共表达外源基因的肿瘤靶向性溶瘤腺病毒、制备方法及其应用

1.本发明属于肿瘤免疫治疗领域，具体涉及肿瘤靶向性溶瘤腺病毒、共表达外源基因的肿瘤靶向性溶瘤腺病毒、制备方法及其应用。


背景技术：

2.近年来,肿瘤免疫治疗发展迅速，已成为肿瘤临床治疗研究的热点。溶瘤腺病毒是重组的复制型腺病毒，通过插入肿瘤特异性启动子或缺失病毒在正常细胞中增殖所需相关基因，仅在肿瘤细胞中增殖的病毒，能够特异性杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无杀伤活性。溶瘤腺病毒是具备易于生产、高效临床安全等优良特性。近年来,溶瘤腺病毒因其创新性和疗效成为肿瘤治疗领域的热点。但溶瘤腺病毒在大部分临床实验中未能展现完全的抗肿瘤作用，其主要面临几个方面的挑战，包括溶瘤腺病毒肿瘤特异性增殖能力有限，在瘤内感染传播受限，单一治疗无法应对肿瘤复杂性，肿瘤抑制微环境抑制溶瘤腺病毒作用等。针对溶瘤腺病毒应用的挑战，主要解决措施有优化肿瘤特异性启动子增强瘤内增殖能力、表达促凋亡蛋白使肿瘤细胞敏感化、优化运输方式及介导免疫调节等。
3.肿瘤特异性高效增殖能力是溶瘤腺病毒的临床应用主要挑战之一，但为保证溶瘤腺病毒在正常细胞中的安全性，需要确保其仅在肿瘤细胞中增殖。人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,htert)被证实与正常组织相比，在多种恶性肿瘤组织中高表达，如肺癌、食管癌、乳腺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、宫颈癌、直肠癌、肾癌及白血病细胞等多种恶性肿瘤。因而端粒酶的启动子可被作为肿瘤特异性启动子用于溶瘤腺病毒的构建，但现有研究表明htert启动子作为肿瘤特异性启动子活性相当有限，实际应用中难以取得好的效果。
4.溶瘤病毒可作为外源基因的运载体，将具有治疗作用的外源基因导入肿瘤微环境，增加溶瘤病毒的治疗方式。如fda批准的溶瘤病毒t-vec，能够表达细胞因子gm-csf，通过gm-csf进一步调节肿瘤微环境，杀伤肿瘤细胞。因而利用基因工程方法武装溶瘤病毒，携带表达外源基因是目前解决溶瘤病毒单一治疗效果有限的缺陷的一种可能方法。
5.rgd序列(arg-gly-asp)是由精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸组成的短肽序列，含有rgd序列的rgd肽及其衍生物，能够特异性识别细胞表面的整合素受体蛋白(如αvβ3、α5β1等)，并与之结合。在腺病毒的纤突蛋白knob区的hi环中插入具有整合素特异性的rgd肽，可提高腺病毒感染肿瘤细胞的效率，尤其是缺乏柯萨奇病毒-腺病毒受体的肿瘤细胞。
6.目前本领域对于溶瘤腺病毒的开发改进所关注的点都较为单一，鲜有具有多重综合性特点的腺病毒报道。


技术实现要素：

7.本发明所要解决的技术问题是溶瘤腺病毒肿瘤特异性治疗效果有限。
8.本发明解决上述技术问题的技术方案是提供了一种重组溶瘤腺病毒。
9.该重组腺病毒：a)、可操作地插入外源基因至溶瘤腺病毒基因组；
10.b)、其基因组中由外源的核心启动元件或外源启动子替换了溶瘤腺病毒自身e1启动子以驱动e1a和/或e1b-19k基因表达。
11.其中，上述的重组溶瘤腺病毒中所述的外源的核心启动元件为：
12.1)、核苷酸序列如seq id no.1所示；
13.或者：
14.2)、在序列seq id no.1所示的核苷酸序列中有1个或几个碱基插入、缺失和/或替换突变，且仍然具有启动子功能的核酸分子。
15.其中，上述的核心启动元件的核苷酸序列如seq id no.3、seq id no.4或seq id no.5中的任一项所示。
