检测幽门螺杆菌左氧氟沙星耐药基因相关突变位点的引物和探针组合及方法与流程

1.本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及用于幽门螺杆菌左氧氟沙星耐药突变检测的方法，本发明还涉及到利用所述的引物探针相组合检测hp左氧氟沙星耐药的试剂盒。


背景技术：

2.幽门螺杆菌(helicobacter pylori，hp)作为全球流行的细菌，近年来越来越受到大众的关注。hp是胃部疾病的罪魁祸首，与胃炎、胃溃疡、胃粘膜组织淋巴瘤等密切相关。左氧氟沙星作为一种喹诺酮类抗生素，在幽门螺杆菌治疗中有着重要的作用，常与其他药物联合使用，形成方案。然而，左氧氟沙星的特点是产生耐药性很快，因此，在使用前要明确其是否耐药。传统的药物敏感性方法，要经过细菌分离培养以后，再进行相应的试验来判断。幽门螺杆菌作为一种微需氧菌，生长缓慢，培养和分离非常困难，需要7～10天才能得到细菌，然后再经历3天以上的时间，才能得到药敏试验结果，整个过程耗时长，成功率低，并且需要在胃镜下取胃粘膜才能完成。由于hp分离培养的难度和时效性，限制了“培养+药敏”的方法在临床的使用。因此使用分子生物检测hp左氧氟沙星耐药是更为合适的选择。
3.hp左氧氟沙星耐药的主要原因是由于其喹诺酮耐药决定区相关基因突变引起的，主要是gyra基因的261位点和271/272位点的单核苷酸多态性引起的，其中261位点为c和t时候为敏感型，a和g时候为耐药型，271位点有两种突变g＞a和g＞t，272位点为a＞g。由于左氧氟沙星相关耐药突变位点较多，因此给实际检测工作造成了难度。目前所使用的基于核酸的snp检测方法，单一时候时候均不能达到理想的效果。
4.申请人发明了一种采用“突变阻滞扩增(arms)、分子信标探针(molecular beacon)和锁核酸(lna)”联合使用检测左氧氟沙星耐药的方法，通过对引物和探针的合理设计和组合，采用降落荧光pcr技术达到检测目的。该方法灵敏度高、特异性强、速度快、操作简单方便，具有很大的推广价值。。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题为：提供一种检测幽门螺杆菌左氧氟沙星耐药的引物、探针组合及方法，以实现hp左氧氟沙星耐药的检测目的。
6.本发明的技术方案为：检测幽门螺杆菌左氧氟沙星耐药基因gyra261、271、272相关突变位点的引物和探针组合，包括：arms引物，分子信标引物和探针，所述arms引物由引物261c野生arms-f、261t野生arms-f、261a突变arms-f、261g突变arms-f、271g野生arms-f、271t突变arms-f、271a突变arms-f、272a野生arms-f、272g突变arms-f、hp gyra arms-r组成，所述分子信标引物由引物hp gyra mbeacon-261f、hp gyra mbeacon-271f、hp gyra mbeacon-r组成，所述探针由探针261c野生-mbeacon-p、261t野生-mbeacon-p、261a突变-mbeacon-p、261g突变-mbeacon-p、271g野生-mbeacon-p、271t突变-mbeacon-p、271a突变-mbeacon-p、272a野生-mbeacon-p、272g野生-mbeacon-p组成；
7.所述261c野生arms-f的核苷酸序列如seq id no.1所示，261t野生arms-f的核苷酸序列如seq id no.2所示，261a突变arms-f的核苷酸序列如seq id no.3所示，261g突变arms-f的核苷酸序列如seq id no.4所示，71g野生arms-f的核苷酸序列如seq id no.5所示，271t突变arms-f的核苷酸序列如seq id no.6所示，271a突变arms-f的核苷酸序列如seq id no.7所示，272a野生arms-f的核苷酸序列如seq idno.8所示，272g突变arms-f的核苷酸序列如seq id no.9所示，hp gyra arms-r的核苷酸序列如seq id no.10所示，所述引物hp gyra mbeacon-261f的核苷酸序列如seq idno.11所示，hp gyra mbeacon-271f的核苷酸序列如seq