药物组合物的制作方法

1.本发明涉及生物药物制剂研究领域，具体而言，本发明涉及一种新型的经人工设计的抗体的组合物，特别是人源化抗pd-l1和tgf-β的双功能单域抗体-配体捕获fc融合蛋白药物的水针组合物的配制方法。本发明还涉及该双抗组合物的治疗和诊断用途，特别是在治疗、预防和/或诊断pd-l1/tgf-β相关疾病，例如癌症中的用途。
2.背景概述
3.tgf-β和pd-l1均是肿瘤微环境中重要的抑制性分子，它们的双重抑制可能导致抗肿瘤活性的增强，国内外已开展多项以tgf-β/pd-l1为靶点的双功能抗体临床研究，tgf-β和pd-l1的联合使用是一种很有前景的治疗策略。。
4.抗pd-l1和tgf-β的双功能单域抗体-配体捕获fc融合蛋白为生物大分子，结构复杂，在生产和贮存过程中，会发生聚集、变性、沉淀等物理变化及异构化、脱酰胺和氧化等化学变化。这些改变会影响产品的安全性及有效性，目前市场上尚无适合的稳定制剂存在，可以使pd-l1和tgf-β的双功能单域抗体保持更长时间的稳定性。因此，需要一种稳定的制剂配方，保证抗体进入患者体内前仍具有治疗所需的生物活性。


技术实现要素：

5.本发明旨在解决现有技术中，双特异性抗体分子储存运输过程中，聚集、变性、沉淀等问题，具体来说，解决pd-l1和tgf-β的双功能单域抗体-配体捕获fc融合蛋白组合物安全性和有效性的技术问题。为此，本发明的一个目的在于制备pd-l1/tgf-β双抗的稳定组合物。
6.需要说明的是，本发明是基于发明人的下列工作而完成的：
7.双特异性抗体代表了一种新兴的治疗策略，即可以同时识别和结合两种不同的抗原从而发挥特殊的功能，例如将免疫细胞特异地与肿瘤细胞连接，增强其杀伤作用；同时结合肿瘤细胞上的两种抗原，阻断双重信号通路，降低肿瘤耐药性。而且，双功能策略有可能规避联合免疫治疗的局限性。相比于单克隆抗体而言，双特异性抗体具有更高的灵敏度和特异性，在抗肿瘤药物的研发中有广阔的开发和应用前景。
8.组合物的缓冲体系及ph是影响抗体类蛋白药物稳定性的关健因素之一。为了该抗体的保存，本发明选择药用缓冲剂作为抗体的溶剂，该药用缓冲剂包含但不限于柠檬酸/柠檬酸钠混合物、醋酸/醋酸盐混合物和组氨酸/组氨酸盐酸盐混合物。发明人优选缓冲体系为柠檬酸/柠檬酸钠混合物，柠檬酸缓冲体系具有很强的缓冲能力和对蛋白的保护作用，缓冲液浓度为20mm，ph 6.0。为了防止蛋白降解引起的药物活性降低，发明人将蛋白浓度设定为50mg/ml。为了增加抗体组合物稳定性，在一些实施例中添加糖类作为稳定剂，添加的糖类包含但不限于甘露醇、海藻糖和蔗糖，其中优选糖类为蔗糖，浓度为7％(w/v)。
9.因而，根据本发明实施例的一个方面，提供了一种药物组合物，包括：
10.30-70mg/ml抗体；
11.15-25mm酸性缓冲液；
12.5-10％(w/v)稳定剂；以及
13.0.02-0.1％(w/v)表面活性剂。
14.根据本发明实施例的药物组合物，配方简单，蛋白体系稳定，便于大规模生产、贮存和运输，有效解决了抗体分子因结构复杂，在生产、贮存和运输过程中，容易发生聚集、变性、沉淀等物理变化及异构化、脱酰胺和氧化等化学变化的问题，并且，本发明实施例组合物中抗体分子的安全性及有效性显著提高。
15.另外，根据本发明上述实施例的抗体或抗原结合片段，还可以具有如下附加的技术特征：
16.根据本发明的实施例所述药物组合物的剂型为注射剂，优选地，为液体注射剂。也就是说，所述的药物组合物为抗体的水针制剂。
17.根据本发明的实施例，所述的药物组合物，所述抗体为单域抗体。单域抗体分子量小，组织穿透性好，对于一些实体瘤，本发明实施例的组合物可以更好的到达肿瘤组织深层，起到治疗效果。
18.根据本发明的实施例，所述抗体针对pd-l1和/或tgf-β。本发明实施例的抗体组合物可以是pd-l1抗体制剂，也可以是tgf-β抗体制剂，也可以是同时含有pd-l1和tgf-β两种抗体的抗体制剂，还可以是pd-l1/tgf-β双抗抗体制剂，有效解决了抗pd-l1和tgf-β的双功能抗体分子因结构复杂，在生产、贮存和运输过程中，容易发生聚集、变性、沉淀等物理变化及异构化、脱酰胺和氧化等化学变化的问题，并且，本发明实施例组合物中抗体分子的安全性及有效性显著提高。
19.根据本发明的实施例，所述抗体为融合蛋白。本实施例针对抗pd-l1和tgf-β的双功能单域抗体-配体捕获fc融合蛋白进行药物组合物的研发，助力肿瘤的诊断和治疗。
20.根据本发明的实施例，针对tgf-β的所述抗体为tgf-βrii突变体，与野生型tgf-βrii相比，所述tgf-βrii突变体在一个或多个选自由以下位点所组成的组中的氨基酸残基位点处存在突变：第6位、第12位、第20位。与野生型tgf-βrii相比，tgf-βrii突变体能够结合tgf-β，在重组表达时具有更少的断裂和/或降解，便于大规模生产，质量更稳定的抗体/tgf-βrii双功能蛋白。针对tgf-β的所述抗体的详细信息参见专利202010721371.4。
