锁阳精多糖、锁阳多糖化合物及制备方法和应用

1.本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种锁阳精多糖、锁阳多糖化合物及制备方法和应用。


背景技术：

2.中药活性成分一直是新药研发的主要来源，如青蒿素、小檗碱、紫杉醇等药物都是基于中药的传统功效而发现的。中药锁阳为锁阳科植物锁阳(cynomorium songaricum rupr.)的干燥肉质茎，具有补肾阳、益精血、润肠通便的功效，用于肾阳不足、精血亏虚、腰膝痿软、阳痿滑精以及肠燥便秘。现代药理活性研究发现锁阳具有抗缺氧、抗疲劳、抑制血小板聚集、类糖皮质激素、调节免疫、提升性功能、改善肠功能、促进肾上腺皮质分泌、抗胃溃疡、抗转录、抗癌等多种活性。然而针对锁阳的作用机制研究较为欠缺，也未曾报道锁阳中具有治疗上述某种疾病的活性成分。锁阳的成分主要包括有机酸类、黄酮类、甾体类、三萜类、多糖类、氨基酸类化合物和矿物质元素等，其中锁阳多糖是目前研究最多的一类成分，主要包括锁阳多糖在治疗糖尿病、免疫抑制、抗氧化、抗衰老、改善胃肠道功能等方面的研究。然而这些研究中缺少与锁阳传统功效“治疗阳痿滑精”相关的报道。现有技术中有锁阳多糖与其它多种中药组合之后用于阳痿的报道(如申请号为cn20181036830.5的中国专利)，但是此发明为中药组合物，其治疗阳痿的机理为多种成分共同作用的结果，而且该发明也未阐明锁阳多糖为该中药组合物中的主要药效成分。此外，目前尚未见到锁阳多糖中单体多糖治疗阳痿的报道。
3.在人体内，信使分子环磷酸鸟苷(cgmp)通过控制钙离子通道蛋白激酶g(pkg)，促使平滑肌细胞内钙离子外流导致平滑肌疏松，从而引起肺动脉血管、海绵体平滑肌血管、脑部血管等的血液流入，实现肺动脉压力降低、生理性勃起、脑供血改善等生理活性。而cgmp作为5型磷酸二酯酶的底物，很容易被其降解成鸟苷酸(gmp)而失去活性。5型磷酸二酯酶广泛分布于人体肺部、阴茎海绵体平滑肌内，以及血管、内脏、气道平滑肌、骨骼肌、血小板等组织。因此靶向作用于5型磷酸二酯酶的抑制剂分子已经在临床上用于治疗肺动脉高压和勃起功能障碍的药物，如西地那非、他达拉非等。但是，此类人工合成的化学药物在临床治疗中经常会引起头痛、面部潮红、消化不良、肌肉疼痛、鼻塞、腹泻、头晕、皮疹等副作用。此外，治疗肺动脉高压的患者需要长期服药，目前临床所用的此类药物价格普遍较贵，患者经济压力较大。除了人工合成的化学药物以外，目前报道的中药来源的5型磷酸二酯酶抑制剂只有源于淫羊藿的宝藿苷类化合物及其类似物，而且在临床上并未得到广泛应用。因此寻找新的5型磷酸二酯酶抑制剂具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种锁阳精多糖、锁阳多糖化合物及制备方法和应用，本发明中锁阳精多糖以及锁阳多糖化合物对5型磷酸二酯酶抑制活性高，选择性好，且为天然植物多糖，具有毒副作用小以及价格低廉的特点。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
6.本发明提供了一种锁阳精多糖的制备方法，包括以下步骤：
7.采用乙醇水溶液对锁阳进行提取，将所得提取液进行浓缩，得到醇提物；
8.采用石油醚对所述醇提物进行脱脂，得到脱脂渣；
9.将所述脱脂渣与水混合进行静置，将所得上清液进行大孔树脂柱层析分离，所用洗脱剂依次为体积分数为10％和20～80％的乙醇水溶液，收集体积分数为20～80％的乙醇水溶液洗脱时所得洗脱液，依次进行浓缩和干燥，得到锁阳粗多糖；
10.将所述锁阳粗多糖进行脱蛋白，得到锁阳精多糖。
11.优选地，所述提取所用乙醇水溶液的体积分数为70～90％；所述提取在回流条件下进行，所述提取的次数为2～5次，每次提取的时间为1.5～5h，每次提取的料液比为1g：5～20ml。
12.优选地，所述脱脂在煮沸条件下进行，所述脱脂的次数为3～8次，每次脱脂的时间为10～60min，每次脱脂的料液比为1g：5～10ml。
13.优选地，所述大孔树脂柱层析分离采用的大孔吸附树脂为非极性大孔聚苯乙烯吸附树脂。
14.本发明提供了上述技术方案所述制备方法制备得到的锁阳精多糖。
15.本发明提供了一种锁阳多糖化合物，具有式v所示链接方式：
[0016][0017]
本发明提供了上述技术方案所述锁阳多糖化合物的制备方法，包括以下步骤：
[0018]
以水为洗脱剂，采用纤维素柱对上述技术方案所述锁阳精多糖进行极性分离，将所得洗脱液依次进行浓缩、透析与干燥，得到水洗脱组分；
[0019]