id no.12所示，hp gyra mbeacon-r的核苷酸序列如seq id no.13所示，所述探针261c野生-mbeacon-p的核苷酸序列如seq id no.14所示，且从5’端起第21个碱基c为锁核酸；261t野生-mbeacon-p的核苷酸序列如seq id no.15所示，且从5’端起第21个碱基t为锁核酸；261a突变-mbeacon-p的核苷酸序列如seq id no.16所示，且从5’端起第21个碱基a为锁核酸；261g突变-mbeacon-p的核苷酸序列如seq id no.17所示，且从5’端起第21个碱基c为锁核酸；271g野生-mbeacon-p的核苷酸序列如seq id no.18所示，且从5’端起第17个碱基g为锁核酸；271t突变-mbeacon-p的核苷酸序列如seq id no.19所示，且从5’端起第17个碱基t为锁核酸；271a突变-mbeacon-p的核苷酸序列如seq id no.20所示，且从5’端起第17个碱基a为锁核酸；272a野生-mbeacon-p的核苷酸序列如seq id no.21所示，且从5’端起第19个碱基a为锁核酸；272g突变-mbeacon-p的核苷酸序列如seq id no.22所示，且从5’端起第21个碱基g为锁核酸。
8.进一步地，所述探针261c野生-mbeacon-p、261t野生-mbeacon-p、271g野生-mbeacon-p、272a野生-mbeacon-p、272g野生-mbeacon-p的5
′
端标记发光基团为fam，淬灭基团为bhq1；所述探针261a突变-mbeacon-p、261g突变-mbeacon-p、271t突变-mbeacon-p、271a突变-mbeacon-p 5
′
端标记发光基团为hex，淬灭基团为bhq1。
9.一种试剂盒，含有上述所述的引物和探针组合。
10.进一步地，还含有荧光pcr反应液、阴性对照或阳性对照中的一种或多种，所述阴性对照为左氧氟沙星敏感hp菌株的dna，所述阳性对照为左氧氟沙星耐药hp菌株的dna。
11.一种检测幽门螺杆菌左氧氟沙星耐药基因gyra261、271、272相关突变位点的方法，以样本中dna为模板，以上述所述的引物和探针组合进行实时荧光定量pcr，根据扩增曲线判断结果。
12.进一步地，实时荧光定量pcr的反应体系为：
13.成分浓度加入量荧光pcr反应buffer2x10μl引物和探针组合混合液10μm4.6μldd水
‑‑‑
1.4μl模板
‑‑‑
4.0μl总体积
‑‑‑
20μl
14.进一步地，实时荧光定量pcr的扩增程序为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性15s，65℃退火30s，10个循环；95℃15s，60℃退火30s，40个循环(采集荧光)。
15.进一步地，同时设立阳性对照和ntc对照，在对照扩增有效的情况下，样本的检测结果才可信。fam通道出现扩增信号为野生型，vic通道出现扩增信号为耐药型，fam/vic通
道同时出现信号为野生/突变杂合型。
16.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
17.本发明采用“突变阻滞扩增(arms)、分子信标探针(molecular beacon)和锁核酸(lna)”联合使用检测左氧氟沙星耐药的方法，通过对引物和探针的合理设计和组合，采用降落荧光pcr技术达到检测目的。该方法灵敏度高、特异性强、速度快、操作简单方便，具有很大的推广价值。
附图说明
18.图1为261c检测体系对261c、261t、261a、261g四种模板检测结果；
19.图2为261t检测体系对261c、261t、261a、261g四种模板检测结果；
20.图3为261a检测体系对261c、261t、261a、261g四种模板检测结果；
21.图4为261g检测体系对261c、261t、261a、261g四种模板检测结果；
22.图5为271g检测体系对271g、271t、271a模板检测结果；
23.图6为271t检测体系对271g、271t、271a模板检测结果；
24.图7为271a检测体系对271g、271t、271a模板检测结果；
25.图8为272a检测体系对272a、272g模板检测结果；