21.根据本发明的实施例，所述tgf-βrii突变体相对于野生型tgf-βrii具有选自下组中的一种或几种突变：q6n，d12t，g20t。该突变体包括两个以上功能片段，所述功能片段还包括抗体或其抗原结合部分、受体或其配体结合部分、细胞因子或其片段、细胞毒素或其变体、标记物或示踪物等，能够结合tgf-β1、tgf-β2和tgf-β3。根据本发明的一些实施例，tgf-βrii突变体的序列如seq id no:9所示，对应的核苷酸序列如seq id no:8所示。
22.根据本发明的实施例，针对pd-l1的所述抗体cdr1-cdr3分别包括与seq id no:1-3所示的氨基酸序列具有75％以上一致性的氨基酸序列。
23.进而，根据本发明的实施例，针对pd-l1的所述抗体的重链可变区的氨基酸序列具有与seq id no:4所示的氨基酸序列具有75％以上一致性的氨基酸序列。
24.具体地，可以在cdrs上进行一个或几个氨基酸的修饰、删除、插入或替换获得cdrs的相关突变体，这些突变体与seq id no:1-3所示的cdr是具有75、80、85、90、95、98、或99％以上一致性的氨基酸序列。对cdr1进行突变，根据本发明的一些实施例，针对pd-l1的所述抗体cdr1包括与seq id no:5所示的氨基酸序列。针对pd-l1的所述抗体的重链可变区的氨
基酸序列具有与seq id no:6所示的氨基酸序列具有75％以上一致性的氨基酸序列，对应的核苷酸序列如seq id no:7所示。
25.根据本发明的实施例，针对pd-l1的所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:4所示。该pd-l1抗体序列由人pd-l1免疫骆驼提取pbmc构建噬菌体表面展示vhh抗体库，筛选鉴定获得抗人pd-l1特异性单可变域抗体2-2f2，在此基础上制备嵌合抗体chf2和人源化改造的抗体hzf2突变体。所述hzf2突变体的亲和力能够达到甚至超过出发单可变域抗体2-2f2，在体外能够阻断pd-1和pd-l1的结合，在荷瘤小鼠体内试验中能够抑制肿瘤的生长。针对pd-l1的所述抗体的详细信息参见专利cn202010324761.8。
26.根据本发明的实施例，所述酸性缓冲液为柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液、醋酸/醋酸盐缓冲液和组氨酸/组氨酸盐缓冲液中的至少一种，优选地，为柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液。在本发明的一个实施例中，采用柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液；在本发明的一个实施例中，采用醋酸/醋酸盐缓冲液；在本发明的一个实施例中，采用组氨酸/组氨酸盐缓冲液。组合物的缓冲体系是影响抗体类蛋白药物稳定性的关健因素之一，上述三种缓冲液有助于抗pd-l1和tgf-β的双功能单域抗体-配体捕获fc融合蛋白药物的稳定性，提高抑瘤效果，其中以柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液效果更佳。
27.根据本发明的实施例，所述稳定剂为糖类。抗体的主要成分是蛋白质，要保持抗体的活性，往往需要添加蛋白质稳定剂，本发明实施例采用糖类作为稳定剂，提高蛋白稳定性。
28.根据本发明的实施例，所述糖类为甘露醇、海藻糖和蔗糖中的至少一种，优选地，为蔗糖。在本发明的一个实施例中，采用甘露醇作为稳定剂；在本发明的一个实施例中，采用海藻糖作为稳定剂；在本发明的一个实施例中，采用蔗糖作为稳定剂。蔗糖不仅能够作为抗体的保护剂和赋形剂，同时还具有调节渗透压摩尔浓度的作用，进而，有助于抗pd-l1和tgf-β的双功能单域抗体-配体捕获fc融合蛋白药物的稳定性，提高抑瘤效果。
29.根据本发明的实施例，所述表面活性剂为聚山梨酯80(ps80)或聚山梨酯20。
30.根据本发明的实施例，所述药物组合物的ph为5.0-6.5，优选地，为5.7-6.3。ph筛选有助于更好的保存抗体组合物，以及在进入人体后更好的产生药效。本发明实施例药物组合物的ph，可以是5.0、5.1、5.2、5.3等，5.0-6.5之间的任一数值，优选为5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3等，5.7-6.3之间的任一数值。
