一种重组禽腺病毒二价灭活疫苗

1.本发明涉及一种重组禽腺病毒二价灭活疫苗，属于疫苗生产技术领域。


背景技术：

2.禽腺病毒(fowl adenovirus,fadv)属于腺病毒科禽腺病毒属。根据基因组与血清交叉中和反应性，目前禽腺病毒可分为5个种(fadv-a～e)，12个血清型(fadv-1～8a和fadv-8b～11)。流行病学研究表明禽腺病毒在世界范围内广泛分布，且对不同日龄的家禽均易感。禽腺病毒感染一般引起亚临床症状，而急性感染可引起以包涵体肝炎(ibh)、肝炎-心包积液综合征(hhs)以及腺病毒肌胃糜烂(age)等为主的临床症状。
3.疫苗接种是预防控制该类疾病的主要手段。近年来，国内外有研究报道，灭活疫苗、亚单位疫苗、减毒活疫苗及基因工程疫苗等可用于hhs和ibh的免疫预防。其中大部分是针对fadv-4单价灭活苗、fadv-8单价灭活苗以及与其它禽源病毒抗原制成的多联灭活苗。目前，同时针对fadv-4和fadv-8的二价基因工程灭活疫苗的研究却未见报道。
4.发明人利用本课题组前期构建的表达血清8b型禽腺病毒纤突蛋白的重组血清4型禽腺病毒fa4-f(叶建强等.表达血清8型禽腺病毒纤突蛋白重组血清4型禽腺病毒以及制备方法.专利申请号：202110332476.5，公布号：cn 113061586a)，经灭活后制备成灭活疫苗，并对其免疫保护性做了研究，结果显示该疫苗可用于同时免疫防控fadv-4和fadv-8b。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于针对上述现有技术的不足，提供一种重组禽腺病毒二价灭活疫苗。
6.本发明的目的是这样实现的，一种重组禽腺病毒二价灭活疫苗，其特征在于，疫苗是灭活的表达血清8b型禽腺病毒纤突蛋白的重组血清4型禽腺病毒fa4-f。
7.表达血清8b型禽腺病毒纤突蛋白的重组血清4型禽腺病毒fa4-f的构建方法，在表达egfp的重组血清4禽腺病毒的f1和f2基因之间插入血清8b型禽腺病毒纤突基因。
8.一种重组禽腺病毒二价灭活疫苗，灭活是将细胞培养的fa4-f的重组病毒液加入0.1％v/v的甲醛37℃作用24h进行灭活；甲醛灭活病毒液与油佐剂按1:3(v/v)的比例乳化用于制备油佐剂灭活疫苗。
9.细胞为鸡肝癌细胞(chicken leghorn male hepatocellular cell,lmh)。
10.灭活疫苗中，病毒终浓度为5.0
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11.灭活疫苗在制备防治由血清4型禽腺病毒fadv-4和血清8b型禽腺病毒fadv-8b感染引起的禽肝炎-心包积液综合征hhs和包涵体肝炎ibh的应用。
12.本发明方法先进科学，针对目前国内鸡群中正流行爆发的由fadv-4和fadv-8感染引起的hhs和ibh，本发明提供了一种表达血清8b型禽腺病毒纤突蛋白的重组血清4型禽腺病毒灭活疫苗。该疫苗以血清4型禽腺病毒为载体表达血清8b型禽腺病毒纤突蛋白，并将其灭活后制备成可同时免疫防控fadv-4和fadv-8b的二价灭活疫苗。与传统单价及二价灭活
疫苗比较，本发明基于基因工程制备的二价灭活疫苗具有制备一次，可获得针对两个病原的保护性抗原的优点，并且免疫一次可同时保护两个病原的优势。同时，本发明基于血清4型禽腺病毒为载体表达血清8b型禽腺病毒纤突蛋白的二价灭活疫苗填补了国内外fadv-4和fadv-8b基因工程联合防控的技术空白，具有良好的市场应用价值与前景。本发明采用了以下技术手段：
13.1.表达血清8型禽腺病毒纤突蛋白的重组血清4型禽腺病毒的培养：将重组病毒fa4-f接种于鸡肝细胞，其培养条件为含有10％fbs血清的dmem/f12培养液、病毒感染及维持液为含1％fbs血清的dmem/f12培养基、最适ph为7.0-7.2、病毒接种量moi为0.01以及病毒收获时间为接种后120小时；感染后120小时后收集病毒、分装，并测定病毒效价。
14.2.表达血清8型禽腺病毒纤突蛋白的重组血清4型禽腺病毒灭活苗的制备：将细胞培养的重组病毒fa4-f加入0.1％v/v的甲醛37℃作用24h进行灭活，并进行灭活及无菌检验；将灭活的重组病毒稀释至5.0
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/ml，之后，甲醛灭活病毒液与油佐剂按1:3(v/v)的比例乳化用于制备油佐剂灭活疫苗，并分装。
15.3.表达血清8b型禽腺病毒纤突蛋白的重组血清4型禽腺病毒灭活苗的免疫保护效果评价：spf鸡7日龄时进行免疫，设灭活疫苗组、攻毒对照组和阴性对照组。免疫后分别于7、14、21、28d采血分离血清，通过血清中和试验测定中和抗体效价。免疫28d后进行攻毒，攻毒后连续观察21日，统计免疫保护率。分别于攻毒后3d、5d、7d和9d采集各组试验鸡的肝、脾、肾，同时攻毒后3d、5d、7d、9d和11d采集各组试验鸡的泄殖腔拭子，通过病毒滴定检测脏器和泄殖腔拭子病毒载量。
16.本发明利用表达血清8b型禽腺病毒纤突蛋白的重组血清4型禽腺病毒并将其制成灭活疫苗，该重组病毒灭活疫苗具有良好的免疫原性，对fadv-4和fadv-8b感染可提供良好的免疫保护，可作为免疫防控由fadv-4和fadv-8b感染引起的hhs和ibh的基因工程候选灭活疫苗株。
17.本发明基于已构建的表达血清8b型禽腺病毒纤突蛋白的重组血清4型禽腺病毒，制备了同时针对fadv-4和fadv-8b的二价灭活苗，为防控fadv-4和fadv-8b的感染提供了候选疫苗株。因此，本发明具有一定的市场应用价值。
附图说明
18.图1为免疫后中和抗体水平的检测结果；
19.a：针对fadv-8b中和抗体水平；b：针对fadv-4中和抗体水平。
20.图2为攻毒保护的结果图；
21.a：鸡群攻毒后21d内的存活曲线图；b：鸡群攻毒后泄殖腔排毒检测；c～e：鸡群攻毒后脏器组织病毒载量检测。
具体实施方式
22.本发明中所涉及的主要生物材料如下：
23.表达血清8型禽腺病毒纤突蛋白的重组血清4型禽腺病毒fa4-f：叶建强等.表达血清8型禽腺病毒纤突蛋白重组血清4型禽腺病毒以及制备方法.专利申请号：202110332476.5，公布号：cn 113061586 a。
8b的免疫攻毒组的鸡的泄殖腔拭子中均未检测到排毒，而对照攻毒组的鸡可检测出高滴度的排毒。攻毒后5天和7天时，攻fadv-8b的免疫攻毒组的鸡的泄殖腔虽有排毒，但明显低于对照攻毒组的鸡的泄殖腔排毒(p≤0.01)(图2b)。
31.上述结果表明，表达血清8b型禽腺病毒纤突蛋白的重组血清4型禽腺病毒灭活疫苗能对野生型fadv-4和fadv-8b提供有效保护。
32.表1免疫试验分组
33.

