大豆百粒重与尺寸相关的SNP位点、分子标记、扩增引物及其应用

大豆百粒重与尺寸相关的snp位点、分子标记、扩增引物及其应用
技术领域
1.本发明属于大豆分子生物学及分子育种技术领域，具体涉及大豆百粒重与尺寸相关的snp位点、分子标记、扩增引物及其应用。


背景技术：

2.大豆是世界最重要的粮油兼用作物，培育高产大豆品种是我国大豆产业发展的关键。从遗传角度讲大豆的产量是极其复杂的综合性状，由多个具体数量性状组成，常规育种手段来提高大豆单产效率低，且幅度有限。但随着，分子生物学技术的发展与完善，基因精细调控技术能够实现优异等位基因的聚合和高效利用，是突破性大品种选育最为关键的技术，也是未来提升大豆品种育种能力的必要手段。优异等位基因积累及其对应的分子标记的开发，是实现基因的精细调控与聚合的先决条件。
3.大豆百粒重是决定大豆产量的重要指标；同时籽粒大小也与种子的萌发活力相关；种子大小也是影响大豆最终用途的重要因素，小种子更适合纳豆和豆芽，而大种子更适合蔬菜大豆和豆腐。因此，发掘大豆百粒重优异等位基因的分子标记，不但能够为高产大豆的优异等位基因的聚合提供技术储备，也可为基因精细调控技术改良大豆品质提供明确指导。
4.近年，伴随测序技术的发展，研究者对大豆基因组有了较全面的认识。全基因组关联分析(genome-wide association studies，gwas)是当前研究生物基因组的先进方法，通过对大规模的群体dna样本进行全基因组高密度遗传标记(如snp或cnv等)分型，从而寻找与生物表型相关基因的研究方法。lam等对17株野生大豆和14株栽培大豆的基因组重测序，发现了630多万个snps。目前关联分析已广泛应用于植物研究，如大豆籽粒蛋白质含量，水稻氨基酸组分，黑小麦铝毒抗性等。近年利用gwas开发目标性状功能标记，已成为分子生物学研究的热点之一。分子标记辅助选择可显著提高大豆品种遗传改良进程。
5.迄今为止，通过连锁分析对大豆百粒重与大小相关基因进行数量性状基因位点(quantitative trait locus，qtl)定位研究，截至目前，在所有20条染色体上有超过304个百粒重qtl已登录在大豆基因组数据库。然而，绝大多数qtl是微效位点且未经验证，其中很大一部分是重复定位。并且采用相对较落后的ssr、aflp、rflp和rapd等低密度分子标记构建遗传图谱，位点不够精确；其次当前功能位点涉及到的分子标记多数来源于重组自交系或单一父母本构建群体，这些标记应用到杂交品种和地方品种等自然群体时，往往不能够作为分子标记辅助育种使用，也无法解释位点在自然群体中的遗传贡献率。
6.因此，有必要寻找一种标记能够更精准定位区间及广泛应用不同栽培大豆群体的杂交父母本筛选大豆种子重量和尺寸相关的snp(single nucleotide polymorphism，单核苷酸的多态性)分子标记，进而应用到大豆产量及品质遗传改良的育种过程中。