26.图9为272g检测体系对272a、272g模板检测结果；
27.图10对临床分离菌株验证；
28.图11对胃粘膜标本检测结果图；
29.图12对粪便标本检测结果图。
具体实施方式
30.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
31.针对幽门螺杆菌左氧氟沙星耐药基因gyra261、271、272相关突变位点，进行了arms、分子信标、锁核酸，引物和探针设计，构建降落实时荧光pcr检测体系，以达到检测目的。主要原理为通过降落pcr，使的arms-pcr和分子信标探针两次对突变位点进行识别，同时采用锁核酸，达到检测的特异性。
32.针对hpgyra261和271、272突变位点，设计arms上游引物，并共同利用一条下游引物。引物长度为15bp～38bp，退火温度范围为64℃～70℃，优选地，最佳退火温度为65℃。
33.arms引物序列为：
34.261c野生arms-f:gatgtgattggtaaataccacccccatggcgataac(seq idno.1)；
35.261t野生arms-f:tgatgtgattggtaaataccacccccatggcgataat(seq idno.2)；
36.261a突变arms-f:gatgtgattggtaaataccacccccatggcgataaa(seq idno.3)；
37.261g突变arms-f:gatgtgattggtaaataccacccccatggcgataag(seq idno.4)；
38.271g野生arms-f:ggtaaataccacccccatggcgataaygcggtttatg(seq idno.5)；
39.271t突变arms-f:ggtaaataccacccccatggcgataaygcggtttatt(seq idno.6)；
40.271a突变arms-f:ggtaaataccacccccatggcgataaygcggtttata(seq idno.7)；
41.272a野生arms-f:ggtaaataccacccccatggcgataaygcggtttatga(seq idno.8)；
42.272g突变arms-f:ggtaaataccacccccatggcgataaygcggtttatgg(seq idno.9)；
43.hp gyra arms-r:tcaatagagccaaagttgccctgcccatccac(seq id no.10)；
44.针对hp gyra261、271和272基因突变类型，设计分子信标检测引物及探针，引物的退火温度范围应为54℃～60℃，优选地，最佳退火温度应为60℃。分子信标探针中添加锁核酸碱基，位于突变对应的位置。探针5
′
端发光基团可以为fam、hex、tamra 、texasred、rox、cy3、cy5中的一种，3
′
端淬灭基团为bhq1或bhq2中的一种。
45.优选地本发明中野生型探针，5
′
端标记发光基团为fam，淬灭基团为bhq1；突变型探针5
′
端标记发光基团为hex，淬灭基团为bhq1。
46.分子信标引物和探针序列为：
47.hp gyra mbeacon-261f:gggtgatgtgattggtaaataccac(seq id no.11)；
48.hp gyra mbeacon-271f:aaataccacccccatggcg(seq id no.12)；
49.hp gyra mbeacon-r:tcaatagagccaaagttgccct(seq id no.13)；
50.261c野生-mbeacon-p:ccaggcgcccatggcgataacgcggtttatcgcctgg(seq idno.14)，5
′→3′
第21个碱基c为锁核酸；
51.261t野生-mbeacon-p:gccaggcgcccatggcgataatgcggtttatcgcctggc(seq idno.15)，5
′→3′
第21个碱基t为锁核酸；
52.261a突变-mbeacon-p:ccaggcgcccatggcgataaagcggtttatcgcctgg(seq idno.16)，5
′→3′
第21个碱基a为锁核酸；
53.261g突变-mbeacon-p:gccaggcgcccatggcgataaggcggtttatcgcctggc(seq idno.17)，5