31.根据本发明的实施例，所述抗体的浓度为40-60mg/ml。本发明实施例药物组合物的浓度可以是40-60mg/ml之间的任一浓度，适宜的浓度有助于蛋白质发挥作用，pd-l1/tgf-β双抗在该浓度下具有更好的稳定性。
32.根据本发明的实施例，所述酸性缓冲液的浓度为15-25mm。本发明实施例药物组合物的缓冲液浓度可以是15-25mm之间的任一浓度，例如，18、20、22、24mm等，适宜的缓冲液浓度有助于维持ph，pd-l1/tgf-β双抗在该ph条件下具有更好的稳定性。
33.根据本发明的实施例，所述稳定剂的浓度为6-8％(w/v)。本发明实施例药物组合物的稳定剂浓度可以是6-8％(w/v)之间的任一浓度，例如6.5％、7％或7.5％等，适宜的稳定剂浓度有助于蛋白质更好的维持稳定性，pd-l1/tgf-β双抗在该稳定剂浓度下具有更好的稳定性。
34.根据本发明的实施例，所述表面活性剂的浓度为0.02-0.1％(w/v)。本发明实施例
药物组合物的表面活性剂浓度可以是0.02-0.1％(w/v)之间的任一浓度，适宜的表面活性剂浓度有助于维持蛋白质发挥稳定性，pd-l1/tgf-β双抗在该表面活性剂浓度下具有更好的稳定性。
35.根据本发明的实施例，所述药物组合物选自下列组合之一：
36.(1)50mg/ml所述抗体、20mm所述柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液、5％(w/v)所述甘露醇、0.02％(w/v)所述聚山梨酯80，且ph为6.0；
37.(2)50mg/ml所述抗体、20mm所述柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液、3％(w/v)所述甘露醇、0.02％(w/v)所述聚山梨酯80，且ph为6.0；
38.(3)50mg/ml所述抗体、20mm所述柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液、5％(w/v)所述海藻糖、0.02％(w/v)所述聚山梨酯80，且ph为6.0；
39.(4)50mg/ml所述抗体、20mm所述柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液、5％(w/v)所述蔗糖、0.02％(w/v)所述聚山梨酯80，且ph为6.0；
40.(5)50mg/ml所述抗体、20mm所述柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液、7％(w/v)所述蔗糖、0.05％(w/v)所述聚山梨酯80，且ph为6.0；
41.(6)50mg/ml所述抗体、20mm所述组氨酸/组氨酸盐缓冲液、5％(w/v)所述甘露醇、0.02％(w/v)所述聚山梨酯80，且ph为6.0；
42.(7)50mg/ml所述抗体、20mm所述组氨酸/组氨酸盐缓冲液、5％(w/v)所述甘露醇、0.02％(w/v)所述聚山梨酯80，且ph为6.5；
43.(8)50mg/ml所述抗体、20mm所述柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液、5％(w/v)所述甘露醇、0.02％(w/v)所述聚山梨酯80，且ph为6.5；
44.(9)50mg/ml所述抗体、所述20mm醋酸/醋酸盐缓冲液、5％(w/v)甘露醇、0.02％(w/v)聚山梨酯80，且ph为5.5。
45.根据本发明上述实施例的，发明人发现，本发明实施例所得抗pd-l1和tgf-β的双功能单域抗体-配体捕获fc融合蛋白药物稳定组合物，由双特异蛋白、缓冲液、保护剂和表面活性剂组成，工艺简单合理，成本低廉，稳定性强，尤其对肿瘤的预防与治疗有着显著的作用，副作用低。
46.为更好理解本发明，首先定义一些术语。其他定义则贯穿具体实施方式部分而列出。
47.术语“特异性”是指在蛋白和/或其他生物异质群体中确定是否存在所述蛋白。因此，在所指定的条件下，特定的配体/抗原与特定的受体/抗体结合，并且并不以显著的量与样本中存在的其它蛋白结合。
48.本文中的术语“抗体”意在包括全长抗体及其任何抗原结合片段(即，抗原结合部分)或单链。全长抗体是包含至少两条重(h)链和两条轻(l)链的糖蛋白，重链和轻链由二硫键连接。各重链由重链可变区(简称vh)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域构成，即ch1、ch2和ch3。各轻链由轻链可变区(简称vl)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域cl构成。vh和vl区还可以划分为称作互补决定区(cdr)的高变区，其由较为保守的框架区(fr)区分隔开。各vh和vl由三个cdr以及四个fr构成，从氨基端到羧基端以fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4的顺序排布。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括多种免疫系统细胞(例
