用于人线粒体DNA拷贝数检测的核酸试剂、试剂盒及多重荧光定量PCR检测方法与流程

用于人线粒体dna拷贝数检测的核酸试剂、试剂盒及多重荧光定量pcr检测方法
技术领域
1.本公开涉及生物技术领域，具体地，涉及一种用于人线粒体dna拷贝数检测的核酸试剂、试剂盒及多重荧光定量pcr检测方法。


背景技术：

2.线粒体是独立存在于细胞核外且唯一具有dna的代谢性细胞器，线粒体dna(mtdna)是细胞内独立于核基因组之外并承载线粒体遗传密码的物质。线粒体dna可参与蛋白质的合成、转录与复制，在人体生理及病理过程中发挥着重要功能，具有较高的研究价值。
3.迄今已知，人线粒体dna共包含37个基因，编码了2种rrna(12s rrna和16s rrna)、22种trna以及13种多肽。由于线粒体dna的特殊性，例如缺乏组蛋白的保护以及修复系统不完善，导致其具有高度不稳定性，因此线粒体dna相较于核内基因组更容易发生突变。受环境变化影响，线粒体dna拷贝数会发生波动，进而影响组成基因的转录水平。线粒体dna拷贝数变异与许多年龄相关疾病的发生、发展密切相关，这些疾病包括代谢综合征、心血管疾病、神经退行性疾病和癌症等疾病。有研究表明，外周血线粒体dna拷贝数与内脏脂肪有关，线粒体dna拷贝数是代谢紊乱的潜在预测指标。另外，一些癌症中，特别是膀胱癌、乳腺癌和肾癌，相对于对应的正常组织，线粒体dna有耗尽的趋势。然而，导致肿瘤组织细胞中线粒体dna拷贝数异常的分子机制至今尚不十分清楚。因此，建立一种高通量的人线粒体dna拷贝数检测方法对于揭示细胞衰老进程、预测代谢紊乱、癌症筛查、诊断及预后以及评估个体健康水平有重要意义。
4.目前，测定线粒体dna拷贝数常用的方法是pcr荧光定量法，该法因操作便捷、测定时间短，可广泛应用于人群研究。但是，目前大部分研究采用的方法是分别定量单拷贝基因和线粒体基因来测定线粒体dna的相对拷贝数，在这种方法中，不同反应孔间多次移液加样会产生较大的系统误差，而为了降低该误差，已有学者提出了改进的荧光定量pcr检测方法，即在一组反应、同一反应孔中同时收集线粒体dna荧光信号和单拷贝基因荧光信号。即便如此，检测结果准确性仍然有待提高，有必要从多个方面优化用于检测线粒体dna拷贝数的荧光定量pcr方案，以显著提升其检测准确性。


技术实现要素：

5.本公开的目的是克服现有技术中检测人线粒体dna拷贝数的准确性仍然有待提升的缺陷，提供一种用于人线粒体dna拷贝数检测的核酸试剂、试剂盒及多重荧光定量pcr检测方法。
6.为了实现上述目的，本公开提供一种用于人线粒体dna拷贝数检测的核酸试剂，所述核酸试剂包括能够特异性扩增人线粒体dna的引物，以及能够特异性扩增白蛋白基因的引物。
7.可选地，所述能够特异性扩增人线粒体dna的引物包括如seq id no.1-2所示的引物；
8.和/或，所述能够特异性扩增白蛋白基因的引物包括如seq id no.3-4所示的引物。
9.可选地，seq id no.1所示引物、seq id no.2所示引物、seq id no.3所示引物和seq id no.4所示引物的摩尔比为(0.06～0.08)：(0.06～0.08)：(0.10～0.15)：(0.10～0.15)。
10.可选地，seq id no.1所示引物为特异性扩增人线粒体dna的上游引物(mt-f)，seq id no.2所示引物为特异性扩增人线粒体dna的下游引物(mt-r)，seq id no.3所示引物为特异性扩增白蛋白基因的上游引物(alb-f)，seq id no.4所示引物为特异性扩增白蛋白基因的下游引物(alb-r)。
11.可选地，seq id no.1所示引物为cacccaagaacagggtttgt；seq id no.2所示引物为tggccatgggtatgttgtta；seq id no.3所示引物为cggcggcgggcggcgcgggctgggcggaaatgctgcacagaatccttg；seq id no.4所示引物为gcccggcccgccgcgcccgtcccgccggcatggtcgcctgttcac。
12.本公开还提供了一种用于人线粒体dna拷贝数检测的试剂盒，该试剂盒含有上述任意一项所述的核酸试剂。
13.可选地，所述试剂盒还包括pcr扩增预混液、参考标准品、参比染料和无酶水；
14.可选地，所述pcr扩增预混液包括反应缓冲液、green i、dntps、mg
2+
、rtaq dna聚合酶以及抗dna聚合酶抗体的2