16.其中，上述的重组溶瘤腺病毒中所述的启动子为含有上述的核心启动元件的启动子。
17.其中，上述启动子的核苷酸序列如seq id no.6、seq id no.7或seq id no.8所示。
18.进一步的，上述重组溶瘤腺病毒中所述的启动子中还插入了至少一个e2f结合位点。
19.其中，上述重组溶瘤腺病毒中所述的e2f结合位点的核苷酸序列如seq id no.15所示；
20.其中，上述重组溶瘤腺病毒中所述的e2f结合位点为在序列seq id no.15所示的核苷酸序列中有1个或几个碱基插入、缺失和/或替换突变，且仍然具有e2f结合位点功能的核酸分子。
21.其中，上述重组溶瘤腺病毒中所述的e2f结合位点插入在所述的核心启动元件的5’端和/或3’端。
22.其中，上述重组溶瘤腺病毒中所述的启动子的核苷酸序列如seq id no.9、seq id no.10、seq id no.11、seq id no.12、seq id no.13或seq id no.14所示。
23.其中，上述重组溶瘤腺病毒中所述的腺病毒是血清型属于a亚属、b亚属、c亚属、d亚属、e亚属、f亚属或g亚属的腺病毒。
24.其中，上述重组溶瘤腺病毒中所述的腺病毒为：
25.选自a亚属的12、18、31或61型中的至少一种；
26.或者，选自b亚属的3、7、11、14、16、21、34、35、55、66、68、76、77、78或79型中的至少一种，
27.或者，选自c亚属的1、2、5、6、57或89型中的至少一种；
28.或者，选自d亚属的8、9、13、15、17、19、20、22～30、32、33、36～39、46、48、49、53、54、56、58～60、62～65、67、69～75、80～88或90～103型中的至少一种；
29.或者，选自e亚属的4型；
30.或者，选自f亚属的40或41型；
31.或者，选自g亚属的52型腺病毒。
32.其中，上述重组溶瘤腺病毒中所述的e1a为缺失了中间的24bp的e1a(delta24)，核苷酸序列为seq id no.16所示。或者，所述的e1b 19k的核苷酸序列为seq id no.17所示。
或者，所述的含有e1a和e1b-19k基因的片段为e1a/e1b-19k，核苷酸序列为seq id no.18所示。
33.其中，上述重组溶瘤腺病毒中所述的外源基因插入在重组溶瘤腺病毒的δe3区。
34.其中，上述重组溶瘤腺病毒中所述的外源基因为抗肿瘤药物相关基因。
35.其中，上述重组溶瘤腺病毒中所述的抗肿瘤药物相关基因为编码细胞因子、免疫检查点分子、免疫检查点分子抑制剂、免疫调节分子、抗原分子、酶类分子或sirna分子的基因中的至少一种。
36.其中，上述重组溶瘤腺病毒中所述的细胞因子为白介素、干扰素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子或趋化因子中的至少一种。
37.其中，上述重组溶瘤腺病毒中所述的白介素为il-1家族白介素、il-2家族白介素、il-6家族白介素、il-12家族白介素或il-10家族白介素中的至少一种。
38.其中，上述重组溶瘤腺病毒中所述的il-1家族白介素为il-1、il-18、il-33、il-36、il-37或il-38中的至少一种。
39.其中，上述重组溶瘤腺病毒中所述的il-2家族白介素为il-2、il-4、il-13、il-15或il-21中的至少一种。
40.其中，上述重组溶瘤腺病毒中所述的il-6家族白介素为il-6、il-11、il-27、il-31、抑瘤素m(osm)、白血病抑制因子(lif)、睫状神经营养因子(cntf)、心肌营养素1(ct-1)和心肌营养素样细胞因子1(clcf1)中的至少一种。