以浓度为0.1～0.3mol/l的氯化钠水溶液为洗脱剂，采用葡聚糖凝胶柱对所述水洗脱组分进行纯化，得到具有式v所示链接方式的锁阳多糖化合物。
[0020]
本发明提供了锁阳多糖化合物、其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、前药化合物、多晶型物、对映异构体或上述技术方案所述锁阳精多糖在制备5型磷酸二酯酶抑制剂中的应用，所述锁阳多糖化合物具有式i、式ii、式iii、式iv或式v所示链接方式：
[0021]
→
3)-α-d-araf-(1
→
3)-α-d-glcp-(1
→
4)α-d-galpa6me-(1
→ꢀ
式i；
[0022]
[0023]
→
α-glcp-(1
→
6)-α-glcp-(1
→
3)-α-glcp-(1
→
6)-α-glcp-(1
→
6)-α-glcp-(1
→ꢀ
式iii；
[0024][0025][0026]
本发明提供了锁阳多糖化合物、其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、前药化合物、多晶型物、对映异构体或上述技术方案所述锁阳精多糖在制备防治人或兽与5型磷酸二酯酶相关的疾病的药物中的应用，所述锁阳多糖化合物具有式i、式ii、式iii、式iv或式v所示链接方式：
[0027]
→
3)-α-d-araf-(1
→
3)-α-d-glcp-(1
→
4)α-d-galpa6me-(1
→ꢀ
式i；
[0028][0029]
→
α-glcp-(1
→
6)-α-glcp-(1
→
3)-α-glcp-(1
→
6)-α-glcp-(1
→
6)-α-glcp-(1
→ꢀ
式iii；
[0030][0031][0032]
优选地，所述与5型磷酸二酯酶相关的疾病包括肺动脉高压、男性勃起功能障碍、男性睾丸缺血、女性性功能障碍、痛经、良性前列腺增生、缺血性心绞痛、高血压、阿尔兹海默症、动脉硬化、中风、动脉硬化性闭塞、动脉栓塞、慢性哮喘、支气管炎、变应性哮喘、过敏性鼻炎、青光眼或特征为肠动力紊乱的疾病。
[0033]
本发明提供了一种锁阳精多糖的制备方法，包括以下步骤：采用乙醇水溶液对锁阳进行提取，将所得提取液进行浓缩，得到醇提物；采用石油醚对所述醇提物进行脱脂，得到脱脂渣；将所述脱脂渣与水混合进行静置，将所得上清液进行大孔树脂柱层析分离，所用洗脱剂依次为体积分数为10％和20～80％的乙醇水溶液，收集体积分数为20～80％的乙醇水溶液洗脱时所得洗脱液，依次进行浓缩和干燥，得到锁阳粗多糖；将所述锁阳粗多糖进行脱蛋白，得到锁阳精多糖；在此基础上还可以进一步分离纯化得到锁阳多糖化合物。本发明中锁阳精多糖以及锁阳多糖化合物对5型磷酸二酯酶抑制活性高，选择性好，且为天然植物多糖，具有毒副作用小的特点，其中锁阳粗多糖在锁阳中的含量高达10％，这不仅为未来临床应用保证了资源，同时还能降低5型磷酸二酯酶抑制剂的价格，解决当前此类药物价格贵的问题。
具体实施方式
[0034]
本发明提供了一种锁阳精多糖的制备方法，包括以下步骤：
[0035]
采用乙醇水溶液对锁阳进行提取，将所得提取液进行浓缩，得到醇提物；
[0036]
采用石油醚对所述醇提物进行脱脂，得到脱脂渣；
[0037]
将所述脱脂渣与水混合进行静置，将所得上清液进行大孔树脂柱层析分离，所用洗脱剂依次为体积分数为10％和20～80％的乙醇水溶液，收集体积分数为20～80％的乙醇水溶液洗脱时所得洗脱液，依次进行浓缩和干燥，得到锁阳粗多糖；
[0038]
将所述锁阳粗多糖进行脱蛋白，得到锁阳精多糖。
[0039]
在本发明中，若无特殊说明，所用原料均为本领域技术人员熟知的市售商品；所用水均为蒸馏水。
[0040]
本发明采用乙醇水溶液对锁阳进行提取，将所得提取液进行浓缩，得到醇提物。在本发明中，所述锁阳进行提取前优选依次进行干燥和粉碎；所述干燥优选为晾干；所述粉碎优选以得到粒度为10目的锁阳颗粒为基准。在本发明中，所述提取所用乙醇水溶液的体积分数优选为70～90％，更优选为80～90％；所述提取优选在回流条件下进行，具体温度优选为75℃；所述提取的次数优选为2～5次，更优选为3次；每次提取的时间优选为1.5～5h，更优选为2～3h；每次提取的料液比优选为1g：5～20ml，更优选为1g：7～10ml。本发明优选将每次提取所得提取液合并后进行浓缩；所述浓缩优选为减压浓缩；所述浓缩优选是将所述提取液浓缩至样品无流动性。本发明优选在上述条件下进行提取，相对于传统的水提法能够提出不同水溶性的大部分多糖，有利于更加完全的提取出锁阳多糖成分。
[0041]
