进行质谱分析，在步骤3的工作曲线上查出样品中多胺或者多肽的含量。
57.实施例1
58.溴代试剂1的合成与质谱确证：
59.称取溴代邻氨基苯甲酸(2.16g，0.01mol)、30ml甲苯加入放有磁子的三颈瓶中。滴加socl2(lml，0.015mol)，于80℃下搅拌2h，反应结束后旋转蒸发除去多余的socl2和甲苯，得到目标产物溴代试剂1，其化学反应式如下：
[0060][0061]
称取溴代试剂2.32mg，置于50ml容量瓶中，加入乙腈溶解并定容至刻度，振摇10min，用0.22μm的微孔滤膜滤过，取续滤液进行质谱分析，扫描范围220-600。
[0062]
称取异硫氰酸4-溴苯酯10.58mg、四溴苯酐10.95mg，分别加入200ml无水乙腈，摇匀使溶解，作为异硫氰酸4-溴苯酯和四溴苯酐衍生试剂溶液。
[0063]
吸取每种多胺类溶液各三份，每份2ml，分别加入溴代试剂、异硫氰酸4-溴苯酯和四溴苯酐衍生试剂4ml，振摇10min，用0.22μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，用全扫描的模式进行质谱分析。
[0064]
溴代试剂1可与正丙胺、乙醇胺、正辛胺、十二胺、3,4-二甲基苯胺发生衍生化反应。
nh2结合生成酰胺的反应比较容易，因此在生成酰胺后的衍生物，自身也产生了新的-nh2。继续反应，生成二聚体甚至多聚体衍生产物。例如溴代试剂1与正丙胺反应生成二聚体和三聚体产物，溴代试剂1与十二胺反应生成三聚体和四聚体产物。
[0076]
由此可说明，溴代试剂1和胺类化合物采用本实验中的反应条件和方法，反应快速，易发生。同时也证实结合质谱分析的方法，利用含溴化合物在质谱中产生两个质荷比相差2，丰度比接近1:1的分子离子峰。采用这种非常典型的含溴化合物的鉴别特征，来分析衍生化反应发生的过程和机理的方法是非常灵敏、准确、可行的。
[0077]
实施例2四溴苯酐为衍生剂结果分析
[0078]
四溴苯酐与十二胺反应：经质谱全扫描正模式测定，得到一组m/z 645.85，647.90，649.80，651.80，655.40五个具有明显溴同位素特征的分子离子峰。质荷比相差2，说明反应后的衍生物中含有4个溴原子，推测应为四溴苯酐与十二胺衍生化产物(c
20h27
br4no3)[m+h]-的分子离子峰，四溴苯酐与十二胺质谱图和反应过程，如图11和图12所示。
[0079]
实施例3异硫氰酸4-溴苯酯为衍生剂衍生化结果分析
[0080]
异硫氰酸4-溴苯酯可与十二胺、腐胺(1,4-丁二胺)、尸胺(1,5-戊二胺)发生衍生化反应。
[0081]
1.异硫氰酸4-溴苯酯与十二胺衍生化反应：
[0082]
经质谱全扫描正模式测定，得到一组m/z 399.25，401.25两个具有明显溴同位素特征的分子离子峰，质荷比相差2，丰度比接近1:1，说明反应后的衍生物中含有1个溴原子，推测为异硫氰酸4-溴苯酯与十二胺衍生化产物(c
19h31
brn2s)[m+h]
+
的分子离子峰，异硫氰酸4-溴苯酯与十二胺质谱图和反应过程，如图13和图14所示。
[0083]
在相同反应条件下，该衍生化反应得到的产物在同样质谱条件下更易离子化，响应强度更高。与溴代试剂和十二胺的反应结果相比，衍生产物唯一，质谱结果并未出现其他具有溴同位素特征的分子离子峰，未发生多聚反应。产物的[m+h]
+
分子离子峰响应强度为1.75
×
107，比溴代试剂和十二胺反应后生成的多聚体衍生物强度1.0
×
106，高出10倍以上。说明该衍生化过程更易发生，产物离子化程度高，响应强。
[0084]
2.异硫氰酸4-溴苯酯与腐胺(1,4-丁二胺)衍生化反应：
[0085]
异硫氰酸4-溴苯酯与腐胺反应后，经质谱全扫描正模式测定，得到一组m/z 302.15，304.00两个具有明显溴同位素特征的分子离子峰。质荷比相差2，丰度比接近1:1，说明反应后的衍生物中含有1个溴原子。推测为异硫氰酸4-溴苯酯与腐胺衍生化产物(c
11h16
brn3s)[m+h]
+
的分子离子峰。异硫氰酸4-溴苯酯与腐胺质谱图和反应过程，如图15和图16所示，从质谱图中可以看出，产物c
11h16
brn3s[m+h]
+
的分子离子峰响应强度较大，达到了2.0
×
107以上，含溴化合物质谱特征明显。
[0086]
3.异硫氰酸4-溴苯酯与尸胺(1，5-戊二胺)衍生化反应：
[0087]