′→3′
第21个碱基c为锁核酸；
54.271g野生-mbeacon-p:ccaggcggcggtttatgatgcactagtgagaatggcgcctgg(seq id no.18)，5
′→3′
第17个碱基g为锁核酸；
55.271t突变-mbeacon-p:gccaggcggcggtttattatgcactagtgagaatggccgcctggc(seq id no.19)，5
′→3′
第17个碱基t为锁核酸；
56.271a突变-mbeacon-p:ccaggcggcggtttataatgcactagtgagaatggccgcctgg(seq id no.20)，5
′→3′
第17个碱基a为锁核酸；
57.272a野生-mbeacon-p：gccaggcggcggtttatgatgcactagtgagaatggcgcctggc(seq id no.21)，5
′→3′
第19个碱基a为锁核酸；
58.272g突变-mbeacon-p:ccaggcggcggtttatggtgcactagtgagaatggcgcctgg(seq id no.22)；，5
′→3′
第21个碱基g为锁核酸。
59.一种检测幽门螺杆菌左氧氟沙星耐药基因gyra261、271、272相关突变位点的方法，以样本中dna为模板，以上述所述的引物和探针组合进行实时荧光定量pcr，根据扩增曲线判断结果。
60.需要同时设立阳性对照和ntc对照，在对照扩增有效的情况下，样本的检测结果才可信。fam通道出现扩增信号为野生型，vic通道出现扩增信号为耐药型，fam/vic通道同时出现信号为野生/突变杂合型。
61.采用多重反应体系检测，针对261位点和271/272位点，共使用一个检测体系，总体积为20μl，
[0062][0063]
本发明扩增程序如下；
[0064]
95℃预变性10min，1个循环；95℃变性15s，65℃退火30s，10个循环；95℃15s，60℃退火30s，40个循环(采集荧光)。
[0065]
实施例1
[0066]
特异性验证。采用本发明构建的引物、探针及检测体系，分别对幽门螺杆菌左氧氟沙星耐药基因gyra 261、271、272位点对应的突变位点进行检测，验证其检测特异性。所用阳性对照为人工合成基因，经过测序证明其序列正确性。结果显示，本发明所构建的hp gyra261、271、272检测体系，能够很好的区分不同基因类型，准确判断hp左氧氟沙星的耐药。结果见图1-9。
[0067]
实施例2
[0068]
检测灵敏度验证。采用本发明构建的检测体系，对hp gyra 261、271、272各个基因类型进行不同浓度的检测，验证其灵敏度。结果显示，本发明构建的检测体系，最小能达到5copy的灵敏度，能够适应不同样本类型的检测。结果见表1。
[0069]
表1左氧氟沙星耐药检测灵敏度
[0070]
261c261t261a261g271g271t271a272a272gcopy51015101520105ct值38.638.939.038.638.339.238.738.438.9
[0071]
实施例3
[0072]
临床分离幽门螺杆菌检测。采用本发明的幽门螺杆菌左氧氟沙星耐药检测体系，对临床分离到的106株hp菌进行检测，判断其左氧氟沙星耐药情况，并与传统的药敏试验结果进行对比。结果显示，本发明所的检测方法，与传统药敏试验方法，具有较高的一致性，kappa一致性检验值达到0.92。结果见表2和图10。
[0073]
表2hp菌株左氧氟沙星耐药检测结果
[0074]
细菌培养—敏感细菌培养—耐药合计本发明—敏感63164本发明—耐药33942合计6640106
[0075]
实施例4
[0076]
胃粘膜样本检测。采用本发明中的方法，对120份hp感染阳性者胃粘膜标本进行左
氧氟沙星耐药检测，结果显示有40例为左氧氟沙星耐药，有3例为敏感/耐药混合。结果见表3和图11。
[0077]
表3胃粘膜标本hp左氧氟沙星耐药检测结果
[0078]
敏感耐药混合合计数量77403120ct值范围22.2～38.521.3～38.723.5～39.0
[0079]
实施例5
[0080]
粪便标本检测。采用本发明中的方法，对120例hp感染阳性者粪便标本进行左氧氟沙星耐药检测，结果显示有43例为耐药型，另外有4例敏感/耐药混合型。结果见表4和图12。
