一种标记19-去甲睾酮抗体的胶体金探针的制备方法及其应用与流程

1.本发明涉及兽药残留检测技术领域，具体地，涉及一种标记19-去甲睾酮抗体的胶体金探针的制备方法及其应用。


背景技术：

2.19-去甲睾酮(19nt)，又名诺龙，分子式为c18h16o2,分子量为274.40，是一种具有雄性激素功能特质的类固醇激素。19-去甲睾酮作为合成代谢雄激素类固醇、在临床上可以用作治疗男性性功能减退症，同时还有增加体重、肌肉大小，力量、蛋白质含量的功效。19-去甲睾酮能显著提高饲料利用率，促进猪牛的瘦肉生长和蛋白质合成，曾被用作生长促进剂在畜牧业中使用。由于其蓄积性强，易在肝、肾和其他器官残留堆积，影响原有的激素平衡，造成功能损伤。在我国农业农村部2019年发布了新的食品安全国家标准gb 31650-2019中明确规定了19-nt在禽畜产品中不得检出。因此，开发有效的快速检测19-去甲睾酮方法对监控畜禽食品质量安全尤为重要。
3.目前，针对19-去甲睾酮的检测方法有多种，包括含高效液相色谱-质谱法(hplc-ms/ms)、超高效液相色谱-串联质谱法(uplc-ms/ms)等在内的仪器分析方法、光谱检测法以及免疫分析法等。仪器方法灵敏度高、特异性强，但需要昂贵的设备、专业的操作人员和繁琐的样品前处理过程，不适合大量样本的快速筛查；免疫分析技术作为大型仪器验证分析的重要互补检测技术，已得到广泛发展，其中免疫层析方法以其简便快捷、可现场检测等优点，备受市场青睐。免疫层析法是将免疫和色谱层析技术相结合的检测方法，以标记物标记的抗体与目标待测物特异性结合为基础并通过标记物信号实现定性或定量的目的。该方法检测时间短，使用方便，前处理简单，成本低，检测效果能满足需求，适合用于食品样品的现场检测。
4.检测19-nt在食品样品中残留的免疫层析检测方法主要为仪器检测法，关于19-nt的胶体金免疫层析检测方报导较少，而且目前涉及的检测效果不佳，缺乏一种高灵敏度的单克隆抗体。因此，亟待开发一种针对猪尿、牛尿样品中19-nt药物残留的高灵敏度快速检测方法。


技术实现要素：

5.为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种标记19-去甲睾酮抗体的胶体金探针的制备方法及其应用。
6.本发明的第一个目的是提供一种标记19-去甲睾酮抗体的胶体金探针的制备方法。
7.本发明的第二个目的是提供上述制备方法制得的胶体金探针。
8.本发明的第三个目的是提供上述胶体金探针在制备检测19-去甲睾酮的试剂盒中的应用。
9.本发明的第四个目的是提供一种检测19-去甲睾酮的系统。
10.本发明的第五个目的是提供一种检测19-去甲睾酮的试剂盒。
11.本发明的第六个目的是提供一种检测19-去甲睾酮的方法。
12.为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
13.胶体金免疫层析方法以镧系元素离子螯合物为示踪物，能有效消除由生物材料短寿命自荧光引起的背景干扰，灵敏度高、稳定性好、样品前处理简单，准确性强，是一种较为理想的快速检测方法。本发明以胶体金粒子为示踪物标记19-去甲睾酮单克隆抗体，选择合适的荧光微球粒径，活化缓冲溶液的ph值，抗体稀释液和抗体用量，制备标记19-去甲睾酮单克隆抗体的胶体金微球探针，能有效提高胶体金颗粒与19-去甲睾酮单克隆抗体的结合效率，促进标记抗体的胶体金探针在试纸条上的释放，提高其检测灵敏度，减少抗原、抗体用量。
14.本发明建立的胶体金免疫层析方法，将游离的待检物与标记抗体在微孔中反应一段时间后插入已经组装好的试纸条，在毛细作用下试纸条上的样品向吸水垫方向层析，没有和药物结合的胶体金标记抗体再移动至固定抗原的区域，使t线显色；标记抗体和待检物形成的结合物与nc膜上的羊抗鼠特异性结合使c线显色，根据肉眼观察显色结果和读卡仪进行定性和定量记录。
15.一种标记19-去甲睾酮抗体的胶体金探针的制备方法，包括以下步骤：
16.s1.氯金酸与柠檬酸三钠按照用量比1：(2～6)充分反应，调节ph至5.0～7.0，即得到胶体金溶液；所述胶体金溶液含有粒径为30nm～42nm的胶体金；
17.s2.将19-去甲睾酮抗体与步骤s1所得胶体金溶液充分反应；
18.s3.将牛血清白蛋白与步骤2所得产物充分反应后，10000rpm～14000rpm离心10min～20min，收集沉淀即得到标记19-去甲睾酮抗体的胶体金探针。
19.优选地，步骤s1中，所述胶体金溶液含有粒径为36nm的胶体金。
20.优选地，步骤s1中，所述柠檬酸三钠还原法包括以下步骤：将氯金酸与柠檬酸三钠按照用量比1：4充分反应。
21.更优选地，步骤s1中，所述将1％w/v氯金酸溶液和1％w/v柠檬酸三钠溶液按照体积比为1：(2～6)充分反应。
22.进一步优选地，步骤s1中，所述1％w/v氯金酸溶液和1％w/v柠檬酸三钠溶液按照体积比为1：4充分反应。
23.优选地，步骤s1中，用k2co3溶液调节ph至5.0～7.0。
24.更优选地，所述k2co3溶液的浓度为0.15mol/ml～0.25mol/ml。
25.进一步优选地，步骤s1中，用k2co3溶液调节ph至7.0。
26.最优选地，步骤s1中，用0.2mol/ml k2co3溶液调节ph至7.0。