×
预混液；
15.可选地，所述参考标准品包括人全血dna提取物；
16.可选地，所述人全血dna提取物由不少于3000个人的全血dna混合得到；可选地，人全血dna提取物来源的人群年龄跨度为20～60岁；
17.可选地，所述参比染料包括rox reference dye；
18.可选地，以体积计，所述pcr扩增预混液的用量是所述参比染料用量的100倍以上，优选为500倍。
19.本公开提供的试剂盒用于人线粒体dna拷贝数检测时，可先根据待测样本dna的浓度将参考标准品稀释配置成一系列浓度的标准品试剂，形成标准系列浓度梯度，使待测样本dna的浓度包含于标准系列浓度梯度范围内，然后根据既定的加样量将四种引物、实时定量pcr扩增的预混合溶液、参比染料及无酶水与各浓度的标准品和待测样本分别混合形成扩增反应体系，进行pcr反应。
20.本公开还提供了一种非诊断目的的人线粒体dna拷贝数的多重荧光定量pcr检测方法，包括如下步骤：
21.(1)采用多重荧光定量pcr法对待测样本的dna样品进行扩增和荧光检测，确定所述dna样品中的人线粒体dna对应的ct值ct1，以及内参基因对应的ct值ct2，其中，所述内参基因为白蛋白基因；
22.(2)基于所述dna样品中所述人线粒体dna对应的ct值ct1，以及第一预设标准曲线，确定所述dna样品中所述人线粒体dna的相对含量mt；基于所述dna样品中所述内参基因对应的ct值ct2，以及第二预设标准曲线，确定所述dna样品中所述内参基因的相对含量s；
23.其中，所述第一预设标准曲线指示参考标准品中的人线粒体dna对应的ct值ct1′
与所述参考标准品中人线粒体dna的相对含量的关联关系；所述第二预设标准曲线指示参考标准品中的内参基因对应的ct值ct2′
与所述参考标准品中内参基因的相对含量的关联关系；
24.(3)基于所述dna样品中所述人线粒体dna的相对含量mt以及所述内参基因的相对含量s，确定所述dna样品中所述人线粒体dna与所述内参基因的相对拷贝数mt/s。
25.可选地，步骤(1)中，基于上述任一项所述的核酸试剂或者试剂盒，采用多重荧光定量pcr法对待测样本的dna样品进行扩增和荧光检测。
26.可选地，所述扩增和荧光检测的反应体系包括：
27.pcr扩增预混液4～5μl；
28.10μm的seqidno.1所示引物0.06～0.08μl；
29.10μm的seqidno.2所示引物0.06～0.08μl；
30.10μm的seqidno.3所示引物0.10～0.15μl；
31.10μm的seqidno.4所示引物0.10～0.15μl；
32.参比染料0.04～0.05μl；
33.dna样品1～2μl；
34.补充无酶水至10μl。
35.可选地，所述扩增和荧光检测的反应过程包括：
36.95℃15min；
37.95℃15s，38个循环；
38.58℃20s；
39.72℃30s，收集人线粒体dna对应的ct值；
40.85℃30s，收集内参基因对应的ct值。
41.可选地，所述标准曲线基于至少5个浓度梯度的参考标准品溶液获得；
42.可选地，所述至少5个浓度梯度的参考标准品溶液中，任一参考标准品溶液的浓度为dna样品溶液的浓度的0.0625-10倍；
43.可选地，所述至少5个浓度梯度的参考标准品溶液中，参考标准品溶液的最低浓度不高于dna样品溶液的浓度，参考标准品溶液的最高浓度不低于dna样品溶液的浓度；
44.可选地，所述至少5个浓度梯度的参考标准品溶液中，参考标准品溶液的最低两个浓度小于dna样品溶液的浓度，参考标准品溶液的最高两个浓度大于dna样品溶液的浓度；
45.可选地，所述dna样品溶液的浓度为0.625～40ng/μl。
46.本公开的有益效果在于：
47.1、本公开提供的核酸试剂、试剂盒及检测方法，以稳定性更高的白蛋白基因作为内参基因，显著改善了mmqpcr的荧光收集效果，用于人线粒体dna拷贝数检测时，操作简便、系统误差小、准确性高、灵敏度高，适用于大样本数量、大年龄跨度人群的快速检测。
48.2、本公开提供的核酸试剂、试剂盒及检测方法，人线粒体dna和内参基因均出峰稳定，溶解曲线光滑，无明显非特异性扩增产物；其中，能够特异性扩增白蛋白基因的引物序列比常规引物序列增加了富含gc-clamp的序列，这能够显著提高单色多重荧光定量pcr检测结果中内参基因的tm值，使得对样本进行单色多重荧光定量pcr检测时，线粒体基因和内
参基因之间不会存在荧光收集重叠情况。