如，效应细胞)和传统补体系统的第一组分(c1q)。
49.术语“双特异性抗体”(bispecific antibodies)，一种可与相同或不同抗原上的不同表位结合的抗体结构。因此，双特异性抗体能够桥连两种不同的分子，起到将效应分子、效应细胞、病毒和药物载体系统招募至靶标结构的作用。双特异性抗体这种可同时识别两种不同分子(受体和/或配体)的特点，提高了抗体的选择性和功能性亲和力。
50.术语“单克隆抗体”或“单抗”或“单克隆抗体组成”是指单一分子组成的抗体分子制品。单克隆抗体组成呈现出对于特定表位的单一结合特异性和亲和力。
51.本文中的术语，抗体的“抗原结合片段”(或简称为抗体部分)，是指抗体的保持有特异结合抗原能力的一个或多个片段。已证实，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来实施。包含在抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的例子包括(i)fab片段，由vl、vh、cl和ch1构成的单价片段；(ii)f(ab
′
)2片段，包含铰链区二硫桥连接的两个fab片段的二价片段；(iii)由vh和ch1构成的fd片段；(iv)由抗体单臂vl和vh构成的fv片段；(v)由vh构成的dab片段(ward et al.，(1989)nature 341：544-546)；(vi)分离的互补决定区(cdr)；以及(vii)纳米抗体，一种包含单可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。此外，尽管fv片段的两个结构域vl和vh由不同的基因编码，它们可以通过重组法经由使两者成为单蛋白链的合成接头而连接，其中vl和vh区配对形成单价分子(称为单链fc(scfv)；参见例如bird et al.，(1988)science 242：423-426；and huston et al.，(1988)proc.natl.acad.sci.usa 85：5879-5883)。这些单链抗体也意在包括在术语涵义中。这些抗体片段可以通过本领域技术人员已知的常用技术而得到，且片段可以通过与完整抗体相同的方式进行功能筛选。
52.本发明的抗原结合片段包括能够特异性结合抗原的那些。抗体结合片段的实例包括例如但不限于fab、fab'、f(ab')2、fv片段、单链fv(scfv)片段和单结构域片段。
53.fab片段含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(ch1)。fab'片段与fab片段的不同之处在于在重链ch1结构域的羧基末端处的少数残基的添加，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。通过切割在f(ab')2胃蛋白酶消化产物的铰链半胱氨酸处的二硫键产生fab'片段。抗体片段的另外化学偶联是本领域普通技术人员已知的。fab和f(ab')2片段缺乏完整抗体的片段可结晶(fc)区，从动物的循环中更快速地清除，并且可能具有比完整抗体更少的非特异性组织结合(参见例如，wahl等人，1983，j.nucl.med.24:316)。
54.如本领域通常理解的，“fc”区是不包含抗原特异性结合区的抗体的片段可结晶恒定区。在igg、iga和igd抗体同种型中，fc区由两个相同的蛋白质片段组成，衍生自抗体的两条重链的第二和第三恒定结构域(分别为ch2和ch3结构域)。igm和ige fc区在每条多肽链中含有三个重链恒定结构域(ch2、ch3和ch4结构域)。
[0055]“单结构域片段”，sda(single domain antibody)由抗原显示出足够亲和力的单个vh或vl结构域组成。在一个具体实施方案中，单结构域片段是骆驼化的(参见例如，riechmann，1999，journal of immunological methods 231:25
–
38)。
[0056]
术语“免疫球蛋白序列”均用作通用术语，包括全尺寸抗体，其单独的链，以及其所有部分、结构域或片段(分别包括但不限于抗原结合结构域或片段，如vhh结构域或vh/vl结构域)。此外，如在本文中所使用的术语“序列”(例如在“免疫球蛋白序列”、“抗体序列”、“可