41.其中，上述重组溶瘤腺病毒中所述的il-12家族白介素为il-12、il-23、il-27或il-35中的至少一种。
42.其中，上述重组溶瘤腺病毒中所述的il-10家族白介素为il-10、il-19、il-20、il-22、il-24、il-26、il-28或il-29中的至少一种。
43.其中，上述重组溶瘤腺病毒中所述的il-17家族白介素为il-17或il-25中的至少一种。
44.其中，上述重组溶瘤腺病毒中所述的白介素为il-5、il-7、il-9、il-14、il-16和il-32中的至少一种。
45.其中，上述重组溶瘤腺病毒中所述的干扰素为i型干扰素或ii型干扰素中至少一种。
46.其中，上述重组溶瘤腺病毒中所述的i型干扰素为ifn-α或ifn-β中的至少一种。
47.其中，上述重组溶瘤腺病毒中所述的ii型干扰素为ifn-γ。
48.其中，上述重组溶瘤腺病毒中所述的肿瘤坏死因子为tnf-α或tnf-β。
49.其中，上述重组溶瘤腺病毒中所述的集落刺激因子为g-csf、m-csf、gm-csf、multi-csf(il-3)、scf或epo中的至少一种。
50.其中，上述重组溶瘤腺病毒中所述的趋化因子为cc趋化因子亚族、cxc趋化因子亚族、xc趋化因子亚族或cx3c趋化因子亚族中的至少一种。
51.其中，上述重组溶瘤腺病毒中所述的cc趋化因子亚族为ccl1、ccl2、ccl3、ccl4、ccl5、ccl6、ccl7、ccl8、ccl9、ccl10、ccl11、ccl12、ccl13、ccl14、ccl15、ccl16、ccl17、ccl18、ccl19、ccl20、ccl21、ccl22、ccl23、ccl24、ccl25、ccl26、ccl27或ccl28中的至少一种。
52.其中，上述重组溶瘤腺病毒中所述的cxc趋化因子亚族为cxcl1、cxcl2、cxcl3、cxcl4、cxcl5、cxcl6、cxcl7、cxcl8(il-8)、cxcl9、cxcl10、cxcl11、cxcl12、cxcl13、cxcl14、cxcl15、cxcl16或cxcl17中的至少一种。
53.其中，上述重组溶瘤腺病毒中所述的xc趋化因子亚族为xcl1或xcl2中的至少一种。
54.其中，上述重组溶瘤腺病毒中所述的cx3c趋化因子亚族为cx3cl1。
55.其中，上述重组溶瘤腺病毒中所述的免疫检查点分子为ctla-4、pd-1、pd-l1、lag3、tigit、tim3、b7h3、cd39、cd73、腺苷a2a受体、siglec-10、sirpα、cd24、cd155或cd47中的至少一种。
56.其中，上述重组溶瘤腺病毒中所述的免疫检查点分子为免疫检查点分子自身/和或与fc片段组成的融合蛋白。
57.其中，上述重组溶瘤腺病毒中所述的免疫检查点分子抑制剂为抗所述免疫检查点分子的多克隆抗体、单克隆抗体、scfv抗体或/和双特异性抗体分子。
58.其中，上述重组溶瘤腺病毒中所述的免疫调节分子为4-1bb(cd137)、ox40、gitr、cd40、b7-1、b7-2、mhci或mhcii分子中的至少一种。
59.其中，上述重组溶瘤腺病毒中所述的抗原分子为肿瘤抗原分子。进一步的，所述的抗原分子为能够成为car t细胞靶点的抗原分子。
60.更进一步的，上述重组溶瘤腺病毒中所述的抗原分子为muc1、wt1、e7、mage-a1、mage-a3、claudin6、hpv e6、hpv e7、ny-eso-1、epcam、ror1、her2、cd19、cd20、cd33、cd123、psma、mesothelin、fbp、egfrviii、gd2和survivin中的至少一种。
61.其中，上述重组溶瘤腺病毒中所述的酶类分子为胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶或透明质酸酶中的至少一种。