49.3、本公开提供的核酸试剂、试剂盒及检测方法，对引物配比进行了优化，显著缩小了pcr熔解曲线中线粒体dna峰和内参基因峰两个峰的峰值差异。通过优化引物浓度和引物pcr上样量，使得引物在反应体系中最终达到了特定的配比。实验结果表明，一方面，在本公开特定的引物配比条件下，pcr反应能够使扩增效率保持在90.00％～110.00％的同时获得更加理想的(＞0.990)标准曲线线性r2；另一方面，使用本公开特定的引物配比能够显著缩小pcr熔解曲线中人线粒体dna峰和内参基因峰两个峰的峰值差异，通过观察两个基因的熔解曲线，明显观察到两个基因的特异性扩增情况。
50.4、本公开提供的核酸试剂、试剂盒及检测方法，使用特定的扩增和荧光检测反应过程，有利于有效收集两个基因的信号，减少互相干扰。本公开的pcr反应程序在较早的循环中，pcr温度处于72℃时，人线粒体dna的ct值已经被收集完成，而此时内参基因的信号仍处于基线，在85℃时，此时采集了内参基因的ct值，而线粒体dna产物由于已经全部熔解，已经收集不到信号，减少了信号干扰。
51.本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
52.为了更清楚地说明本公开具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本公开的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
53.图1是本公开实施例2检测方法中标准品的标准系列中单拷贝基因(白蛋白)的扩增曲线图；
54.图2是本公开实施例2检测方法中标准品的标准系列中线粒体基因的扩增曲线图；
55.图3是本公开实施例2检测方法中标准品的标准系列中线粒体基因的熔解曲线图，图中左峰为线粒体基因信号，右峰为内参基因信号；
56.图4是本公开实施例2检测方法中标准品的标准系列中线粒体基因的pcr产物电泳图，图中下边条带为线粒体基因，上边条带为内参基因；
57.图5是本公开实施例2检测方法中标准品的标准系列中线粒体基因(a)和内参基因(b)的扩增效率。
具体实施方式
58.提供下述实施例是为了更好地进一步理解本公开，并不局限于所述最佳实施方式，不对本公开的内容和保护范围构成限制，任何人在本公开的启示下或是将本公开与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本公开相同或相近似的产品，均落在本公开的保护范围之内。
59.实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
60.实施例1
61.本实施例提供一种用于人线粒体dna拷贝数检测的试剂盒，本试剂盒内共有8支产品，具体包括：
62.1、参考标准品1支：
63.参考标准品中人全血dna的浓度为90ng/μl，样本来自于3000人份的全血dna混样(年龄20～60岁)；
64.2、引物4支：
65.分别包括特异性扩增人线粒体基因的上、下游引物(按管身提示加入相应体积的ddh2o后浓度为10μm)和特异性扩增单拷贝基因(白蛋白)的上、下游引物(按管身提示加入相应体积的ddh2o后浓度为10μm)。具体引物序列如下：
[0066][0067]
3、sybr qpcr mix 1支：
[0068]
内含反应缓冲液、green i、dntps、mg
2+
、rtaq dna聚合酶及抗dna聚合酶抗体的2
×
预混液；
[0069]
4、rox reference dye 1支；
[0070]
5、ddh2o 1支。
[0071]
实施例2
[0072]
一种非诊断目的的人线粒体dna拷贝数检测方法，使用实施例1所述的试剂盒，包括以下步骤：
[0073]
1.提取待测基因组dna，配制dna浓度为5ng/μl的待测样品。
[0074]
2.取试剂盒中的标准品，根据待测样品溶液中dna的浓度配制标准系列浓度梯度的参考标准品溶液，使待测样品溶液的dna浓度包含于标准系列浓度梯度中，本实施例中的标准系列浓度梯度为40ng/μl、20ng/μl、10ng/μl、5ng/μl、2.5ng/μl、1.25ng/μl、0.625ng/μl。
[0075]
3.将待测样品溶液和系列参考标准品溶液分别利用单色多重荧光定量pcr(mmqpcr)方法进行检测，以白蛋白(alb)基因作为内参基因，分别测定待测样品溶液中人线粒体dna对应的ct值ct1、内参基因对应的ct值ct2，以及各参考标准品溶液中人线粒体dna对应的ct值ct1′