技术实现要素：

7.本发明的目的之一是提供大豆百粒重与尺寸相关的snp位点，所述snp位点位于大豆4号染色体的6,606,131bp(参考基因组为g.max wm82.a2.v1)，多态性为a或t，所述snp位点的多态性为a的植株较多态性为t的植株的百粒重与尺寸更高，该位点在过往的研究及相关专利未见报道。
8.本发明的目的之二是提供含有所述snp位点的分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如seq id no.1所示，该序列第200bp的简并碱基w为a或t，该区域在过往的研究及相关专利未见报道，属于共显性的标记，可靠且使用方便，这为大豆高产及品质改良育种工作提供了极大的便利。
9.本发明的目的之三是提供所述分子标记的扩增引物，所述扩增引物的核苷酸序列如seq id no.2-3所示。
10.本发明的目的之四是提供所述snp位点、所述分子标记或所述扩增引物在筛选或鉴定高百粒重与尺寸大豆品系中的应用。
11.本发明的目的之五是提供所述snp位点、所述分子标记或所述扩增引物在大豆分子育种、培育转基因大豆、大豆种质资源鉴定中的应用。
12.本发明的目的之六是提供一种鉴定不同大豆百粒重与籽粒大小品系的方法，包括以下步骤：
13.以待测大豆的基因组dna为模板，使用所述的扩增引物进行pcr扩增，若扩增产物的第200bp为a，则为高百粒重与尺寸大豆品系，若扩增产物的第200bp位为t，则为低百粒重与尺寸大豆品系。
14.本发明具有如下有益效果：
15.本发明的snp位点的百粒重贡献率为15.49-19.62％，加性效应为3.56-4.41g。以snp位点开发了相应的分子标记，利用该标记在东北核心种质资源样本群进行选择，可筛选到2020年和2021年75％该标记序列的第200bp为a的品系百粒重高于17.58g和18.92g，精确度可达75％，大大减少了选择成本，提高了百粒重等籽粒大小相关品质改良育种工作的效率。
附图说明
16.图1为350份关联群体2年(e1:2021年，e2：2020年)百粒重(100sw)、粒宽(sw)、粒厚(st)分布图，横坐标表示大豆籽粒百粒重、粒宽、粒重，纵坐标表示样品个体数。
17.图2为基于snp，通过admixture软件，得到的关联群体的群体结构图。
18.图3为350份自然群体2年大豆百粒重、粒宽、粒厚的mlm关联分析结果曼哈顿图，纵坐标为p-value的负对数(-log
10
(p))，横坐标为染色体，一个点代表一个snp位点；虚线为1/snp数目的负对数，高于虚线的点，表明对应的snp标记与百粒重显著相关，其中4号染色体虚线上箭头指向点对应的是6,606,131bp snp。
19.图4为350份自然群体2年大豆百粒重、粒宽、粒厚的分子标记对应的大豆百粒重、粒宽、粒厚表型差异box图。
具体实施方式
20.下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
21.本发明中收集测定我国40
°
n以北的大豆种质资源3000份，均由吉林省农业科学院大豆研究所栽培大豆种质资源研究团队组收集、评价，并保存于吉林省农业科学院种质资源库。
22.实施例1：大豆种子百粒重关联群体的构建及性状测定
23.本实施例中使用大豆种质资源库内3000份种质资源，其来源地涵盖我国高纬度(40
°
n以北)大豆主产区的大部分，包括黑龙江省、吉林省、辽宁省、内蒙古、新疆等。田间种植3000份资源，待种子完全成熟后，收获种子，每个品种随机选取20粒有代表性的种子进行测量。3000份资源的百粒重、籽粒长宽高在群体内符合正态分布，遗传多样指数为3.90。从中抽取350份资源，百粒重遗传多样指数仍为3.90，将350资源作为关联群体。其操作步骤如下：
24.根据群体百粒重平均值(x)和标准差(δ)分为10类群，1类《x-2δ，10类≥x+2δ，中间每类相差0.5δ。各性状的遗传多样性采用shannon's信息指数(h')进行评价，h'＝-σpilnpi，pi表示第i种变异出现的频率，通过计算3000份资源百粒重的遗传多样性为3.90。
25.在每个类群随机抽取35份资源，计算350份资源的遗传多样指数h'，当等于3.90时，即确定这350资源为关联群体，该群体的百粒重呈正态分布(图1)。
26.实施例2：大豆百粒重与籽粒大小全基因组关联分析
27.(1)用ctab法提取关联群体的350份资源单株叶片dna，用thermo nanodrop 2000检测dna浓度并用1％琼脂糖电泳检测dna纯度及完整性，要求无降解，无蛋白质、多糖等杂质污染，浓度达100ng/ul以上。
28.(2)利用安诺优达基因有限公司的全基因组重测序技术对350份资源进行全基因组重测序，具体操作如下：
29.1)酶切方案：利用酶切预测软件对已公布大豆参考基因组进行酶切预测，选择内切酶rsai和haeiii对检测合格的各样品基因组进行酶切，选择基因组片段范围在364-414bp的slaf片段。
30.(1)2)测序流程：对得到的slaf片段用klenow fragment(3
′→5′
exo
–
)(neb)和datp在37℃下进行3
′
端加a处理、连接dual-index测序接头、pcr扩增(pcr扩增引物：f：aatgatacggcgaccaccga；r：caagcagaagacggcatacg)、纯化(agencourt ampure xp beads(beckman coulter,high wycombe,uk))、混样、切胶选取目的片段，文库质检合格后用illuminahiseqtm进行测序。为评估建库实验的准确性，选用大豆(
‘