异硫氰酸4-溴苯酯与尸胺反应后，经质谱全扫描正模式测定，得到一组m/z 316.05，318.00两个具有明显溴同位素特征的分子离子峰。质荷比相差2，丰度比接近1:1，说明反应后的衍生物中含有1个溴原子。推测为异硫氰酸4-溴苯酯与尸胺衍生化产物(c
12h18
brn3s)[m+h]
+
的分子离子峰。异硫氰酸4-溴苯酯与尸胺质谱图和反应过程，如图17和图18所示。从质谱图中可以看出，产物c
11h16
brn3s[m+h]
+
的分子离子峰响应强度较大，达到
了2.0
×
107以上，含溴化合物质谱特征明显。
[0088]
本发明的三种含溴化合物在相同的条件下均可以与多胺类化合物发生衍生化反应，反应后生成衍生物的过程和产物如图19所示；从质谱结果可以看出，溴代试剂与胺类化合物反应产物较复杂。由于自身n-s键断开后又生成新的-nh2，反应较易发生。新的-nh2和过量的溴代试剂又发生衍生化反应，生成二聚体或多聚体衍生物。在质谱结果中可见质荷比两两相差2，丰度比为1:1、1:2:1或1:2:2:1的分子离子峰，为含溴化合物在质谱上的典型特征表现。
[0089]
异硫氰酸4-溴苯酯与胺类化合物反应，反应的机理是异硫氰酸4-溴苯酯中n＝c双键打开与-nh2结合生成新的衍生物。该衍生物在质谱条件下，易生成带电离子，形成响应强度较高的分子离子峰，生成的产物唯一，较稳定。在质谱结果中可见强度较高，质荷比相差2，丰度比为1:1的分子离子峰，说明产物中含有一个溴原子。
[0090]
四溴苯酐与胺类化合物反应，反应的机理是四溴苯酐中两个c-o键断裂，形成羧基。胺与一个羧基生成酰胺，另一个羧基游离，生成含有四个溴原子的衍生物。经质谱分析，得到五个质荷比两两相差2的分子离子峰，符合含溴化合物质谱中典型的分子离子峰。
[0091]
综上，三种含溴试剂均能与多胺类成分反应，使其能够标记上溴，这样就能很容易的在质谱图中辨识，特别适合于复杂成分中多胺类成分的鉴别和测定。
[0092]
实施例4溴代试剂1与氨基酸衍生化反应
[0093]
溴代试剂1与氨基酸溶液(dmf溶)反应后，经质谱测定，出现多组具有多个溴同位素的特征的分子离子峰，且质荷比相差2，溴代试剂1与丙氨酸反应的质谱图，如图20所示，从上述结果可以看出，溴代试剂1与丙氨酸反应后，发生了一系列的聚合反应，生成了溴代聚合物，使得衍生化反应出现了多个产物，虽然对结果有影响，但是依然可以作为氨基酸定性定量测定的衍生试剂。
[0094]
实施例5四溴苯酐与氨基酸衍生化
[0095]
四溴苯酐可以与丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸等发生衍生化反应。
[0096]
1.四溴苯酐与丙氨酸衍生化反应：四溴苯酐与丙氨酸反应后，经质谱全扫描负模式测定，得到一组m/z 546.65，548.75，549.80，551.80，553.60具有溴同位素特征的分子离子峰。说明在此条件下，四溴苯酐可以与丙氨酸发生衍生化反应。四溴苯酐与丙氨酸质谱图和反应过程如图21及图22所示，生成衍生物中含有4个溴原子，推测为四溴苯酐与丙氨酸反应生成了产物(c
11
h7br4no5)。
[0097]
2.四溴苯酐与缬氨酸衍生化反应：四溴苯酐与缬氨酸反应后，经质谱全扫描负模式测定，得到一组m/z 575.75，577.75，579.85，581.70，583.75质荷比相差2的五个分子离子峰。应为四溴苯酐与缬氨酸衍生化产物(c
13h11
br4no5)[m-h]-的分子离子峰。说明在此条件下，衍生物中含有4个溴原子，是四溴苯酐与缬氨酸发生了衍生化反应。四溴苯酐与缬氨酸质谱图和反应过程如图23和图24所示。
[0098]
以上实验结果也相互确证了四溴苯酐与此类氨基酸反应的机理和生成的产物。在衍生化中，四溴苯酐中两个c-o键断裂，形成羧基，氨基酸中的氨基(-nh2)与一个羧基生成酰胺，另一个羧基游离，生成含有四个溴的衍生物。同时也说明四溴苯酐作为衍生试剂可与氨基酸发生衍生化反应，在质谱测定结果中也可以很容易找到具有四个溴特征的分子离子峰。这用质谱来分析反应结果的方法能快速、准确的分辨衍生化产物，分析反应的发生机理
和过程，从而监控衍生化反应的整个过程。
[0099]
实施例6异硫氰酸4-溴苯酯与氨基酸衍生化
[0100]
异硫氰酸4-溴苯酯可以与丙氨酸、丝氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸及赖氨酸发生衍生化反应。
[0101]