和内参基因对应的ct值ct2′
。
[0076]
单色多重荧光定量pcr(mmqpcr)方法的反应体系如表1所示。加样方法具体是根据下表1的加样量将待测样品溶液/参考标准品溶液和试剂盒中的各试剂加入同一反应孔内进行反应。
[0077]
表1单色多重荧光定量pcr(mmqpcr)方法的反应体系
[0078][0079]
单色多重荧光定量pcr(mmqpcr)方法的反应程序的设置如下：
[0080]
stage1(hold stage)：1cycle：95℃15min；
[0081]
stage2(pcr stage)：38cycle：95℃15s；58℃20s；72℃30s收集人线粒体dna对应的ct值；85℃30s收集内参基因对应的ct值。
[0082]
4.检测所得的各参考标准品溶液中人线粒体dna对应的ct值ct，
′
和内参基因对应的ct值ct2′
如表2所示。
[0083]
表2各参考标准品溶液的ct1′
值和ct2′
值
[0084][0085][0086]
基于表2中的数据，分别以各参考标准品溶液中人线粒体dna对应的ct值ct1′
和内参基因对应的ct值ct2′
为纵坐标，分别以各参考标准品溶液对应的log
10
(mt)、log
10
(s)为横坐标，绘制第一标准曲线和第二标准曲线，其中，mt为人线粒体dna含量，s为内参基因dna含量。其中，第一标准曲线如图5a所示，表达式为：ct1′
＝-3.48
×
log
10
(mt)+23.465，r2＝0.999；第二标准曲线如图5b所示，表达式为：ct2′
＝-3.39
×
log
10
(s)+30.936，r2＝0.999。
[0087]
由图5a和图5b可以看出，在参考标准品溶液的dna含量为0.625ng/μl-40ng/μl的范围内，各参考标准品溶液中人线粒体dna对应的ct值和内参基因对应的ct值分别与各参考标准品溶液对应的log
10
(mt)、log
10
(s)呈线性关系，说明该方法具有较好的灵敏度。
[0088]
5.检测所得的待测样品溶液中人线粒体dna对应的ct值的平均数ct1＝20.968；内参基因对应的ct值的平均数ct2＝29.045；带入上述第一标准曲线和第二标准曲线中，计算得到待测样品溶液中人线粒体dna的相对拷贝数mt/s比值为5.22/3.61＝1.45。
[0089]
6.检测效果
[0090]
实施例2检测结果显示，使用实施例1的试剂盒、采用实施例2的检测方法，得到的
参考标准品中单拷贝基因(白蛋白)和人线粒体基因的标准系列出峰稳定(参见图1、图2)，熔解曲线光滑且双峰差异不大(参见图3)，无明显非特异性扩增产物，电泳图无明显非特异性扩增产物(参见图4)。
[0091]
由图4可以看出，pcr产物的琼脂糖凝胶电泳分析结果中，目的基因扩增产物带的大小与设计大小相同，条带清晰，内参基因扩增产物带的大小与设计大小相同，条带清晰，且产物中无非特异扩增产物带，说明本方法的特异性较好。
[0092]
以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
[0093]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0094]
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

技术特征：
1.一种用于人线粒体dna拷贝数检测的核酸试剂，其特征在于，所述核酸试剂包括能够特异性扩增人线粒体dna的引物，以及能够特异性扩增白蛋白基因的引物。2.根据权利要求1所述的核酸试剂，其特征在于，所述能够特异性扩增人线粒体dna的引物包括如seqidno.1-2所示的引物；和/或，所述能够特异性扩增白蛋白基因的引物包括如seqidno.3-4所示的引物。3.根据权利要求2所述的核酸试剂，其特征在于，seqidno.1所示引物、seqidno.2所示引物、seqidno.3所示引物和seqidno.4所示引物的摩尔比为(0.06～0.08)∶(0.06～0.08)∶(0.10～0.15)∶(0.10～0.15)。4.一种用于人线粒体dna拷贝数检测的试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有权利要求1～3中任意一项所述的核酸试剂。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括pcr扩增预混液、参考标准品、参比染料和无酶水；可选地，所述pcr扩增预混液包括反应缓冲液、greeni、dntps、mg