27.具体的，步骤s1，将1ml 1％w/v氯金酸水溶液与4ml 1％w/v柠檬酸三钠水溶液充分混合，得到胶体金溶液，再加入20μl 0.2mol/ml k2co3溶液调节ph＝7.0，23℃恒温摇床600rpm振荡5min，即得到胶体金溶液。所得胶体金溶液中，胶体金的粒径为36nm。
28.优选地，步骤s2中，所述19-去甲睾酮抗体为19-去甲睾酮单克隆抗体。
29.更优选地，步骤s2中，所述19-去甲睾酮单克隆抗体用0.01mol/l pbs溶液稀释至浓度为1mg/ml。
30.进一步优选地，步骤s2中，将1mg/ml 19-去甲睾酮单克隆抗体与步骤s1所得胶体金溶液按照体积比为(4μl～12μl)：1ml充分反应。
31.更进一步优选地，步骤s2中，将1mg/ml 19-去甲睾酮单克隆抗体与步骤s1所得胶体金溶液按照体积比为(6μl)：1ml充分反应。
32.具体的，步骤s2，取1ml步骤s1所得胶体金溶液与10μl 1mg/ml 19-nt单克隆抗体，23℃恒温摇床600rpm振荡活化5min，即得到标记19-nt单克隆抗体的胶体金溶液。
33.优选地，步骤s3中，将牛血清白蛋白与步骤2所得产物充分反应后，12000rpm离心15min，收集沉淀。
34.具体的，步骤s3，将步骤s2所得产物，即19-nt单克隆抗体的胶体金溶液，与10μl 10％w/v牛血清白蛋白水溶液，23℃恒温摇床600rpm振荡封闭5min，于4℃12000rpm条件下离心15min，弃上清，所得沉淀即为标记19-去甲睾酮单克隆抗体的胶体金探针。
35.任一上述制备方法制得的胶体金探针也应在本发明的保护范围之内。
36.上述胶体金探针在制备检测19-去甲睾酮的试剂盒中的应用也应在本发明的保护范围之内。
37.一种检测19-去甲睾酮的系统，包括上述胶体金探针以及t线上包被有19-去甲睾酮抗原和c线上包被有二抗的免疫层析试纸条；所述19-去甲睾酮抗原即19-nt-o-ova，其结构式如式(ⅱ)所示，
[0038][0039]
优选地，所述免疫层析试纸条的t线包被有0.10mg/ml～0.25mg/ml的19-去甲睾酮抗原。
[0040]
更优选地，所述免疫层析试纸条的t线包被有0.15mg/ml的19-去甲睾酮抗原。
[0041]
优选地，所述免疫层析试纸条的c线包被有0.4mg/ml～0.6mg/ml的二抗。
[0042]
更优选地，所述免疫层析试纸条的c线包被有0.4mg/ml～0.6mg/ml的羊抗鼠igg。
[0043]
进一步优选地，所述免疫层析试纸条的c线包被有0.5mg/ml的羊抗鼠igg。
[0044]
优选地，所述免疫层析试纸条的样品垫经过0.1％v/v～0.4％v/v tween-20水溶液充分浸泡。
[0045]
更优选地，所述免疫层析试纸条的样品垫经过0.3％v/v tween-20水溶液充分浸泡。
[0046]
具体的，所述免疫层析试纸条的的制备方法包括以下步骤：
[0047]
用含有0.15mol/l nacl的0.02mol/l pb溶液(ph＝7.4)，分别稀释结构式如式(ⅱ)所示的19-去甲睾酮抗原和羊抗鼠igg，
[0048][0049]
通过喷金划膜仪分别将0.15mg/ml的19-nt-o-ova以0.9μl/cm划到硝酸纤维素膜的t线上，作为包被原；将0.35mg/ml羊抗鼠igg以0.9μl/cm划到硝酸纤维素膜的c线上，作为二抗；之后放入37℃烘箱干燥14h，并在阴凉干燥处密封保存备用；
[0050]
将玻璃纤维膜浸泡于0.3％v/v tween-20溶液中，充分浸泡后取出玻璃纤维膜，垂直放置，直至不再有液体滴落；之后水平放置于37℃的烘箱中烘干14h，即得到样品垫，在干燥阴凉处密封保存备用；
[0051]
在聚氯乙烯板上贴上划线后的硝酸纤维素膜，再贴上吸水纸和本实施例步骤2得到的样品垫，其中硝酸纤维素膜的一端与步样品垫重叠1mm～2mm，硝酸纤维素膜的另一端与吸水纸重叠1mm～2mm；之后将其裁剪为宽度为3.6mm长度为8cm的条状备用，即得。
[0052]
任一上述系统在检测19-去甲睾酮中的应用也应在本发明的保护范围之内。
[0053]
一种检测19-去甲睾酮的试剂盒，包含任一上述制备方法制得的胶体金探针和任一上述的免疫层析试纸条。
[0054]
优选地，所述试剂盒包含胶体金样品槽，所述胶体金样品槽为含有任一上述制备方法制得的胶体金探针的酶标孔。
[0055]
更优选地，所述胶体金样品槽中的胶体金探针溶解于复溶液，所述复溶液为含有10％v/v tween-20、5％w/v蔗糖、0.5％w/v bsa、10％v/v聚乙烯吡咯烷酮和3％v/v proclin 300的0.02mol/l磷酸缓冲液。
[0056]
进一步优选地，胶体金样品槽中的溶解有胶体金探针的复溶液的含量为10μl/孔～15μl/孔。
[0057]
更进一步优选地，胶体金样品槽中的溶解有胶体金探针的复溶液的含量为15μl/孔。
[0058]
优选地，所述试剂盒还包含19-去甲睾酮标准品。
[0059]
优选地，所述试剂盒还包含0.01mol/l磷酸盐缓冲溶液和0.4mol/l磷酸缓冲液。0.01mol/l磷酸盐缓冲溶液用于稀释待测样品，0.4mol/l磷酸缓冲液用于稀释19-去甲睾酮标准品。