得到醇提物后，本发明采用石油醚对所述醇提物进行脱脂，得到脱脂渣。在本发明中，所述脱脂优选在煮沸条件下进行；所述脱脂的次数优选为3～8次，更优选为5次；每次脱脂的时间优选为10～60min，更优选为20～30min；每次脱脂的料液比优选为1g：5～10ml，更优选为1g：5～7ml。所述脱脂后，本发明优选将所得物料进行固液分离，所得液体物料中含脂肪类化合物，所得固体物料为所述脱脂渣。本发明优选在上述条件下进行脱脂，能够有效去除脂类成分，有利于后续锁阳多糖成分的分离纯化。
[0042]
得到脱脂渣后，本发明将所述脱脂渣与水混合进行静置，将所得上清液进行大孔树脂柱层析分离，所用洗脱剂依次为体积分数为10％和20～80％的乙醇水溶液，收集体积分数为20～80％的乙醇水溶液洗脱时所得洗脱液，依次进行浓缩和干燥，得到锁阳粗多糖。
在本发明中，所述脱脂渣与水的用量比优选为1g：5～20ml，更优选为1g：10ml。在本发明中，所述静置的温度优选为10～30℃，更优选为20℃；时间优选为1～5h，更优选为2h。本发明将所述脱脂渣与水混合进行静置的作用是去除提取过程中掺入的非糖类小极性成分。
[0043]
所述静置后，本发明取上清液进行大孔树脂柱层析分离。在本发明中，所述大孔树脂柱使用前优选采用水进行平衡；本发明对所述平衡的具体方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的方式即可。在本发明中，所述大孔树脂柱层析分离采用的大孔吸附树脂优选为非极性大孔聚苯乙烯吸附树脂，更优选为型号为amberlite xad1600n、xad16n或xad1180n的大孔吸附树脂，进一步优选为型号为amberlite xad1600n的大孔吸附树脂。本发明优选将所述上清液加入到预先用水平衡好的大孔树脂柱，采用体积分数为10％的乙醇水溶液进行第一洗脱，之后再采用体积分数为20～80％的乙醇水溶液进行第二洗脱，收集第二洗脱时所得洗脱液，依次进行浓缩和干燥，得到锁阳粗多糖。在本发明中，所述第二洗脱所用乙醇水溶液的体积分数优选为50～75％，更优选为65～70％。在本发明中，所述干燥优选为冷冻干燥。本发明优选在上述条件下进行大孔树脂柱层析分离，能够快速的从上清液中分离出主要的多糖成分，相对于传统的水煮法具有速度快、同时还有排除部分游离蛋白的作用，有利于工业化生产。所述第二洗脱后，本发明优选采用体积分数为95％的乙醇水溶液继续洗脱，以充分去除大孔树脂柱中杂质，便于下次使用。
[0044]
得到锁阳粗多糖后，本发明将所述锁阳粗多糖进行脱蛋白，得到锁阳精多糖。在本发明中，所述脱蛋白采用的方法优选为sevage法；本发明对所述sevage法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的方法即可。
[0045]
本发明提供了上述技术方案所述制备方法制备得到的锁阳精多糖。本发明提供的锁阳精多糖对5型磷酸二酯酶抑制活性高，选择性好，且为天然植物多糖，具有毒副作用小以及价格低廉的特点。
[0046]
本发明提供了一种锁阳多糖化合物，具有式v所示链接方式：
[0047][0048]
在本发明中，具有式v所示链接方式的锁阳多糖化合物记为cs-p5，所述cs-p5为由26个α-d-葡萄糖(α-d-glc)、8个β-d-甘露糖(β-d-man)、11个β-d-半乳糖(β-d-gal)、1个α-l-鼠李糖(α-l-rha)与5个α-l-阿拉伯糖(α-l-araf)组成的基本单位重复连接而成的多糖，含有3条支链。在本发明中，所述cs-p5的重均分子量具体为9609。
[0049]
本发明提供了上述技术方案所述锁阳多糖化合物的制备方法，包括以下步骤：
[0050]
以水为洗脱剂，采用纤维素柱对上述技术方案所述锁阳精多糖进行极性分离，将
所得洗脱液依次进行浓缩、透析与干燥，得到水洗脱组分；
[0051]
以浓度为0.1～0.3mol/l的氯化钠水溶液为洗脱剂，采用葡聚糖凝胶柱对所述水洗脱组分进行纯化，得到具有式v所示链接方式的锁阳多糖化合物(即cs-p5)。
[0052]
本发明以水为洗脱剂，采用纤维素柱对上述技术方案所述锁阳精多糖进行极性分离，将所得洗脱液依次进行浓缩、透析与干燥，得到水洗脱组分。在本发明中，所述纤维素柱中填料的型号优选为deae-52。在本发明中，所述纤维素柱使用前优选采用盐酸进行浸泡，以去除所述填料中的杂质，然后采用水洗脱至中性，并采用水进行平衡。在本发明中，所述浸泡采用的盐酸浓度优选为0.1～1mol/l，更优选为0.5mol/l；所述浸泡的时间优选为0.5～10h，更优选为1h；所述洗脱至中性的过程中，所用水的体积优选为4～10倍柱体积，更优选为5倍柱体积；所述平衡的过程中，所用水的流速优选为3～20ml/min，更优选为5ml/min，所述平衡的时间优选为1～5h，更优选为2h。