2+
、rtaqdna聚合酶以及抗dna聚合酶抗体的2
×
预混液；可选地，所述参考标准品包括人全血dna提取物；可选地，所述人全血dna提取物由不少于3000个人的全血dna混合得到；可选地，所述参比染料包括roxreferencedye；可选地，以体积计，所述pcr扩增预混液的用量是所述参比染料用量的100倍以上，优选为500倍。6.一种非诊断目的的人线粒体dna拷贝数的多重荧光定量pcr检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)采用多重荧光定量pcr法对待测样本的dna样品进行扩增和荧光检测，确定所述dna样品中的人线粒体dna对应的ct值ct1，以及内参基因对应的ct值ct2，其中，所述内参基因为白蛋白基因；(2)基于所述dna样品中所述人线粒体dna对应的ct值ct1，以及第一预设标准曲线，确定所述dna样品中所述人线粒体dna的相对含量mt；基于所述dna样品中所述内参基因对应的ct值ct2，以及第二预设标准曲线，确定所述dna样品中所述内参基因的相对含量s；其中，所述第一预设标准曲线指示参考标准品中的人线粒体dna对应的ct值ct1′
与所述参考标准品中人线粒体dna的相对含量的关联关系；所述第二预设标准曲线指示参考标准品中的内参基因对应的ct值ct2′
与所述参考标准品中内参基因的相对含量的关联关系；(3)基于所述dna样品中所述人线粒体dna的相对含量mt以及所述内参基因的相对含量s，确定所述dna样品中所述人线粒体dna与所述内参基因的相对拷贝数mt/s。7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，基于权利要求1-3中任一项所述的核酸试剂或者权利要求4或5中所述的试剂盒，采用多重荧光定量pcr法对待测样本的dna样品进行扩增和荧光检测。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述扩增和荧光检测的反应体系包括：pcr扩增预混液4～5μl；10μm的seqidno.1所示引物0.06～0.08μl；10μm的seqidno.2所示引物0.06～0.08μl；
10μm的seqidno.3所示引物0.10～0.15μl；10μm的seqidno.4所示引物0.10～0.15μl；参比染料0.04～0.05μl；dna样品1～2μl；补充无酶水至10μl。9.根据权利要求7或8所述的检测方法，其特征在于，所述扩增和荧光检测的反应过程包括：95℃15min；95℃15s，38个循环；58℃20s；72℃30s，收集人线粒体dna对应的ct值；85℃30s，收集内参基因对应的ct值。10.根据权利要求6-9中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述标准曲线基于至少5个浓度梯度的参考标准品溶液获得；可选地，所述至少5个浓度梯度的参考标准品溶液中，任一参考标准品溶液的浓度为dna样品溶液的浓度的0.0625-10倍；可选地，所述至少5个浓度梯度的参考标准品溶液中，参考标准品溶液的最低浓度不高于dna样品溶液的浓度，参考标准品溶液的最高浓度不低于dna样品溶液的浓度；可选地，所述至少5个浓度梯度的参考标准品溶液中，参考标准品溶液的最低两个浓度小于dna样品溶液的浓度，参考标准品溶液的最高两个浓度大于dna样品溶液的浓度；可选地，所述dna样品溶液的浓度为0.625～40ng/μl。

技术总结
本公开涉及生物技术领域，具体地，涉及一种用于人线粒体DNA拷贝数检测的核酸试剂、试剂盒及多重荧光定量PCR检测方法。所述核酸试剂包括能够特异性扩增人线粒体DNA的引物，以及能够特异性扩增白蛋白基因的引物。本公开提供的核酸试剂、试剂盒及检测方法，以白蛋白基因作为内参基因，用于人线粒体DNA拷贝数检测时，操作简便、系统误差小、准确性高、灵敏度高，适用于大样本数量、大年龄跨度人群的快速检测。测。测。


技术研发人员：段化伟 王艳华 袁慧阁
受保护的技术使用者：中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所
技术研发日：2023.02.22
技术公布日：2023/7/26