[0060]
一种检测19-去甲睾酮的方法，所述方法以非疾病治疗与诊断为目的，使用任一上述制备方法制得的胶体金探针和任一上述的免疫层析试纸条检测待测样品。
[0061]
优选地，所述方法包括以下步骤：
[0062]
待测样品与所述胶体金探针充分反应后，再与所述免疫层析试纸条的样品垫充分接触后，根据免疫层析试纸条的显色情况判定结果，具体判定方法如下：
[0063]
若t线和c线均有显色，则待测样品是不含有19-去甲睾酮的阴性样本；若c线显色，t线不显色，则待测样品是含有19-去甲睾酮的阳性样本；若c线不显色，无论t线是否显色，
检测结果均为无效。
[0064]
优选地，待测样品经过除杂和稀释得到供试品。
[0065]
更优选地，所述除杂的方法包括离心和过滤。
[0066]
进一步优选地，所述离心为3500r/min离心15min。
[0067]
进一步优选地，所述过滤为0.22μm滤膜过滤。
[0068]
优选地，待测样品与所述胶体金探针充分反应的方法为：将待测样品与胶体金探针充分混合均匀，26℃孵育5min。
[0069]
优选地，所述与所述免疫层析试纸条的样品垫充分接触，即为与所述胶体金探针充分反应的待测样品完全浸润疫层析试纸条的硝酸纤维素膜。
[0070]
优选地，用缓冲液19-去甲睾酮标准品稀释至不同的浓度后，采用与待测样品相同的检测方法，得到检测效果有效的免疫层析试纸条；再使用干式荧光免疫分析仪测定免疫层析试纸条的t线和c线的荧光强度，根据各19-去甲睾酮标准品的稀释液的浓度和对应t线和c线的吸光值拟合得到标准曲线及其公式；所述标准曲线以浓度为横坐标，t线和c线的吸光值的比值(即t/c值)为纵坐标。
[0071]
更优选地，使用干式荧光免疫分析仪测定待测样品的免疫层析试纸条的t线和c线的荧光强度，代入所得标准曲线的公式，即算出待测样品中19-去甲睾酮的浓度。
[0072]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0073]
本发明提供的标记19-去甲睾酮抗体的胶体金探针和检测19-去甲睾酮的免疫层析试纸条，并建立了相应的检测方法，仅需一次提取并稀释即可完成样品的前处理操作，不仅操作简单便捷，检测效率高，而且特异性好，灵敏度高，对猪尿和牛尿等样品中的19-去甲睾酮裸眼检测限为0.5ng/ml，定量检测限为0.12ng/ml～0.45ng/ml，回收率在88.6％～115.0％之间，相对标准偏差(rsd)在3.1％～11.1％之间。
附图说明
[0074]
图1为本发明实施例2检测19-去甲睾酮的免疫层析试纸条的结构示意图。
[0075]
图2为本发明实施例3检测19-去甲睾酮的方法的原理示意图。
[0076]
图3为胶体金粒径对检测19-去甲睾酮的方法的影响结果；a为免疫层析试纸条的显色情况，n＝3；b为显色强度及抑制率的情况；
①
为粒径42nm，
②
为粒径36nm，
③
为粒径30nm。
[0077]
图4为0.2mol/l k2co3溶液用量对检测19-去甲睾酮的方法的影响结果；a为免疫层析试纸条的显色情况；b为显色强度及抑制率的情况。
[0078]
图5为抗体稀释液对检测19-去甲睾酮的方法的影响结果；a为免疫层析试纸条的显色情况；b为显色强度及抑制率的情况；
①
为0.01mol/l pb溶液，
②
为含有0.5％w/v bsa的0.01mol/l pb溶液，
③
为0.01mol/l bb溶液，
④
为含有0.5％w/v bsa的0.01mol/l bb溶液，
⑤
为含有0.5％w/v bsa的水溶液，
⑥
为0.01mol/l pbs溶液。
[0079]
图6为抗体用量对检测19-去甲睾酮的方法的影响结果；a为免疫层析试纸条的显色情况；b为显色强度及抑制率的情况。
[0080]
图7为探针用量对检测19-去甲睾酮的方法的影响结果；a为免疫层析试纸条的显色情况；b为显色强度及抑制率的情况。
[0081]
图8为标准品稀释液对检测19-去甲睾酮的方法的影响结果；a为免疫层析试纸条的显色情况；b为显色强度及抑制率的情况；
①
为0.1mol/l pb溶液，
②
为0.2mol/l pb溶液，
③
为0.3mol/l pb溶液，
④
为0.4mol/l pb溶液，
⑤
为0.01mol/l pbs溶液。
[0082]
图9为离心速度对检测19-去甲睾酮的方法的影响结果；a为免疫层析试纸条的显色情况；b为显色强度及抑制率的情况。
[0083]
图10为离心时间对检测19-去甲睾酮的方法的影响结果；a为免疫层析试纸条的显色情况；b为显色强度及抑制率的情况。
[0084]
图11为包被原浓度对检测19-去甲睾酮的方法的影响结果；a为免疫层析试纸条的显色情况；b为显色强度及抑制率的情况。
[0085]
图12为样品垫处理液对检测19-去甲睾酮的方法的影响结果；a为免疫层析试纸条的显色情况；b为显色强度及抑制率的情况；
①
为0.1％v/v tween-20水溶液，
②
为0.2％v/v tween-20水溶液，
③
为0.3％v/v tween-20水溶液，
④
为0.4％v/vtween-20水溶液。
[0086]
图13为检测19-去甲睾酮的方法的特异性情况。