62.其中，上述重组溶瘤腺病毒中所述的sirna分子为致病基因或者免疫抑制基因的sirna分子。
63.其中，上述重组溶瘤腺病毒中所述的外源基因插入在重组溶瘤腺病毒的δe3区。
64.其中，上述重组溶瘤腺病毒中所述的外源基因由启动子启动表达。
65.其中，上述重组溶瘤腺病毒中所述的启动子为cmv、mcmv、ef1α、sv40、pgk1、cag、ubc、u6、h1启动子中的至少一种。
66.其中，上述重组溶瘤腺病毒中所述的外源基因的末尾还连接有polya信号序列。
67.其中，上述重组溶瘤腺病毒中所述的polya信号序列为sv40 polya。
68.进一步的，上述重组溶瘤腺病毒中的外源基因为1、2或多个。
69.进一步的，所述的多个为3、4、5个。
70.当外源基因为一个时，外源基因的表达框架的结构为启动子-外源基因-ploya尾巴；
71.当外源基因为2个时，可各自构建一个启动子-外源基因-ploya尾巴的表达框架内；也可由一个启动子启动，外源基因之间由连接分子间隔，ploya尾巴收尾。
72.进一步的，当外源基因为2个以上时，多个外源基因的表达方式可为应用多个独立启动子；或应用一个启动子，多个基因之间加入连接分子，ploya尾巴收尾的方式；或者前述两种方式的组合。
73.其中，上述连接分子指的是自剪切多肽p2a或内部核糖体进入位点(ires)序列。
74.其中，上述重组溶瘤腺病毒中还可操作地插入rgd肽的编码基因。
75.其中，上述重组溶瘤腺病毒中所述的rgd肽的编码基因插入在腺病毒纤突蛋白knob区的hi环中。
76.其中，上述重组溶瘤腺病毒中所述的rgd肽的编码基因插入腺病毒纤突蛋白knob区的hi环中的546t密码子与547p密码子之间和/或纤突蛋白knob区的hi环基因的581e密码子和582终止密码子之间。
77.其中，上述重组溶瘤腺病毒中所述的rgd肽的氨基酸序列为cdcrgdcfc(seq idno.19)。
78.本发明还提供了含有上述的重组溶瘤腺病毒的宿主细胞。
79.其中，上述的宿主细胞是真核细胞。
80.本发明同时还提供了上述的重组溶瘤腺病毒或上述的宿主细胞在制备抗肿瘤药物中的用途。
81.在此基础上，本发明还提供了一种抗肿瘤药物。该抗肿瘤药物是由上述的重组溶瘤腺病毒或上述的宿主细胞添加药学上可接受的辅助性成分制备而成。
82.其中，上述抗肿瘤药物中所述的肿瘤为上皮组织肿瘤、间叶组织肿瘤、神经组织肿瘤、淋巴及造血组织肿瘤中的至少一种。
83.进一步的，上述抗肿瘤药物满足以下的任意一项：
84.所述的上皮组织肿瘤包括乳头状瘤、腺癌、囊腺癌、混合癌、移行上皮癌、基底细胞癌；
85.所述的间叶组织肿瘤包括脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、血管肉瘤、淋巴管肉瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、滑膜肉瘤；
86.所述的神经组织肿瘤包括多行胶质母细胞瘤、成髓细胞瘤、恶性神经鞘瘤、成神经节细胞瘤、脑膜肉瘤；
87.所述的淋巴及造血组织肿瘤包括淋巴瘤、白血病、多发骨髓瘤；
88.所述的其他肿瘤包括睾丸癌、恶性畸胎瘤、恶性黑色素瘤。
89.本发明还提供了制备上述的重组溶瘤腺病毒的方法：
90.a)、将外源核心启动元件或者启动子可操作地连接腺病毒增殖所必需的基因，构建入穿梭质粒；
91.b)、将1个、2个或多个外源基因可操作地连接入骨架质粒的δe3区；
92.c)、将步骤a)得到的穿梭质粒和步骤b)得到的腺病毒骨架质粒转入包装细胞，包装得到溶瘤腺病毒。
93.其中，所述多个为3、4或5个。
94.上述方法中，当外源基因为一个时，外源基因的表达框架的结构为启动子-外源基因-ploya尾巴。