williams 82’:g.max wm82.a2.v1)作为对照(control)进行相同的处理参与建库和测序，共获得112g reads数据，测序平均q30为92.20％。
31.3)根据测序reads在参考基因组上的定位结果，gatk进行局部重比对(local realignment)、gatk变异检测，samtools变异检测，取gatk和samtools两种方法得到的交集变异位点等步骤，以保证检测得到的snp的准确性。以两种方法得到的snp标记交集作为最终可靠的snp标记数据集，共得到3,306,713个群体snp。
32.(3)系统发育树用来表示物种之间的进化关系，根据各类生物间的亲缘关系的远近，把各类生物安置在有分枝的树状的图表上，简明地表示生物的进化历程和亲缘关系。基于snp，通过mega5软件，neighbor-joining算法，构建样品的群体进化树。
33.(4)群体遗传结构分析能够提供个体的血统来源及其组成信息，是一种重要的遗传关系分析工具。基于snp，通过admixture软件，分析样品的群体结构(图2)，分别假设样品的分群数(k值)为1-16，进行聚类。并对聚类结果进行交叉验证，根据交叉验证错误率的谷值确定最优分群数为8。
34.(5)基于snp，通过tassel5软件，进行主成分分析(principal components analysis，pca)分析，得到样品的主成分聚类情况。通过pca分析，能够得知哪些样品相对比较接近，哪些样品相对比较疏远，可以辅助进化分析。
35.(6)使用plink软件可以对自然群体两两个体间的亲缘关系(relative kinship)进行估计。亲缘关系本身是定义两特定材料之间的遗传相似度与任意材料之间的遗传相似度的相对值，因此当结果出现两材料之间的亲缘关系值小于0时，则直接定义为0。
36.(7)基于关联群体snp分子标记数据、遗传结构数据、kinship矩阵数据以及蛋氨酸含量数据，利用gapit软件的混合线性模型((mixed linear model，mlm)进行全基因组关联分析(genome wide association study，gwas)。x为基因型，y为表型，最终每个snp位点都能得到一个关联结果(图3)，以-log
10
(p)≥6.58为筛选标准，在4号染色体的6,606,131bp得到与百粒重与粒宽、粒厚显著关联的snp标记(a/t)，详细信息如表1所示。
37.表1大豆籽粒百粒重(100sw)与粒宽(sw)、粒厚(st)显著关联snp信息
[0038][0039]
实施例3：大豆百粒重和籽粒大小显著关联snp标记的应用
[0040]
与大豆百粒重紧密连锁的snp标记为4号染色体的6,606,131bp(a/t)，命名为qsw4-1，其是以待鉴定材料的基因组dna作为模板，以qsw4-1引物进行pcr扩增所得的片段；qsw4-1的核苷酸序列如seq id no.1所示，该序列第200bp的简并碱基w为a或t。
[0041]
其中，扩增引物为：
[0042]
qsw4-1-f：5
’‑
ttgcgtacatgaggacatgc-3’(seq id no.2)
[0043]
qsw4-1-r：5
’‑
tctcagtgttgcccacctatt-3’(seq id no.3)
[0044]
利用上述snp分子标记辅助判断品种后代百粒重及籽粒大小的具体步骤如下：
[0045]
(1)利用ctab法提取待鉴定材料基因组dna
[0046]
1)取大豆新鲜叶片加入液氮研磨成粉状，取适量放入1.5ml离心管中。
[0047]
2)加入0.6ml预热的ctab提取液，颠倒混匀几次，在65℃的温度下水浴一小时，每15min混匀一次，12000rpm离心15min。
[0048]
3)加入0.6ml 24：1(v/v)的氯仿：异戊醇溶液，颠倒混匀5-10次，10000rpm离心15min。
[0049]
4)取上清溶液转移到另外一个空的离心管中，用24:1(v/v)的氯仿：异戊醇溶液重新抽提一次，然后加50μl rnase(10mg/ml)室温下放置30min。
[0050]
5)加等体积-20℃预冷的异丙醇，于-20℃冰箱中30min，5000rpm离心10min去上清。
[0051]
6)用70％乙醇清洗两次。吹干后用灭菌水溶解，得到基因组模板dna，将基因组模板dna放入4℃冰箱保存备用。
[0052]
7)用0.8％的琼脂糖检测dna的浓度，稀释到工作浓度用于pcr扩增。
[0053]
2.利用snp标记引物进行pcr扩增，得到扩增产物。
[0054]
1)pcr扩增体系：总体积为20μl，包括10-50ng基因组模板dna 3μl，10μl quick taq hs dyemix，10pmol的引物各2μl和ddh2o 3μl。
[0055]
2)pcr扩增条件：94℃预变性30s，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min；循环30次；72℃终延伸10min。
[0056]
3.根据序列比对结果判断种子百粒重
[0057]
将扩增产物进行测序分析，扩增产物自5
′
端第200bp为a的品系亚群百粒重均值显著高于该位点为t的品系亚群均值(图4)。其中，2020年和2021年75％第200bp为a的品系百粒重高于17.58g和18.92g。这表明该标记用于辅助选择是切实有效的。
[0058]
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0059]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