[0087]
图14为检测19-去甲睾酮的方法的灵敏度情况；a为建立猪尿的标准曲线的试纸条测试结果；b为建立牛尿的标准曲线的试纸条测试结果；c为pbs标准曲线、猪尿标准曲线和牛尿标准曲线。
具体实施方式
[0088]
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
[0089]
实施例1标记19-去甲睾酮单克隆抗体的胶体金探针的制备方法
[0090]
1、抗原的制备
[0091]
本发明利用结构如式(ⅰ)所示的半抗原19-nt-cma(现有技术“余德河,胥传来,彭池方,王武康,郭金花,金征宇.食品中残留19-去甲睾酮免疫原的合成与鉴定[j].食品科学,2006(05):195-198.”中的nt-cma)，
[0092][0093][0094]
通过活泼酯法偶联鸡卵清白蛋白(ova)，得到结构式如式(ⅱ)所示的抗原19-nt-o-ova，
[0095][0096]
具体活泼酯法的制备方法如下：称取0.6mmol 19-nt-cma半抗原溶解于400μl n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，搅拌加入0.9mmol的碳二亚胺(edc)和n-羟基丁二酰亚胺(nhs)，4℃搅拌活化8h；称取20mg ova溶于4ml 0.01mol/l pbs中，得到载体蛋白溶液；将活化后的半抗原缓慢滴入载体蛋白溶液中，期间保持搅拌状态，30分钟内滴加完毕后，在4℃环境下搅拌8h，将混合液移至透析袋中，用pbs透析液透析3天(4℃，每天更换2次透析液)，即得到抗原19-nt-o-ova。
[0097]
2、抗体的制备
[0098]
以抗原19-nt-o-ova作为免疫原，免疫6～7周的雌性balb/c小鼠，每只小鼠免疫剂量为0.2mg。首次免疫时取免疫原(1mg/ml)与弗氏完全佐剂等体积乳化，在小鼠腹腔、皮下多点注射，间隔三周后进行第二次免疫，使用弗氏不完全佐剂与免疫原等体积乳化，此后每2周进行一次免疫，免疫剂量和免疫方式同第二次免疫，完成第四次免疫一周后对小鼠尾静脉采血，得到抗血清检测抗体效价和抑制率。
[0099]
选取效价最好和抑制最高的小鼠进行细胞融合实验，获得识别19-nt的单克隆细胞株，并制备腹水，将腹水用protein-g纯化后得到单克隆抗体，即19-nt单克隆抗体。
[0100]
3、胶体金溶液的制备
[0101]
将1ml 1％w/v氯金酸水溶液与4ml 1％w/v柠檬酸三钠水溶液充分混合，得到胶体金溶液，再加入20μl 0.2mol/ml k2co3溶液调节ph＝7.0，23℃恒温摇床600rpm振荡5min，即得到胶体金溶液。
[0102]
4、抗体标记
[0103]
取1ml上一步所得胶体金溶液与10μl 1mg/ml 19-nt单克隆抗体，23℃恒温摇床600rpm振荡活化5min，即得到标记19-nt单克隆抗体的胶体金溶液。
[0104]
5、封闭
[0105]
将上一步所得19-nt单克隆抗体的胶体金溶液与10μl 10％w/v牛血清白蛋白(bsa)水溶液，23℃恒温摇床600rpm振荡封闭5min，于4℃12000rpm条件下离心15min，弃上清，所得沉淀即为标记19-去甲睾酮单克隆抗体的胶体金探针。
[0106]
后续使用过程中，以含有10％v/v tween-20、5％w/v蔗糖、0.5％w/v bsa、10％v/v聚乙烯吡咯烷酮(pvp)和3％v/v proclin 300的0.02mol/l磷酸缓冲液(即pb溶液)(ph＝7.4)作为复溶液，溶解标记19-去甲睾酮单克隆抗体的胶体金探针。
[0107]
实施例2一种检测19-去甲睾酮的试剂盒
[0108]
一、制备方法
[0109]
1、检测19-去甲睾酮的免疫层析试纸条的制备
[0110]
(1)划膜
[0111]
用含有0.15mol/l nacl的0.02mol/l pb溶液(ph＝7.4)，分别稀释结构式如式(ⅱ)所示的19-去甲睾酮抗原19-nt-o-ova和羊抗鼠igg，
[0112][0113]
通过喷金划膜仪分别将0.15mg/ml的19-nt-o-ova以0.9μl/cm划到硝酸纤维素膜(nc膜)的t线上，作为包被原；将0.35mg/ml羊抗鼠igg以0.9μl/cm划到nc膜的c线上，作为二抗；之后放入37℃烘箱干燥14h，并在阴凉干燥处密封保存备用。
[0114]
(2)样品垫处理
[0115]
将玻璃纤维膜浸泡于0.3％v/v tween-20水溶液中，充分浸泡30min后取出玻璃纤维膜，垂直放置，直至不再有液体滴落；之后水平放置于37℃的烘箱中烘干14h，即得到样品垫，在干燥阴凉处密封保存备用。
[0116]
(3)组装
[0117]
在聚氯乙烯板(pvc板)上贴上本实施例步骤1划线后的nc膜，再贴上吸水纸和本实施例步骤2得到的样品垫，其中nc膜的一端与步样品垫重叠1mm～2mm，nc膜的另一端与吸水纸重叠1mm～2mm；之后将其裁剪为宽度为3.6mm长度为8cm的条状，即得检测19-去甲睾酮的免疫层析试纸条，其结构如图1所示。
[0118]
2、胶体金样品槽的制备
[0119]