变结构域序列”、“vhh序列”或“蛋白质序列”的术语中)通常应被理解为包括相关氨基酸序列以及编码其的核酸或核苷酸序列二者，除非上下文需要更有限制性的解释。
[0057]
术语“载体”和“核酸构建体”是指能够运输与其连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指其中可以连接另外的dna区段的环状双链dna环。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的dna区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们被导入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点和游离型哺乳动物载体的细菌载体)。其他载体(例如非附加型哺乳动物载体)可以在导入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，并由此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们有效连接的基因的表达。这种载体在本文中被称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。通常，在重组dna技术中有用的表达载体通常以质粒的形式存在。然而，也包括其他形式的表达载体，如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒，腺病毒和腺伴随病毒)，其起到等同的功能。
[0058]
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
具体实施方式：
[0059]
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考j.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自sigma公司。
[0060]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
[0061]
实施例1抗人pd-l1纳米抗体/tgf-βrii突变体融合蛋白的设计与表达
[0062]
通过pcr的方法，将人源化抗人pd-l1纳米抗体hzf2编码核苷酸序列(来源专利申请号：cn202010324761.8)(seq id no.7)c端经由连接肽编码核苷酸序列(seq id no.10)连入tgf-βriim编码核苷酸序列(seq id no.8)，获得含pd-l1纳米抗体-tgf-βriim编码核苷酸序列hzf2-tgf-βriim(seq id no.11)，氨基酸序列如seq id no.12所示，并通过酶切位点，克隆至含有谷氨酰氨合成酶(gs)筛选基因的稳定表达载体中，构建完成用于稳定转染的真核表达载体hzf2m9-tgf-βriim，转入大肠杆菌扩增，分离获得大量含表达hzf2-tgf-βriim融合蛋白的质粒。将制备好的质粒，电转染(nucleofector iib，lonza)悬浮培养的cho-k1细胞，通过msx加压筛选，获得稳定表达hzf2-tgf-βriim2融合蛋白的细胞hzf2-tgf-βriim。培养细胞并进行表达、纯化，获得hzf2-tgf-βriim突变体融合蛋白hzf2-tgf-βriim。
[0063]
实施例2：缓冲液体系及处方ph筛选
[0064]
将实施例1获得的融合蛋白hzf2-tgf-βriim简称为双特异蛋白，该双特异蛋白的理论等电点是5.69，蛋白纯化过程中已经发现在ph7.0条件下，蛋白稳定性较差会出现降解，故本实施例考察的双特异蛋白的液体组合物ph范围为5.0-6.5。根据该ph缓冲范围，本实施例中选择组氨酸(histidine)缓冲体系、柠檬酸(citrate)缓冲体系、醋酸(acetate)缓冲体系这几种缓冲体系进行考察，浓度为20mm。糖类保护剂筛选包括甘露醇、山梨醇、蔗糖、
海藻糖，浓度选择组合物不超过10％。缓冲体系组合物配方初筛见下表1-3。
[0065]
表1 组氨酸缓冲体系组合物配方初筛(dsf)
[0066][0067]
表2 柠檬酸缓冲体系组合物配方初筛(dsf)
[0068][0069]
表3 醋酸缓冲体系组合物配方初筛(dsf)
[0070][0071]