技术特征：
1.大豆百粒重与尺寸相关的snp位点，其特征在于，所述snp位点位于大豆4号染色体的6,606,131bp，多态性为a或t。2.根据权利要求1所述的snp位点，其特征在于，所述snp位点的多态性为a的植株较多态性为t的植株的百粒重与尺寸更高。3.含有权利要求1所述snp位点的分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如seq id no.1所示，该序列第200bp的简并碱基w为a或t。4.权利要求3所述分子标记的扩增引物，其特征在于，所述扩增引物的核苷酸序列如seq id no.2-3所示。5.权利要求1所述snp位点、权利要求3所述分子标记或权利要求4所述扩增引物在筛选或鉴定高百粒重与尺寸大豆品种资源中的应用。6.权利要求1所述snp位点、权利要求3所述分子标记或权利要求4所述扩增引物在大豆分子育种、培育转基因大豆、大豆种质资源鉴定中的应用。7.一种鉴定不同大豆百粒重与籽粒大小品系的方法，其特征在于，包括以下步骤：以待测大豆的基因组dna为模板，使用权利要求4所述的扩增引物进行pcr扩增，若扩增产物的第200bp为a，则为高百粒重与尺寸大豆品系，若扩增产物的第200bp为t，则为低百粒重与尺寸大豆品系。

技术总结
本发明属于大豆分子生物学及分子育种技术领域，具体涉及大豆百粒重与尺寸相关的SNP位点、分子标记、扩增引物及其应用。所述SNP位点位于大豆4号染色体的6,606,131bp，多态性为A或T，所述SNP位点的多态性为A的植株较多态性为T的植株的百粒重与尺寸更高。所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述分子标记的扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2-3所示，本发明SNP位点对百粒重贡献率为15.49-19.62％，加性效应为3.56-4.41g。以SNP位点开发了相应的分子标记，利用该标记在东北核心种质资源样本群中进行选择，可筛选到2020年和2021年75％该分子标记第200bp为A的品系百粒重高于17.58g和18.92g，精确度可达75％，大大减少了选择成本，提高了百粒重等籽粒大小相关品质改良的效率。品质改良的效率。品质改良的效率。


技术研发人员：刘德泉 聂波涛 王跃强 邱红梅 张伟 陈亮 陈健 崔正果 王新风
受保护的技术使用者：吉林省农业科学院
技术研发日：2023.05.09
技术公布日：2023/7/27