将实施例1制备的标记19-去甲睾酮单克隆抗体的胶体金探针用复溶液复溶后，以5μl/孔的量加入酶标孔中，37℃的烘箱中烘干14h后，即得到胶体金样品槽，密封备用。
[0120]
二、试剂盒的组成
[0121]
包括本实施例制得的检测19-去甲睾酮的免疫层析试纸条和胶体金样品槽，以及19-去甲睾酮标准品、0.01mol/l磷酸盐缓冲溶液和0.4mol/l pb溶液。
[0122]
实施例3一种检测19-去甲睾酮的方法
[0123]
本发明提供一种检测19-去甲睾酮的方法，其原理如图2所示，具体为：
[0124]
将待测样品与胶体金样品槽中的标记19-去甲睾酮单克隆抗体的胶体金探针反应后，再将实施例2制备的免疫层析试纸条插入胶体金样品槽中，反应液在毛细作用下向免疫层析试纸条的吸水垫方向层析；没有和样品中的19-去甲睾酮结合的胶体金探针移动至包被有19-去甲睾酮抗原的t线，并与19-去甲睾酮抗原结合，使得t线显示颜色；与样品中的19-去甲睾酮结合的胶体金探针移动至包被有羊抗鼠igg的c线，并与羊抗鼠igg结合，使得c线显示颜色；将显色的免疫层析试纸条装入卡槽内在紫外灯照下裸眼观察显色结果，并插入读卡仪进行定量记录。
[0125]
本实施例以猪和牛的尿液作为检测样本，提供一个具体的实施方法，具体步骤如下：
[0126]
1、样品的前处理
[0127]
分别取10ml猪的尿液和牛的尿液放入50ml离心管中，4℃条件下3500r/min离心15min，避开沉淀，分别收集上清提取液，经过0.22μm滤膜过滤后，分别收集滤液；再用0.01mol/l pbs溶液稀释所得滤液以消除基质效应，稀释倍数为10倍，即得到猪尿和牛尿供试样品。
[0128]
2、检测
[0129]
将100μl猪尿供试样品和100μl牛尿供试样品分别加入实施例2的试剂盒中的胶体金样品槽中充分混合均匀，26℃孵育5min；再将实施例2的试剂盒中的检测19-去甲睾酮的免疫层析试纸条，以样品垫端插入样品槽中，反应5min后，取出免疫层析试纸条，判断检测结果，并放入干式荧光免疫分析仪中在525nm下测得t线和c线的吸光值。
[0130]
3、标准曲线的构建
[0131]
用0.4mol/l pb溶液19-去甲睾酮标准品稀释至浓度依次为0ng/ml、0.1ng/ml、0.25ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、1.25ng/ml、1.5ng/ml、2.5ng/ml和5ng/ml。
[0132]
取100μl各浓度的标准品的稀释液加入实施例2制备的胶体金样品槽中，26℃孵育5min；再将实施例2的试剂盒中的检测19-去甲睾酮的免疫层析试纸条，以样品垫端插入样品槽中，反应5min后，取出免疫层析试纸条，判断检测结果，并放入干式荧光免疫分析仪中在525nm下测得t线和c线的吸光值。
[0133]
根据各稀释液的浓度和t线和c线的吸光值拟合标准曲线，以浓度为横坐标，t线和c线的吸光值的比值(即t/c值)为纵坐标。
[0134]
4、判定方法
[0135]
(1)定性判定法
[0136]
若t线和c线均有显色，则待测样品是不含有19-去甲睾酮的阴性样本；若c线显色，t线不显色，则待测样品是含有19-去甲睾酮的阳性样本；若c线不显色，无论t线是否显色，检测结果均为无效。
[0137]
(2)定量判定法
[0138]
使用干式荧光免疫分析仪测定待测样品的免疫层析试纸条的t线和c线的荧光强度，代入建立得标准曲线计算得出待测样品中19-去甲睾酮的浓度。
[0139]
实施例4各条件对检测19-去甲睾酮的方法的影响
[0140]
一、实验方法
[0141]
1、胶体金粒径对检测19-去甲睾酮的方法的影响
[0142]
参照实施例1的制备方法制得标记19-去甲睾酮单克隆抗体的胶体金探针，区别仅在于步骤1“胶体金溶液的制备”中，用1ml 1％w/v氯金酸水溶液与2ml1％w/v柠檬酸三钠水溶液制得胶体金溶液，或用1ml 1％w/v氯金酸水溶液与4ml 1％w/v柠檬酸三钠水溶液制得胶体金溶液，或用1ml 1％w/v氯金酸水溶液与6ml 1％w/v柠檬酸三钠水溶液制得胶体金溶液。所得胶体金的粒径依次为42nm、36nm和30nm。
[0143]
之后按照实施例2的制备方法制得检测19-去甲睾酮的试剂盒，再按照实施例3的方法进行检测，以0.4mol/l pb溶作为阴性对照(negative)。
[0144]
2、2mol/l k2co3溶液用量对检测19-去甲睾酮的方法的影响
[0145]
参照实施例1的制备方法制得标记19-去甲睾酮单克隆抗体的胶体金探针，区别仅在于步骤1“胶体金溶液的制备”中，分别用4μl、6μl、8μl、10μl和12μl的0.2mol/l k2co3溶
液，调节胶体金溶液的ph依次为5.0、5.5、6.0、6.5和7.0。
[0146]
之后按照实施例2的制备方法制得检测19-去甲睾酮的试剂盒，再按照实施例3的方法进行检测，以0.4mol/l pb溶作为阴性对照(negative)。
[0147]
3、稀释液对检测19-去甲睾酮的方法的影响
[0148]