[0053]
本发明优选将所述锁阳精多糖与水混合，加热后涡旋，之后经离心，取上清液上样于用水平衡好的纤维素柱，然后以水为洗脱剂进行洗脱。在本发明中，所述加热的温度优选为30～50℃，更优选为40℃；所述涡旋的转速优选为500～1500rpm，更优选为1000rpm，时间优选为2～20min，更优选为5～10min；所述离心的转速优选为10000～15000rpm，更优选为12000rpm，时间优选为5～20min，更优选为5～10min。在本发明中，所述加热的作用是增加难溶性多糖的溶解性；本发明优选采用上述方式得到上清液并采用纤维素柱进行极性分离，能够将不同极性的多糖进行分离，有利于分离不同结构类型的多糖。在本发明中，所述洗脱时水的流速优选为5～50ml/min，更优选为15ml/min；水的用量优选为1～10倍柱体积，更优选为3倍柱体积。本发明优选采用苯酚硫酸法进行追踪检测，收集对称峰对应的洗脱液；具体的，本发明收集水洗脱时所得洗脱液，依次进行浓缩、透析与干燥，得到水洗脱组分(记为cs-p-w组分)。本发明对所述浓缩没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的浓缩方式即可。在本发明中，所述透析所用透析袋的截留分子量优选为3500da，所述透析优选在纯水中进行。在本发明中，所述干燥优选为冷冻干燥。
[0054]
得到水洗脱组分后，本发明以浓度为0.1～0.3mol/l的氯化钠水溶液为洗脱剂，采用葡聚糖凝胶柱对所述水洗脱组分进行纯化，得到cs-p5。在本发明中，所述葡聚糖凝胶柱中填料的型号优选包括sepharose cl-6b、sepharose cl-4b或sepharose cl-2b。在本发明中，所述纯化所用氯化钠水溶液的浓度为0.1～0.3mol/l，优选为0.2mol/l。本发明优选结合示差检测器在线检测收集，收集对称峰对应的纯化液，依次进行浓缩和干燥，得到cs-p5；在本发明的实施例中，所述浓缩所用设备优选为旋转蒸发仪；所述干燥优选为冷冻干燥。本发明对所述水洗脱组分进行纯化的过程中，还得到另外一种锁阳多糖化合物，记为cs-p1，所述cs-p1的链接方式具体如式i所示：
[0055]
→
3)-α-d-araf-(1
→
3)-α-d-glcp-(1
→
4)α-d-galpa6me-(1
→
式i。
[0056]
在本发明中，所述cs-p1是由α-d-阿拉伯糖(α-d-araf)、α-d-葡萄糖(α-d-glc)与α-d-6
′
甲基半乳糖(α-d-gala6me)这三种单糖组成的基本单位重复链接而成的多糖。在本发明中，所述cs-p1的重均分子量具体为1394500。
[0057]
在本发明中，以水为洗脱剂，采用纤维素柱对上述技术方案所述锁阳精多糖进行极性分离后，优选还依次以浓度为0.1～0.3mol/l(优选为0.2mol/l)、0.4～0.6mol/l(优选为0.5mol/l)、0.8～1.2mol/l(优选为1.0mol/l)的nacl水溶液为洗脱剂继续进行洗脱，收
集各浓度洗脱剂洗脱时所得洗脱液，分别依次进行浓缩、透析与干燥，得到各nacl水溶液洗脱组分；之后参照上述纯化的方法得到其它种类锁阳多糖化合物。具体的，在本发明的实施例中，以浓度为0.2mol/l、0.5mol/l和1.0mol/l的nacl水溶液为洗脱剂时所得洗脱液对应的nacl水溶液洗脱组分依次记为cs-p-0.2m组分、cs-p-0.5m组分以及cs-p-1.0m组分；之后将所述cs-p-0.2m组分参照上述葡聚糖凝胶纯化的方法得到另外一种锁阳多糖化合物，记为cs-p2；将所述cs-p-0.5m组分参照上述葡聚糖凝胶纯化的方法得到另外一种锁阳多糖化合物，记为cs-p3；将所述cs-p-1.0m组分参照上述葡聚糖凝胶纯化的方法得到另外一种锁阳多糖化合物，记为cs-p4。
[0058]
在本发明中，所述cs-p2的链接方式具体如式ii所示：
[0059][0060]
在本发明中，所述cs-p2是由5个α-d-葡萄糖(α-d-glc)、1个β-d-葡萄糖(β-d-glc)、1个α-d-甘露糖(α-d-man)与1个β-d-半乳糖(β-d-gal)组成的基本单位重复链接而成的多糖。在本发明中，所述cs-p2的重均分子量具体为482500。
[0061]