dsf检测tm值反映的是蛋白在该组合物配方中的构象稳定性，tm值越高则稳定性越好。根据表1、表2和表3可以发现，双特异蛋白在20mm柠檬酸缓冲体系及20mm组氨酸缓冲体系中相对tm值较高，后续以20mm柠檬酸缓冲体系及20mm组氨酸缓冲体系进一步筛选。不同糖类组分添加以及nacl组分添加，对组合物tm值影响不显著，后续需要继续筛选。在组氨酸体系下，ph5.5的tm值相对较低，组氨酸缓冲体系的主要缓冲ph范围在ph 6.0附近，继续筛选ph 6.0-6.5组氨酸缓冲体系。在柠檬酸缓冲体系下，排除双特异蛋白等电点范围，优选ph 5.5-6.0柠檬酸缓冲体系继续筛选。
[0072]
实施例3：缓冲体系稳定性试验
[0073]
在使用dsf进行组合物初筛结果的基础上，将6mw5311蛋白以目标浓度(50mg/ml)配制在待考察的不同ph的20mm组氨酸及20mm柠檬酸缓冲体系中，考察组合物样品在高温(40
±
2℃)、振荡(200rpm)以及光照(4500lx)同时作用条件下的稳定情况，待筛选配方见表4。抗体蛋白纯度检测包括sec、rsds-page和nrsds-page，结果见表5。
[0074]
表4.缓冲体系及ph组合物筛选配方
[0075][0076][0077]
表5 缓冲体系及ph组合物筛选纯度分析结果
[0078][0079]
通过3天剧烈强制降解研究，对不同组合物缓冲液条件下的蛋白纯度分析可以发现，该双特异蛋白在柠檬酸缓冲液中稳定性较好，并且ph6.0条件下的蛋白稳定性优于ph5.5。因此选择柠檬酸作为双特异蛋白组合物缓冲液，在ph6.0条件下进行后续液体组合物开发。
[0080]
实施例4：糖类保护剂筛选
[0081]
完成双特异蛋白组合物的缓冲体系及ph的筛选后，进一步对糖类保护剂进行筛选，包括甘露醇、蔗糖、海藻糖，将双特异蛋白以目标浓度(50mg/ml)配制在待考察的含不同糖类保护剂的，ph6.0的20mm柠檬酸缓冲体系中，考察组合物样品在高温(40
±
2℃)、振荡(200rpm)以及光照(4500lx)同时作用条件下，以及冻融5次(-70
±
15℃冻存12h以上，取出室温(10～30℃)放置不少于1h至完全化冻，为1次冻融)条件下的稳定性情况。待筛选配方见表6，考察蛋白sec、rce-sds纯度，结果如表7所示。
[0082]
表6 糖类保护剂筛选配方
[0083][0084]
表7 糖类保护剂筛选蛋白纯度分析结果
[0085][0086]
由检测结果可以发现，在ph6.0的20mm柠檬酸缓冲体系中，蔗糖对双特异蛋白的保护作用较优。在高温、振荡、光照同时作用条件下放置12天，以及反复冻融5次条件下，抗体蛋白在含蔗糖的处方中，rce-sds及sec纯度变化较小，选择蔗糖作为双特异蛋白液体组合物的糖类保护剂。
[0087]
实施例5：nacl含量以及ps80含量筛选
[0088]
为保证组合物渗透压摩尔浓度满足等渗要求(250～350mosm/kg)，本实施例考察30～40mm nacl，0.02％、0.05％和0.1％ps80条件下的组合物稳定性。将双特异蛋白以0.8ml/瓶灌装在2ml西林瓶中，考察样品在高温(40
±
2℃)、振荡(100rpm)以及光照(4500lx)条件下的稳定性。待筛选配方见表8。重点考察蛋白sec纯度和外观，结果见表9和表10。
[0089]
表8 nacl含量及ps80含量筛选配方
[0090][0091]
表9 nacl含量及ps80含量筛选蛋白sec分析结果
[0092][0093]
说明：4#处方振荡10天样品不合格，不再继续考察该处方。
[0094]
表10 nacl含量及ps80含量筛选外观结果
[0095][0096][0097]
由上述检测结果可以发现添加0.05％至0.1％范围的ps80，添加nacl与否，双特异蛋白均表现出良好的高温稳定性，高温作用15天后，蛋白sec纯度并未显著下降。ps80含量较低(0.02％)情况下，组合物振荡10天后会有明显的蛋白颗粒析出，外观可见异物不合格，而ps80含量在0.05％以及0.1％条件下振荡不受影响，因此，ps80的含量选择0.05％或更高浓度。在满足组合物稳定性的情况下，ps80含量优选满足要求的较低浓度，即0.05％。
[0098]
实施例6：其他添加物含量筛选
[0099]
根据双特异蛋白对光照敏感的特性，在已有的组合物配方基础上尝试添加二乙烯三胺五乙酸(dtpa)(金属离子络合物)、甲硫氨酸(met，抗氧化)，使用量参考已上市大分子抗体同类产品。将双特异蛋白配制到待筛选配方中，并以0.8ml/瓶，灌装在2ml西林瓶中，考察高温(40
±
2℃)、振荡(100rpm)以及光照(4500lx)条件下对不同组合物配方中蛋白稳定性的影响。待筛选配方见表11，蛋白sec纯度变化结果见表12。
[0100]
表11 其他添加物筛选配方
[0101][0102][0103]
表12 其他添加物筛选蛋白sec分析结果
[0104][0105]