技术特征：
1.一种重组禽腺病毒二价灭活疫苗，其特征在于，疫苗是灭活的表达血清8b型禽腺病毒纤突蛋白的重组血清4型禽腺病毒fa4-f。2.权利要求1所述的表达血清8b型禽腺病毒纤突蛋白的重组血清4型禽腺病毒fa4-f的构建方法，其特征在于，在表达egfp的重组血清4禽腺病毒的f1和f2基因之间插入血清8b型禽腺病毒纤突基因。3. 根据权利要求1所述的一种重组禽腺病毒二价灭活疫苗，其特征在于，灭活是将细胞培养的fa4-f的重组病毒液加入0.1％v/v的甲醛37℃作用24h进行灭活；甲醛灭活病毒液与油佐剂按1:3 (v/v)的比例乳化用于制备油佐剂灭活疫苗。4. 根据权利要求3所述的所述的一种重组禽腺病毒二价灭活疫苗，其特征在于，细胞为鸡肝癌细胞(chicken leghorn male hepatocellular cell, lmh)。5. 根据权利要求1-4任一项权利要求所述的一种重组禽腺病毒二价灭活疫苗，其特征在于，灭活疫苗中，病毒终浓度为5.0
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/ml。6. 权利要求1-5任一项权利要求所述的灭活疫苗在制备防治由血清4型禽腺病毒 fadv-4和血清8b型禽腺病毒 fadv-8b感染引起的禽肝炎-心包积液综合征hhs和包涵体肝炎ibh的应用。

技术总结
本发明涉及一种重组禽腺病毒二价灭活疫苗，疫苗是灭活的表达血清8b型禽腺病毒纤突蛋白的重组血清4型禽腺病毒FA4-F。表达血清8b型禽腺病毒纤突蛋白的重组血清4型禽腺病毒FA4-F的构建方法，在表达EGFP的重组血清4禽腺病毒的F1和F2基因之间插入血清8b型禽腺病毒纤突基因。一种重组禽腺病毒二价灭活疫苗，灭活是将细胞培养的FA4-F的重组病毒液加入0.1％v/v的甲醛37℃作用24h进行灭活；甲醛灭活病毒液与油佐剂按1:3(v/v)的比例乳化用于制备油佐剂灭活疫苗。通过本发明，针对目前国内鸡群中正流行爆发的由FAdV-4和FAdV-8感染引起的HHS和IBH，为防控FAdV-4和FAdV-8b的感染提供了候选疫苗株；因此，本发明具有一定的市场应用价值。值。值。


技术研发人员：叶建强 路浩 张建军 王伟康 张伟 谢泉 连明君 万志敏 李拓凡 周玉双
受保护的技术使用者：扬州大学
技术研发日：2023.05.04
技术公布日：2023/7/27