1.异硫氰酸4-溴苯酯与丙氨酸衍生化反应：异硫氰酸4-溴苯酯与丙氨酸反应后，经质谱全扫描负模式测定，得到一组m/z 301.01，303.25具有明显溴同位素特征的分子离子峰，质荷比相差2。说明在此条件下，异硫氰酸4-溴苯酯可以与丙氨酸发生反应。异硫氰酸4-溴苯酯与丙氨酸质谱图和反应过程如图25和图26所示，生成的衍生物中含有1个溴原子，推测为异硫氰酸4-溴苯酯与丙氨酸衍生化产物(c
10h11
brn2o2s)[m-h]-的分子离子峰。
[0102]
2.异硫氰酸4-溴苯酯与缬氨酸衍生化反应：异硫氰酸4-溴苯酯与缬氨酸反应后，异硫氰酸4-溴苯酯与缬氨酸质谱图和反应过程如图27和图28所示，经质谱全扫描负模式测定，得到一组m/z 329.25，332.20质荷比相差2的分子离子峰。应为异硫氰酸4-溴苯酯与缬氨酸衍生化产物(c
12h15
brn2o2s)[m-h]-的分子离子峰。说明在此条件下，异硫氰酸4-溴苯酯与缬氨酸发生了衍生化反应。生成衍生物中含有1个溴原子。
[0103]
3.异硫氰酸4-溴苯酯与赖氨酸衍生化反应：异硫氰酸4-溴苯酯与赖氨酸反应后，经质谱全扫描负模式测定，得到一组m/z 358.35，360.15的分子离子峰。应为异硫氰酸4-溴苯酯中n＝c双键打开与赖氨酸中远端氨基(-nh2)结合生成产物(c
13h18
brn3o2s)。异硫氰酸4-溴苯酯与赖氨酸质谱图和反应过程如图29和图30所示，该化合物进入质谱，在负模式下，产生[m-h]-的分子离子峰，和质谱测定结果一致。
[0104]
异硫氰酸4-溴苯酯可以与丙氨酸、丝氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸及赖氨酸发生衍生化反应，在质谱负模式扫描条件下，得到具有一个溴质谱特征的[m-h]-的分子离子峰。质谱的结果对产物进行了确证。充分说明异硫氰酸4-溴苯酯作为衍生试剂可与氨基酸发生衍生化反应，作为氨基酸及多肽的溴标记衍生化试剂用于定性鉴别和定量分析。

技术特征：
1.溴标记质谱法检测痕量多胺及多肽的方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：步骤1，将衍生试剂与非质子溶剂混合均匀，形成衍生试剂溶液；步骤2，将多胺溶液或者多肽溶液加入到衍生试剂溶液中，振摇用微孔滤膜滤过，取续滤液，进行质谱分析；步骤3，绘制待测多胺对照品或者多肽对照品的工作曲线；步骤4，将待测样品与衍生试剂溶液混合进行衍生化反应，按照步骤2的方法进行质谱分析，在步骤3的工作曲线上查出样品中多胺或者多肽的含量。2.根据权利要求1所述的溴标记质谱法检测痕量多胺及多肽的方法，其特征在于，所述步骤1中，衍生试剂溶液的质量分数为0.01％-1％。3.根据权利要求1所述的溴标记质谱法检测痕量多胺及多肽的方法，其特征在于，所述步骤1中，所述衍生试剂为异硫氰酸4-溴苯酯、四溴苯酐、溴代试剂1中的任意一种。4.根据权利要求3所述的溴标记质谱法检测痕量多胺及多肽的方法，其特征在于，所述溴代试剂1的制备过程为：将溴代邻氨基苯甲酸和甲苯混合，然后滴加socl2，于80℃下搅拌2h，反应结束后旋转蒸发除去多余的socl2和甲苯，得到溴代试剂1。5.根据权利要求1所述的溴标记质谱法检测痕量多胺及多肽的方法，其特征在于，所述步骤3中，具体为：将待测多胺对照品或者多肽对照品配制成系列浓度，按照步骤2的衍生化过程进行质谱分析，以质谱离子信号强度为纵坐标，以多胺对照品溶液浓度或者多肽对照品溶液浓度为横坐标，绘制工作曲线。

技术总结
本发明公开了溴标记质谱法检测痕量多胺及多肽的方法，具体为：将衍生试剂与非质子溶剂混合均匀，形成衍生试剂溶液；将多胺溶液或者多肽溶液加入到衍生试剂溶液中，振摇用微孔滤膜滤过，取续滤液，进行质谱分析；绘制待测多胺对照品或者多肽对照品的工作曲线；将待测样品与衍生试剂溶液混合进行衍生化反应，进行质谱分析，在工作曲线上查出样品中多胺或者多肽的含量。本发明利用溴同位素特征，使得被标记的化合物容易在质谱图上辨识，即被标记物在质谱图上会显示双峰、强度几乎相等、质量数差2。利用衍生化反应来限定对某一类成分进行标记，避免了大部分复杂背景成分的干扰。避免了大部分复杂背景成分的干扰。避免了大部分复杂背景成分的干扰。


技术研发人员：刘建利 艾芸 程薇薇 韩宁娟 方欢乐
受保护的技术使用者：西安培华学院
技术研发日：2023.05.22
技术公布日：2023/7/27