在本发明中，所述cs-p3的链接方式具体如式iii所示：
[0062]
→
α-glcp-(1
→
6)-α-glcp-(1
→
3)-α-glcp-(1
→
6)-α-glcp-(1
→
6)-α-glcp-(1
→
式iii。
[0063]
在本发明中，所述cs-p3是由5个α-d-葡萄糖(α-d-glc)组成的基本单位重复链接而成的多糖。在本发明中，所述cs-p3的重均分子量具体为715000。
[0064]
在本发明中，所述cs-p4的链接方式具体如式iv所示：
[0065][0066]
在本发明中，所述cs-p4由6个α-d-阿拉伯糖(α-d-araf)、2个β-d-半乳糖(β-d-gal)、2个α-d-葡萄糖(α-d-glc)与2个α-d-鼠李糖(α-d-rha)组成的基本单位重复连接而成的多糖，含有2条支链。在本发明中，所述cs-p4的重均分子量具体为1470000。
[0067]
本发明提供了锁阳多糖化合物、其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、前药化合物、多晶型物、对映异构体或上述技术方案所述锁阳精多糖在制备5型磷酸二酯酶抑制剂中的应用，所述锁阳多糖化合物具有式i、式ii、式iii、式iv或式v所示链接方式：
[0068]
→
3)-α-d-araf-(1
→
3)-α-d-glcp-(1
→
4)α-d-galpa6me-(1
→ꢀ
式i；
[0069][0070]
→
α-glcp-(1
→
6)-α-glcp-(1
→
3)-α-glcp-(1
→
6)-α-glcp-(1
→
6)-α-glcp-(1
→ꢀ
式iii；
[0071]
[0072][0073]
本发明中锁阳多糖化合物、其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、前药化合物、多晶型物、对映异构体或上述技术方案所述锁阳精多糖能够抑制5型磷酸二酯酶，可以用于制备5型磷酸二酯酶抑制剂。
[0074]
本发明提供了锁阳多糖化合物、其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、前药化合物、多晶型物、对映异构体或上述技术方案所述锁阳精多糖在制备防治人或兽与5型磷酸二酯酶相关的疾病的药物中的应用，所述锁阳多糖化合物具有式i、式ii、式iii、式iv或式v所示链接方式：
[0075]
→
3)-α-d-araf-(1
→
3)-α-d-glcp-(1
→
4)α-d-galpa6me-(1
→ꢀ
式i；
[0076][0077]
→
α-glcp-(1
→
6)-α-glcp-(1
→
3)-α-glcp-(1
→
6)-α-glcp-(1
→
6)-α-glcp-(1
→ꢀ
式iii；
[0078][0079][0080]
本发明中锁阳多糖化合物、其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、前药化合物、多晶型物、对映异构体或上述技术方案所述锁阳精多糖能够抑制5型磷酸二酯酶，进而消除、改善或减轻与5型磷酸二酯酶相关的疾病或疾病状态，即实现防治与5型磷酸二酯酶相关的疾病。
[0081]
在本发明中，所述锁阳多糖化合物药学上可接受的盐包括所述锁阳多糖化合物与无机碱形成的盐，所述无机碱优选包括氢氧化钠或氢氧化钾。
[0082]
在本发明中，所述药物中包括药学上可接受的载体，所述药物中药学上可接受的载体的含量优选为1～98wt％，更优选为10～80wt％。在本发明中，所述药学上可接受的载体优选包括但不局限于：离子交换剂(如可以为na
+
、ca
2+
、k
+
、mg
2+
、fe
3+
等金属盐或金属碱，也可以为含有的磺酸基(-so3h)或羧基(-cooh)等酸性基团的化合物)、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(如人血清蛋白)、缓冲物质(如磷酸盐缓冲盐或hepes缓冲物等)、甘油、山梨酯、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、电解质(如硫酸或氯化钠)、鱼精蛋白、胶态氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、淀粉、聚丙烯酸酯、蜂蜡和羊毛酯中的一种或几种。
[0083]