参照实施例1的制备方法制得标记19-去甲睾酮单克隆抗体的胶体金探针，区别仅在于步骤2“抗体标记”中，分别用0.01mol/l pb溶液、含有0.5％w/v bsa的0.01mol/l pb溶液、0.01mol/l硼酸盐缓冲液(bb溶液)、含有0.5％w/v bsa的0.01mol/l bb溶液、含有0.5％w/v bsa水溶液和0.01mol/l pbs溶液稀释19-nt单克隆抗体。
[0149]
之后按照实施例2的制备方法制得检测19-去甲睾酮的试剂盒，再按照实施例3的方法进行检测，以0.4mol/l pb溶作为阴性对照(negative)。
[0150]
4、抗体用量对检测19-去甲睾酮的方法的影响
[0151]
参照实施例1的制备方法制得标记19-去甲睾酮单克隆抗体的胶体金探针，区别仅在于步骤2“抗体标记”中，将原始浓度为5.1mg/ml的19-nt单克隆抗体用0.01mol/l pbs溶液稀释为1mg/ml，再分别以4μl、6μl、8μl、10μl和12μl的添加量与1ml胶体金溶液振荡活化。
[0152]
之后按照实施例2的制备方法制得检测19-去甲睾酮的试剂盒，再按照实施例3的方法进行检测，以0.4mol/l pb溶作为阴性对照(negative)。
[0153]
5、胶体金探针用量对检测19-去甲睾酮的方法的影响
[0154]
按照实施例1的制备方法制得标记19-去甲睾酮单克隆抗体的胶体金探针。
[0155]
之后参照实施例2的制备方法制得检测19-去甲睾酮的试剂盒，区别仅在于步骤2“胶体金样品槽的制备”中，将实施例1制备的标记19-去甲睾酮单克隆抗体的胶体金探针用复溶液复溶后，分别以10μl/孔、15μl/孔、20μl/孔、25μl/孔或30μl/孔的量加入酶标孔中。
[0156]
再按照实施例3的方法进行检测，以0.4mol/l pb溶作为阴性对照(negative)。
[0157]
6、标准品稀释液对检测19-去甲睾酮的方法的影响
[0158]
按照实施例1的制备方法制得标记19-去甲睾酮单克隆抗体的胶体金探针，之后按照实施例2的制备方法制得检测19-去甲睾酮的试剂盒。
[0159]
再参照实施例3的方法进行检测，区别仅在于步骤1“样品的前处理”中，分别用0.1mol/l pb溶液、0.2mol/l pb溶液、0.3mol/l pb溶液、0.4mol/l pb溶液或0.01mol/l pbs溶液，稀释所得滤液以消除基质效应。以0.4mol/l pb溶作为阴性对照(negative)
[0160]
7、离心速度和离心时间对检测19-去甲睾酮的方法的影响
[0161]
参照实施例1的制备方法制得标记19-去甲睾酮单克隆抗体的胶体金探针，区别仅在于步骤3“封闭”中，分别以6000rpm、8000rpm、10000rpm、12000rpm或14000rpm进行离心；之后按照实施例2的制备方法制得检测19-去甲睾酮的试剂盒，再按照实施例3的方法进行检测，确定最佳离心速度。以0.4mol/l pb溶作为阴性对照(negative)
[0162]
参照实施例1的制备方法制得标记19-去甲睾酮单克隆抗体的胶体金探针，区别仅在于步骤3“封闭”中，以最佳离心速度进行离心，分别离心5min、10min、15min、20min或25min；之后按照实施例2的制备方法制得检测19-去甲睾酮的试剂盒，再按照实施例3的方法进行检测，确定最佳离心时间。
[0163]
8、包被原浓度对检测19-去甲睾酮的方法的影响
[0164]
按照实施例1的制备方法制得标记19-去甲睾酮单克隆抗体的胶体金探针。
[0165]
之后参照实施例2的制备方法制得检测19-去甲睾酮的试剂盒，区别仅在于步骤1“检测19-去甲睾酮的免疫层析试纸条的制备”的“(1)划膜”中，用0.5mg/ml的羊抗鼠igg包被在c线上，用不同浓度的19-nt-o-ova包被在t线上，19-nt-o-ova的包被浓度分别为0.10mg/ml、0.15mg/ml、0.20mg/ml或0.25mg/ml。
[0166]
再按照实施例3的方法进行检测，以0.4mol/l pb溶作为阴性对照(negative)。
[0167]
9、样品垫处理液对检测19-去甲睾酮的方法的影响
[0168]
按照实施例1的制备方法制得标记19-去甲睾酮单克隆抗体的胶体金探针。
[0169]
之后参照实施例2的制备方法制得检测19-去甲睾酮的试剂盒，区别仅在于区别仅在于步骤1“检测19-去甲睾酮的免疫层析试纸条的制备”的“(2)样品垫处理”中，将玻璃纤维膜分别浸泡于0.1％v/v tween-20水溶液、0.2％v/v tween-20水溶液、0.3％v/v tween-20水溶液和0.4％v/v tween-20水溶液中。
[0170]
再按照实施例3的方法进行检测，以0.4mol/l pb溶作为阴性对照(negative)。
[0171]
二、实验结果
[0172]
1、胶体金粒径的影响
[0173]
如图3中的a所示，当使用粒径为36的胶体金进行标记时，试纸条显色均匀，且nc膜背景干净；从图3中的b可看出，随着胶体金粒径的增大，试纸条显色逐渐加深，抑制率下降，当粒径为36时，效果最好，灵敏度好。故确定胶体金为最佳标记粒径为36。
[0174]
2、0.2mol/l k2co3溶液用量的影响
[0175]