[0081]
表4粪便标本hp左氧氟沙星耐药检测结果
[0082]
敏感耐药混合合计数量73434120ct值范围35.6～38.533.9～38.736.5～39.0

技术特征：
1.检测幽门螺杆菌左氧氟沙星耐药基因gyra261、271、272相关突变位点的引物和探针组合，其特征在于，包括seq id no.1～seq id no.13所示的引物和seq id no.14～seq id no.22所示的探针；其中，seq id no.14所示核苷酸序列从5’端起第21个碱基c为锁核酸；seq id no.15所示核苷酸序列从5’端起第21个碱基t为锁核酸；seq id no.16所示核苷酸序列从5’端起第21个碱基a为锁核酸；seq id no.17所示核苷酸序列从5’端起第21个碱基c为锁核酸；seq id no.18所示核苷酸序列从5’端起第17个碱基g为锁核酸；seq id no.19所示核苷酸序列从5’端起第17个碱基t为锁核酸；seq id no.20所示核苷酸序列从5’端起第17个碱基a为锁核酸；seq id no.21所示核苷酸序列从5’端起第19个碱基a为锁核酸；seq id no.22所示核苷酸序列从5’端起第21个碱基g为锁核酸。2.根据权利要求1所述的引物和探针组合，其特征在于，seq id no.14、seq id no.15、seq id no.18、seq id no.21、seq id no.22所示的野生探针5
′
端标记发光基团为fam，淬灭基团为bhq1；seq id no.16、seq id no.17、seq id no.19、seq id no.20所示的突变探针5
′
端标记发光基团为hex，淬灭基团为bhq1。3.一种试剂盒，其特征在于，含有权利要求1或2所述的引物和探针组合。4.根据权利要求3所述的一种试剂盒，其特征在于，还含有荧光pcr反应液、阴性对照或阳性对照中的一种或多种，所述阴性对照为左氧氟沙星敏感hp菌株的dna，所述阳性对照为左氧氟沙星耐药hp菌株的dna。5.一种检测幽门螺杆菌左氧氟沙星耐药基因gyra261、271、272相关突变位点的方法，其特征在于，以样本中dna为模板，以权利要求1或2所述的引物和探针组合进行实时荧光定量pcr，根据扩增曲线判断结果。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，实时荧光定量pcr的反应体系为：成分浓度加入量荧光pcr反应buffer2x10μl引物和探针组合混合液10μm4.6μldd水
‑‑‑
1.4μl模板
‑‑‑
4.0μl总体积
‑‑‑
20μl。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，实时荧光定量pcr的扩增程序为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性15s，65℃退火30s，10个循环；95℃15s，60℃退火30s，40个循环(采集荧光)。8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，同时设立阳性对照和ntc对照，在对照扩增有效的情况下，样本的检测结果才可信；fam通道出现扩增信号为野生型，vic通道出现扩增信号为耐药型，fam/vic通道同时出现信号为野生/突变杂合型。

技术总结
本发明公开了检测幽门螺杆菌左氧氟沙星耐药基因相关突变位点的引物和探针组合及方法，所述引物和探针组合包括SEQ ID No.1～SEQ ID No.13所示的引物和SEQ ID No.14～SEQ ID No.22所示的探针；其中，分子信标探针中添加锁核酸碱基，位于突变对应的位置。本发明采用“突变阻滞扩增(ARMS)、分子信标探针(Molecular Beacon)和锁核酸(LNA)”联合使用检测左氧氟沙星耐药的方法，通过对引物和探针的合理设计和组合，采用降落荧光PCR技术达到检测目的。该方法灵敏度高、特异性强、速度快、操作简单方便，具有很大的推广价值。具有很大的推广价值。具有很大的推广价值。


技术研发人员：刘国栋 王琦 王南苗
受保护的技术使用者：苏州长柏生物科技有限公司
技术研发日：2023.03.17
技术公布日：2023/7/26