在本发明中，所述药物可以单位剂量形式给药，本发明对所述药物的剂型没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的剂型即可。本发明对所述药物的给药方式没有特殊限定，根据药物剂型采用本领域技术人员熟知的给药方式即可。
[0084]
在本发明中，所述与5型磷酸二酯酶相关的疾病优选包括肺动脉高压、男性勃起功能障碍、男性睾丸缺血、女性性功能障碍、痛经、良性前列腺增生、缺血性心绞痛、高血压、阿尔兹海默症、动脉硬化、中风、动脉硬化性闭塞、动脉栓塞、慢性哮喘、支气管炎、变应性哮喘、过敏性鼻炎、青光眼或特征为肠动力紊乱的疾病，更优选为肺动脉高压或男性勃起功能障碍。本发明通过相应的给药方式，可以改善局部或全身的血管状态，特别是改善局部或全身的动脉血流量，因此可以用于防治上述疾病。
[0085]
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0086]
实施例1锁阳精多糖的制备
[0087]
将锁阳药材晾干后粉碎，得到粒度为10目的锁阳颗粒，用体积分数为90％的乙醇水溶液在回流(75℃)条件下提取3次，每次提取的时间为2h，每次提取的料液比为1：10(g/ml)，合并3次提取液并进行减压浓缩至样品无流动性，得到醇提物；
[0088]
将所述醇提物用石油醚在煮沸条件下脱脂5次，每次脱脂的时间为30min，每次脱脂的料液比为1：5(g/ml)，然后过滤，滤液中含脂肪类化合物，将滤渣与蒸馏水按照1g：10ml的比例混合得到混悬液，在20℃条件下静置2h，将上清液加入到预先用蒸馏水平衡好的大孔树脂柱(amberlite xad1600n)，之后依次用体积分数为10％的乙醇水溶液、体积分数为70％的乙醇水溶液以及体积分数为95％的乙醇水溶液洗脱，收集体积分数为70％的乙醇水溶液洗脱时所得洗脱液，依次进行浓缩和冷冻干燥，得到锁阳粗多糖；
[0089]
采用sevage法对所述锁阳粗多糖进行脱蛋白，得到锁阳精多糖。
[0090]
实施例2cs-p1～cs-p5的分离鉴定
[0091]
将实施例1制备的锁阳精多糖经纤维素柱(deae-52)进行极性分离，其中，所述纤维素柱使用前先将deae-52填料用0.5m的盐酸浸泡1h，以去除所述deae-52填料中的杂质，然后用5倍柱体积的蒸馏水在流速为15ml/min条件下洗脱至中性，之后调整蒸馏水流速为5ml/min平衡2h；将所述锁阳精多糖与蒸馏水混合，加热至40℃，在1000rpm条件下涡旋
5min，之后在12000rpm条件下离心10min，取上清液上样，调整洗脱剂流速为15ml/min，依次用蒸馏水、0.2m的nacl水溶液、0.5m的nacl水溶液、1.0m的nacl水溶液洗脱，每种洗脱剂用量为3倍柱体积，采用苯酚硫酸法进行追踪检测，收集对称峰对应的洗脱液，经浓缩后采用3500da透析袋在纯水中透析，冷冻干燥后得到的组分记为cs-p-w组分、cs-p-0.2m组分、cs-p-0.5m组分以及cs-p-1.0m组分(分别对应蒸馏水、0.2m的nacl水溶液、0.5m的nacl水溶液以及1.0m的nacl水溶液洗脱时所得洗脱液)；
[0092]
将所述cs-p-w组分、cs-p-0.2m组分、cs-p-0.5m组分以及cs-p-1.0m组分分别经葡聚糖凝胶柱(sugar-brt-103)进行纯化，所用洗脱剂为0.2m的nacl水溶液，结合示差检测器在线检测收集，收集对称峰对应的纯化液，通过旋转蒸发仪浓缩后进行冷冻干燥，得到的化合物记为cs-p1、cs-p2、cs-p3、cs-p4和cs-p5，其中，所述cs-p-w组分经纯化得到cs-p1和cs-p5，所述cs-p-0.2m组分经纯化得到cs-p2，所述cs-p-0.5m组分经纯化得到cs-p3，所述cs-p-1.0m组分经纯化得到cs-p4；cs-p1、cs-p2、cs-p3、cs-p4和cs-p5的重均分子量分别为：1394500、482500、715000、1470000、9609。
[0093]
所述cs-p1、cs-p2、cs-p3、cs-p4和cs-p5的碳谱和氢谱的归属数据如表1～5所示。
[0094]
表1cs-p1中主要片段的碳谱和氢谱数据归属表
[0095][0096][0097]
表2cs-p2中主要片段的碳谱和氢谱数据归属表
[0098][0099]
表3cs-p3中主要片段的碳谱和氢谱数据归属表
[0100][0101]
表4cs-p4中主要片段的碳谱和氢谱数据归属表
[0102][0103]
表5cs-p5中主要片段的碳谱和氢谱数据归属表
[0104][0105][0106]
实施例3生物活性实验
[0107]
1、对5型磷酸二酯酶的体外抑制活性