如图4中的a所示，随着0.02mol/ml k2co3溶液的添加量的增大，试纸条显色加深，当添加0.02mol/ml k2co3溶液的量为10μl(即胶体金溶液的ph为6.5)时，试纸条显色均匀，nc膜背景干净；从图4中的b所示，随着0.02mol/ml k2co3溶液的添加量的增大，抑制率先降低再升高再降低，当添加体积为10μl时，抑制率最高，检测效果最好，灵敏度好。故确定0.02mol/ml k2co3的最添加佳量为10μl。
[0176]
3、抗体稀释液的影响
[0177]
如图5中的a所示，当抗体稀释液为0.01mol/l pbs溶液时，纸条显色深浅适宜，nc膜背景干净；从图5中的b所示，当抗体稀释液为0.01mol/l pbs溶液时，抑制率最高，灵敏度最好。故选择0.01mol/l pbs溶液作为抗体稀释液。
[0178]
4、抗体用量的影响
[0179]
如图6中的a和b所示，随着抗体用量的增加，试纸条c线、t线的颜色深度整体呈上升趋势；其中，当抗体用量为4μl时，纸条显色弱，数据不稳定，抗体还未达到最适添加量；当抗体用量为6μl时，纸条显色显色效果好，抑制率高；当抗体用量超过6μl后，抑制率逐渐降低，灵敏度逐渐降低，说明环境的抗体已过量。因此，确定抗体最佳用量为6μl。
[0180]
5、胶体金探针用量的影响
[0181]
如图7中的a和b所示，当探针用量小于15μl时，试纸条的灵敏度虽然较高，但是试纸条显色过浅，信号读数不稳定；当探针用量大于15μl时，试纸条的显色效果虽然较深，但是试纸条灵敏度降低；当探针用量为15μl时，显色效果好，灵敏度高。
[0182]
6、标准品稀释液的影响
[0183]
如图8中的a和b所示，当标准品的稀释液为0.4mol/l pb溶液时，试纸条的显色效果最好，检测的灵敏度高。
[0184]
7、离心速度和离心时间的影响
[0185]
如图9中的a和b以及图10中的a和b所示，当离心速度过高或离心时间较长时，沉淀难以复溶，两种情况均会造成金标抗体的浪费，导致c线和t线的显色效果不佳；当离心速度为12000rpm/min，离心时间为20min时，试纸条的显色效果最好，灵敏度最高。
[0186]
8、包被原浓度的影响
[0187]
如图11中的a和b所示，当c线上二抗羊抗鼠igg的浓度为0.5mg/ml，随着t线上包被原19-nt-o-ova浓度的增加，t线逐渐加深，抑制率升高，当t线包被原浓度为0.15mg/ml时，c线和t线都显色均匀，且阳性纸条完全消线，抑制率达最高；当t线上包被原19-nt-o-ova浓度超过0.15mg/ml后，抑制率降低，说明包被原浓度过饱和，造成t线结合更多探针，从而难以消线。所以，0.15mg/ml是t线的最佳包被原浓度。
[0188]
9、样品垫处理液的影响
[0189]
如图12中的a和b所示，对于猪尿和牛尿样品，虽然在处理液中tween-20的含量为0.1％v/v时，试纸条的抑制率高，但样品层析速度慢，c线和t线的显色效果不佳；而当处理液中tween-20的含量为0.3％v/v时，试纸条的抑制率最高，样品层析速度快，c线和t线的显色效果最好。所以，在检测猪尿牛尿样品时，选择样品处理垫配方tween-20含量为0.3％v/v。
[0190]
实施例5检测19-去甲睾酮的方法的特异性
[0191]
1、实验方法
[0192]
对19-去甲睾酮及其结构和功能的类似物(勃地酮、氯睾酮、17-α-甲基睾酮、丙酸睾酮和苯丙酸诺龙)进行交叉反应检测，以0.4mol/l pb溶作为阴性对照(negative)。
[0193]
用0.4mol/l pb溶液，将19-去甲睾酮标准品及以上6种类似物的标准品分别稀释至浓度为500ng/ml，之后按照实施例3的方法进行检测，对有交叉反应的药物进行梯度稀释并绘制标准曲线，测定ic
50
值并计算交叉反应率，交叉反应率的计算公式为：交叉反应率(cr)＝(ic
50(19-去甲睾酮)
/ic
50(类似物)
)
×
100％。
[0194]
2、实验结果
[0195]
表1 19-去甲睾酮及其类似物的交叉反应检测结果(n＝3)
[0196][0197][0198]
如表1所示，本发明实施例3的检测19-去甲睾酮的方法对勃地酮、氯睾酮、17-α-甲基睾酮、丙酸睾酮和苯丙酸诺龙的ic
50
均大于500ng/ml，且交叉反应率均小于0.5％。如图13所示，除检测19-去甲睾酮的试纸条以外，检测勃地酮、氯睾酮、17-α-甲基睾酮、丙酸睾酮和苯丙酸诺龙的试纸条均和检测阴性对照的试纸条一样，c线和t线均显色。
[0199]
以上结果表明，本发明实施例3提供的方法与19-去甲睾酮的类似物不存在明显交叉反应，特异性好。
[0200]
实施例6检测19-去甲睾酮的方法的灵敏度
[0201]
1、实验方法
[0202]
按照实施例3的方法对猪的尿液(即猪尿)和牛的尿液(即牛尿)进行前处理，用0.4mol/l pbs溶液将19-去甲睾酮标准品分别稀释至0ng/ml、10ng/ml、3ng/ml、1ng/ml、0.3ng/ml、0.25ng/ml、0.20ng/ml和0.15ng/ml用于建立pb标准曲线；用猪尿供试样品将19-去甲睾酮标准品分别稀释相同的浓度梯度用于建立猪尿标准曲线；用牛尿供试样品将19-去甲睾酮标准品分别稀释相同的浓度梯度用于建立牛尿标准曲线，之后进行检测。
[0203]
2、实验结果