由上述检测结果可以发现，添加met和dtpa与否，双特异蛋白均表现出良好的高温稳定性，高温作用15天，蛋白sec纯度均未显著下降。在满足组合物稳定性的情况下，本发明实施例的组合物配方选择不添加met和dtpa。
[0106]
同时发现，双特异蛋白对光照比较敏感，推测光照引起的氧化反应加速了蛋白纯度变化，光照还引起蛋白样品颜色的变化，并且随ps80含量的增多颜色变化更为明显，需将光照引起的蛋白纯度变化作为考察方向。nacl的添加主要调节渗透压摩尔浓度，其添加与否对光照的影响还有待进一步确证。
[0107]
考虑到双特异蛋白组合物在实际应用中不会长时间接收强光直射，本实施例继续考察nacl、蔗糖、met和ps80各添加组分条件下，光照10天内的颜色变化情况，结果见表13。
[0108]
表13 双特异蛋白组合物开发添加组分(20mm柠檬酸，ph6.0)
[0109][0110][0111]
由上述结果可以发现met的加入利于双特异蛋白的制剂光照稳定性，但met对蛋白其他质量方面的潜在影响暂时未知，不考虑在制剂处方中添加抗氧化物met。结果显示nacl对双特异蛋白制剂处方的光照稳定性有潜在影响，不添加nacl作为制剂处方渗透压摩尔浓度调节剂，并通过增加蔗糖用量到7％来调节渗透压摩尔浓度。在组合物的配方尽可能在保证蛋白制剂稳定性情况下添加较少的辅料物质，本发明实施例的组合物配方选择不添加met和nacl。
[0112]
实施例6：处方筛选初步稳定性确认
[0113]
组合物开发的原则是在保证蛋白组合物稳定性情况下添加较少的辅料物质，根据前期的研究结果，不再添加其他辅料物质。
[0114]
选择含有7％蔗糖和0.05％ ps80的20mm柠檬酸，ph 6.0的组合物配方进行初步稳定性研究，蛋白浓度选择50mg/ml，待确认的组合物配方见表14。
[0115]
表14 双特异蛋白待确认组合物配方
[0116][0117]
组合物配方的确认考察影响因素条件包括高温、振荡、光照、反复冻融，检测指标包括不溶性微粒、浓度(uv280)、蛋白纯度(sec、rce-sds)、结合活性(双靶点)，检测结果见表15-19。
[0118]
表15 双特异蛋白待确认组合物配方不溶性微粒分析结果
[0119][0120]
表16 双特异蛋白待确认组合物配方浓度(uv280)分析结果
[0121][0122]
表17 双特异蛋白待确认组合物配方sec分析结果
[0123][0124]
表18 双特异蛋白待确认组合物配方rce-sds分析结果
[0125][0126]
表19 双特异蛋白待确认组合物配方结合活性(双靶点)分析结果
[0127][0128]
综上所述，含有7％蔗糖和0.05％ ps80的20mm柠檬酸，蛋白浓度50mg/ml的组合物配方在ph 6.0条件下，双特异蛋白强光照射5天，蛋白sec纯度略有下降，所以该组合物需避光保存。同时发现高温(40
±
2℃)放置20天，蛋白sec、rce-sds的纯度有下降趋势，在成品实际应用过程中应严格控制保存温度。
[0129]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0130]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

技术特征：
1.一种药物组合物，其特征在于，包括：30-70mg/ml抗体；15-25mm酸性缓冲液；5-10％(w/v)稳定剂；以及0.02-0.1％(w/v)表面活性剂。2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述抗体针对pd-l1和/或tgf-β。3.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，针对pd-l1的所述抗体为单域抗体。4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，针对pd-l1和tgf-β的所述抗体为融合蛋白。5.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，针对tgf-β的所述抗体为tgf-βrii突变体，与野生型tgf-βrii相比，所述tgf-βrii突变体在一个或多个选自由以下位点所组成的组中的氨基酸残基位点处存在突变：第6位、第12位、第20位。6.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述tgf-βrii突变体相对于野生型tgf-βrii具有选自下组中的一种或几种突变：q6n，d12t，g20t。7.