[0108]
本实施例参照文献方法(a label-free lc/ms-based enzymatic activity assay forthe detection ofpde5ainhibitors，front chem.2023，13；11：1097027)测定了锁阳精多糖及5种多糖化合物(化合物cs-p1～cs-p5)对5型磷酸二酯酶(pde5)及其他磷酸二酯酶家族成员的体外抑制活性，具体结果如表6所示，表6中数据均为至少3次实验的平均值。由表6可知，锁阳精多糖及5种多糖化合物能够抑制5型磷酸二酯酶，而对其他磷酸二酯酶亚型无抑制活性，表明锁阳精多糖及5种多糖化合物对5型磷酸二酯酶具有选择性抑制活性。
[0109]
表6锁阳精多糖及5种多糖化合物对5型磷酸二酯酶的体外抑制活性数据
[0110][0111]
2、血清中cgmp水平的检测
[0112]
将42只sd大鼠平均分为1个对照组(n＝6，给与生理盐水)和6个给药组(n＝6)，给药组分别经灌胃给药给予100mg/kg剂量的锁阳精多糖及5种多糖化合物(化合物cs-p1～cs-p5)。眼眶采血1ml放入已灭菌离心管中，静置1h后通过离心获得血清样品，然后用试剂盒测定cgmp的含量。
[0113]
表7为大鼠服用锁阳精多糖及5种多糖化合物后血液中cgmp含量的变化数据，结果显示，相对于对照组，给予锁阳精多糖及5种多糖化合物后均能显著提升大鼠血清中cgmp的含量，可见锁阳精多糖及5种多糖化合物在大鼠体内可以抑制cgmp的代谢，与pde5抑制剂的功效相符。
[0114]
表7大鼠服用锁阳精多糖及5种多糖化合物后血液中cgmp含量
[0115][0116]
3、对肺动脉高压的治疗效果
[0117]
通过低氧诱导的方法建立低氧性肺动脉高压模型来测试锁阳精多糖及5种多糖化合物(化合物cs-p1～cs-p5)的治疗活性。分组方法：将48只雄性sd大鼠平均分为8个组，具体为常氧对照组(n＝6)、模型组(n＝6)、模型+锁阳多糖组(锁阳精多糖及5种多糖化合物，n＝6，剂量为100mg/kg)。模型建立方法：sd大鼠放入低压氧舱中，在压力47.3kpa、相对氧浓度10％的条件下喂养2周。肺动脉压力测定方法：各组大鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后平卧位固定于手术台上，待生命体征稳定后打开胸腔，充分暴露肺脏和心脏，用充满肝素化生理盐水的硬质聚乙烯导管迅速插入右心室，导管另一端与powerlab数据采集分析系统相连监测压力变化。
[0118]
表8为大鼠服用锁阳精多糖及5种多糖化合物后压力变化数据，结果显示，大鼠经低氧诱导后肺动脉压力显著增高，表明造模成功，经锁阳精多糖及5种多糖化合物治疗后肺动脉压力明显下降，表明锁阳精多糖及5种多糖化合物具有显著降低肺动脉压力的活性。
[0119]
表8大鼠服用锁阳精多糖及5种多糖化合物后压力数据
[0120][0121]
4、对性机能改善的活性
[0122]
本实验主要观察雄性大鼠给予锁阳精多糖及5种多糖化合物(化合物cs-p1～cs-p5)之后性行为指标的变化，主要包括捕捉次数(自雌性大鼠放入笼中后，雄性大鼠捕捉雌性大鼠的次数)、爬跨次数(自雌性大鼠放入笼中后，雄性大鼠出现爬跨行为的次数)，具体实验设计如下：将42只雄性sd大鼠平均分为7个组，具体为1个对照组(n＝6，给与等体积生理盐水)和6个给药组(n＝6，剂量为100mg/kg)，其中给药组为将锁阳精多糖及5种多糖化合物分别配制成水溶液并按10ml/kg的给药量一次性灌胃给药。行为观察实验前10min，先将一只雄性实验大鼠放入行为观测箱中适应，适应结束后，将摄像机打开，然后再放入一只发情的雌性大鼠进行拍摄，行为拍摄的时间为1h。
[0123]
表9为大鼠服用锁阳精多糖及5种多糖化合物后捕捉次数以及爬跨次数，结果显示，给与锁阳精多糖及5种多糖化合物之后，相对于对照组，大鼠的捕捉次数和爬跨次数均有显著提高，说明锁阳精多糖及5种多糖化合物对性机能有改善作用。
[0124]
表9大鼠服用锁阳精多糖及5种多糖化合物后捕捉次数以及爬跨次数
[0125]
组别捕捉次数爬跨次数精多糖9.33
±
2.717.20
±
1.50cs-p112.04
±
1.859.14
±
1.45cs-p214.50
±
1.6110.45
±
1.02cs-p315.52
±
2.7012.82
±
0.98cs-p413.60
±
2.9513.40
±
1.40cs-p516.84
±
2.2613.23
±
1.30对照组7.89
±
1.595.05