[0204]
如图14中的a所示，用于建立猪尿和牛尿的标准曲线的试纸条显示，在当19-去甲睾酮标准品的浓度在1ng/ml以上时，t线完全不显色。
[0205]
如图14中的b所示，将荧光读数结果经origin 9.0软件拟合后得到标准曲线，在pb标准曲线中，该试纸条对19-去甲睾酮的qlod为0.08ng/ml，ic
50
为0.22ng/ml，ic
20
～ic
80
为0.12～0.40ng/ml，vlod值为0.7ng/ml；在猪尿标准曲线中，该试纸条对19-去甲睾酮的qlod为0.08ng/ml，ic
50
为0.241ng/ml，ic
20
～ic
80
为0.12ng/ml～0.45ng/ml，vlod值为0.7ng/ml；在牛尿标准曲线中，该试纸条对19-去甲睾酮的qlod为0.08ng/ml，ic
50
为0.22ng/ml，ic
20
～ic
80
为0.12ng/ml～0.42ng/ml，vlod值为0.7ng/ml。
[0206]
上述结果表明，本发明实施例3建立的检测19-去甲睾酮的方法的灵敏度高，可用于家畜尿液样本的检测。
[0207]
实施例7添加回收实验
[0208]
1、实验方法
[0209]
用0.04mol/l pb溶液稀释19-去甲睾酮标准品至浓度依次为0.15ng/ml、0.20ng/ml和0.25ng/ml，之后分别添加到猪的尿液(即猪尿)和牛的尿液(即牛尿)中。
[0210]
按照实施例3的方法进行检测，将所得的t/c值代入标准曲线，算出回收的浓度及相对标准偏差(rsd)。
[0211]
2、实验结果
[0212]
表2样品添加回收实验(n＝3)
[0213][0214]
如表2所示，猪尿的添加回收率在88.6％～104.0％，rsd《12％；牛尿的添加回收率在93.3％～115.0％，rsd《8％；说明本发明实施例3建立的检测19-去甲睾酮的方法可以在其线性范围内，有效地检测猪尿和牛尿等实际样品中的19-去甲睾酮的药物残留情况。
[0215]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

技术特征：
1.一种标记19-去甲睾酮抗体的胶体金探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1.氯金酸与柠檬酸三钠按照用量比1：(2～6)充分反应，调节ph至5.0～7.0，即得到胶体金溶液；s2.将19-去甲睾酮抗体与步骤s1所得胶体金溶液充分反应；s3.将牛血清白蛋白与步骤2所得产物充分反应后，10000rpm～14000rpm离心10min～20min，收集沉淀即得到标记19-去甲睾酮抗体的胶体金探针。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤s1中，所述柠檬酸三钠还原法包括以下步骤：将氯金酸与柠檬酸三钠按照用量比1：4充分反应。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤s1中，用k2co3溶液调节ph至5.0～7.0。4.权利要求1～3任一所述制备方法制得的胶体金探针。5.权利要求4所述胶体金探针在制备检测19-去甲睾酮的试剂盒中的应用。6.一种检测19-去甲睾酮的系统，其特征在于，包括权利要求4所述胶体金探针以及t线上包被有19-去甲睾酮抗原和c线上包被有二抗的免疫层析试纸条；所述19-去甲睾酮抗原的结构式如式(ⅱ)所示，7.根据权利要求6所述的系统，其特征在于，所述免疫层析试纸条的c线包被有0.4mg/ml～0.6mg/ml的二抗。8.根据权利要求6所述的系统，其特征在于，所述免疫层析试纸条的样品垫经过0.1％v/v～0.4％v/v tween-20溶液充分浸泡。9.一种检测19-去甲睾酮的试剂盒，其特征在于，包含权利要求4所述胶体金探针和权利要求6～8中任一所述的免疫层析试纸条。10.一种检测19-去甲睾酮的方法，其特征在于，所述方法以非疾病治疗与诊断为目的，使用权利要求4所述胶体金探针和/或权利要求6～8中任一所述的免疫层析试纸条检测待测样品。

技术总结
本发明公开了一种标记19-去甲睾酮抗体的胶体金探针的制备方法及其应用，所述制备方法包括以下步骤：S1.氯金酸与柠檬酸三钠按照用量比1：(2～6)充分反应，调节pH，即得到胶体金溶液；S2.将19-去甲睾酮抗体与步骤S1所得胶体金溶液充分反应；S3.将牛血清白蛋白与步骤2所得产物充分反应后，离心，收集沉淀即得。本发明提供的标记19-去甲睾酮抗体的胶体金探针和检测19-去甲睾酮的免疫层析试纸条，并建立了相应的检测方法，仅需一次提取并稀释即可完成样品的前处理操作，不仅操作简单便捷，检测效率高，而且特异性好，灵敏度高，对猪尿和牛尿等样品中的19-去甲睾酮裸眼检测限为0.7ng/mL，定量检测限为0.12ng/mL～0.45ng/mL，回收率为88.6％～106.6％，标准偏差为3.1％～11.1％。标准偏差为3.1％～11.1％。标准偏差为3.1％～11.1％。


技术研发人员：杨金易 黄庆锋 陈丽 沈玉栋 王弘 孙远明
受保护的技术使用者：温氏食品集团股份有限公司
技术研发日：2023.05.05
技术公布日：2023/7/27