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，针对pd-l1的所述抗体cdr1-cdr3分别包括与seq id no:1-3所示的氨基酸序列具有75％以上一致性的氨基酸序列，任选地，针对pd-l1的所述抗体的重链可变区的氨基酸序列具有与seq idno:4所示的氨基酸序列具有75％以上一致性的氨基酸序列。8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，针对pd-l1的所述抗体cdr1分别包括seq id no:5所示的氨基酸序列，任选地，针对pd-l1的所述抗体的重链可变区的氨基酸序列包括seq idno:6所示的氨基酸序列。9.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述酸性缓冲液为柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液、醋酸/醋酸盐缓冲液和组氨酸/组氨酸盐缓冲液中的至少一种，优选地，为柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液，任选地，所述稳定剂为糖类，任选地，所述糖类为甘露醇、海藻糖和蔗糖中的至少一种，优选地，为蔗糖，任选地，所述表面活性剂为聚山梨酯80或聚山梨酯20，任选地，所述药物组合物的ph为5.0-6.5，优选地，为5.7-6.3，任选地，所述抗体的浓度为40-60mg/ml，任选地，所述酸性缓冲液的浓度为8-12mm，任选地，所述稳定剂的浓度为6-8％(w/v)，任选地，所述表面活性剂的浓度为0.02-0.1％(w/v)。10.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物选自下列组合之一：(1)50mg/ml所述抗体、20mm所述柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液、5％(w/v)所述甘露醇、0.02％(w/v)所述聚山梨酯80，且ph为6.0；(2)50mg/ml所述抗体、20mm所述柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液、3％(w/v)所述甘露醇、0.02％(w/v)所述聚山梨酯80，且ph为6.0；
(3)50mg/ml所述抗体、20mm所述柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液、5％(w/v)所述海藻糖、0.02％(w/v)所述聚山梨酯80，且ph为6.0；(4)50mg/ml所述抗体、20mm所述柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液、5％(w/v)所述蔗糖、0.02％(w/v)所述聚山梨酯80，且ph为6.0；(5)50mg/ml所述抗体、20mm所述柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液、7％(w/v)所述蔗糖、0.05％(w/v)所述聚山梨酯80，且ph为6.0；(6)50mg/ml所述抗体、20mm所述组氨酸/组氨酸盐缓冲液、5％(w/v)所述甘露醇、0.02％(w/v)所述聚山梨酯80，且ph为6.0；(7)50mg/ml所述抗体、20mm所述组氨酸/组氨酸盐缓冲液、5％(w/v)所述甘露醇、0.02％(w/v)所述聚山梨酯80，且ph为6.5；(8)50mg/ml所述抗体、20mm所述柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液、5％(w/v)所述甘露醇、0.02％(w/v)所述聚山梨酯80，且ph为6.5；(9)50mg/ml所述抗体、所述20mm醋酸/醋酸盐缓冲液、5％(w/v)甘露醇、0.02％(w/v)聚山梨酯80，且ph为5.5。11.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型为注射剂，优选地，为液体注射剂。

技术总结
本发明公开了一种药物组合物，包括：30-70mg/ml抗体；15-25mM酸性缓冲液；5-10％(w/v)稳定剂；以及0.02-0.1％(w/v)表面活性剂。该药物组合物配方简单，蛋白体系稳定，便于大规模生产、贮存和运输。本发明实施例的药物组合物有助于增强抗体分子的安全性及有效性。有助于增强抗体分子的安全性及有效性。


技术研发人员：宫皖晴 任彤 李纲
受保护的技术使用者：迈威（上海）生物科技股份有限公司
技术研发日：2023.01.18
技术公布日：2023/7/26