±
0.80
[0126]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种锁阳精多糖的制备方法，包括以下步骤：采用乙醇水溶液对锁阳进行提取，将所得提取液进行浓缩，得到醇提物；采用石油醚对所述醇提物进行脱脂，得到脱脂渣；将所述脱脂渣与水混合进行静置，将所得上清液进行大孔树脂柱层析分离，所用洗脱剂依次为体积分数为10％和20～80％的乙醇水溶液，收集体积分数为20～80％的乙醇水溶液洗脱时所得洗脱液，依次进行浓缩和干燥，得到锁阳粗多糖；将所述锁阳粗多糖进行脱蛋白，得到锁阳精多糖。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述提取所用乙醇水溶液的体积分数为70～90％；所述提取在回流条件下进行，所述提取的次数为2～5次，每次提取的时间为1.5～5h，每次提取的料液比为1g：5～20ml。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述脱脂在煮沸条件下进行，所述脱脂的次数为3～8次，每次脱脂的时间为10～60min，每次脱脂的料液比为1g：5～10ml。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述大孔树脂柱层析分离采用的大孔吸附树脂为非极性大孔聚苯乙烯吸附树脂。5.权利要求1～4任一项所述制备方法制备得到的锁阳精多糖。6.一种锁阳多糖化合物，具有式v所示链接方式：7.权利要求6所述锁阳多糖化合物的制备方法，包括以下步骤：以水为洗脱剂，采用纤维素柱对权利要求5所述锁阳精多糖进行极性分离，将所得洗脱液依次进行浓缩、透析与干燥，得到水洗脱组分；以浓度为0.1～0.3mol/l的氯化钠水溶液为洗脱剂，采用葡聚糖凝胶柱对所述水洗脱组分进行纯化，得到具有式v所示链接方式的锁阳多糖化合物。8.锁阳多糖化合物、其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、前药化合物、多晶型物、对映异构体或权利要求5所述锁阳精多糖在制备5型磷酸二酯酶抑制剂中的应用，所述锁阳多糖化合物具有式i、式ii、式iii、式iv或式v所示链接方式：
→
3)-α-d-araf-(1
→
3)-α-d-glcp-(1
→
4)α-d-galpa6me-(1
→ꢀ
式i；
→
α-glcp-(1
→
6)-α-glcp-(1
→
3)-α-glcp-(1
→
6)-α-glcp-(1
→
6)-α-glcp-(1
→ꢀ
式iii；
9.锁阳多糖化合物、其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、前药化合物、多晶型物、对映异构体或权利要求5所述锁阳精多糖在制备防治人或兽与5型磷酸二酯酶相关的疾病的药物中的应用，所述锁阳多糖化合物具有式i、式ii、式iii、式iv或式v所示链接方式：
→
3)-α-d-araf-(1
→
3)-α-d-glcp-(1
→
4)α-d-galpa6me-(1
→ꢀ
式i；
→
α-glcp-(1
→
6)-α-glcp-(1
→
3)-α-glcp-(1
→
6)-α-glcp-(1
→
6)-α-glcp-(1
→ꢀ
式iii；式iii；10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述与5型磷酸二酯酶相关的疾病包括肺动脉高压、男性勃起功能障碍、男性睾丸缺血、女性性功能障碍、痛经、良性前列腺增生、缺血性心绞痛、高血压、阿尔兹海默症、动脉硬化、中风、动脉硬化性闭塞、动脉栓塞、慢性哮喘、支气管炎、变应性哮喘、过敏性鼻炎、青光眼或特征为肠动力紊乱的疾病。

技术总结
本发明提供了一种锁阳精多糖、锁阳多糖化合物及制备方法和应用，属于医药技术领域。本发明采用乙醇水溶液对锁阳进行提取，将所得提取液进行浓缩，得到醇提物；采用石油醚对所述醇提物进行脱脂，得到脱脂渣；将所述脱脂渣与水混合进行静置，将所得上清液进行大孔树脂柱层析分离，最终得到锁阳粗多糖，经脱蛋白得到锁阳精多糖，在此基础上还可以进一步分离纯化得到锁阳多糖化合物。本发明中锁阳精多糖以及锁阳多糖化合物对5型磷酸二酯酶抑制活性高，选择性好，且为天然植物多糖，具有毒副作用小以及价格低廉的特点。以及价格低廉的特点。


技术研发人员：张寿德 张丽蓉 马玉凤 张峰森 王君 水金漫 齐丹诗 白洁
受保护的技术使用者：青海大学
技术研发日：2023.05.19
技术公布日：2023/7/27