95.当外源基因为2个时，可各自构建一个启动子-外源基因-ploya尾巴的表达框架内；也可由一个启动子启动，外源基因之间由连接分子间隔，ploya尾巴收尾。
96.进一步的，当外源基因为2个以上时，多个外源基因的表达方式可为应用多个独立启动子；或应用一个启动子，多个基因之间加入连接分子，ploya尾巴收尾的方式；或者前述
两种方式的组合。
97.其中，上述连接分子指的是自剪切多肽p2a或内部核糖体进入位点(ires)序列。
98.其中，上述方法中还包括有将rgd序列编码基因可操作地连接入腺病毒骨架质粒编码腺病毒纤突蛋白knob区的hi环编码区中，对骨架质粒进行rgd修饰的步骤。
99.其中，上述方法中所述的对骨架质粒进行rgd修饰的步骤可以在将外源基因可操作地连接入的骨架质粒的δe3区的操作之前或者之后。
100.进一步的，上述方法满足以下至少一项：
101.所述的腺病毒增殖所必需的基因为e1a和/或e1b-19k；
102.或者，所述的穿梭质粒为pdc316、pdc311、pdc312、pdc315、pdc511、pdc512、pdc515、pdc516、pshuttle、pshuttle-cmv、pctap-shuttle系列质粒、pntap-shuttle系列质粒、padtrack、padtrack-cmv、pacad5系列质粒、phbad系列质粒或者pxc1质粒的至少一种；
103.或者，所述的腺病毒骨架质粒为pbhgloxdele13cre、pbhgfrtdele13flp(pbhgff)、padeasy-1、padeasy-2、pbhge3i或pbhge10i种的至少一种；
104.或者，所述的包装细胞为hek293、hek293a细胞。
105.其中，上述方法中所述编码rgd多肽的基因通过同源重组方法插入腺病毒骨架质粒的纤突蛋白knob区的hi环编码基因的546t密码子与547p密码子之间和/或581e密码子和582终止密码子之间。
106.其中，上述方法中所述外源基因插入腺病毒骨架质粒的δe3区。进一步的，所述外源基因可通过同源重组方法插入腺病毒骨架质粒的δe3区。
107.其中，上述方法中步骤c)所述的骨架质粒按以下方法制备：
108.1)pbhgff-rgd质粒先进行paci限制性内切酶酶切，回收获得线性质粒片段；
109.2)线性化pbhgff-rgd与外源基因核酸片段在体外经gibson组装重组后转入dh10b感受态细胞中,获得pbhgff-rgd-外源基因质粒。
110.本发明的有益效果为：本领域目前急需解决溶瘤腺病毒的特异性增殖、感染肿瘤细胞效率和单一治疗效果有限的问题，在对htert肿瘤特异性启动子进行基因修饰和优化改构，得到具高活性的肿瘤特异性启动子mhtert，显著提高了溶瘤腺病毒的肿瘤特异性高效增殖能力，实现了溶瘤腺病毒的高效特异性杀伤能力。进一步对溶瘤腺病毒进行基因修饰表达外源基因，以调节肿瘤微环境等方式进一步增强抗肿瘤效果。此外还对溶瘤腺病毒骨架质粒进行rgd修饰，进而实现高效感染肿瘤细胞尤其柯萨奇病毒-腺病毒受体低表达的肿瘤细胞，以此提高溶瘤腺病毒的感染效率和靶向性。本发明将高活性的肿瘤特异性启动子mhtert、外源基因巧妙结合，以及进一步和rgd巧妙结合起来，得到具有多重优点的腺病毒，能产生一定的协同作用，为本领域肿瘤免疫治疗的研发提供新的有效选择。
附图说明
111.图1 rt-pcr检测不同人源细胞中人端粒酶逆转录酶的mrna表达。
112.图2不同人源肿瘤细胞htert启动子突变检测。
113.图3 htertwt启动子示意图。
114.图4双荧光素法检测htert点突变启动子活性。*为p《0.05；**为p《0.01。
115.图5双荧光素法检测htert点突变核心启动元件活性。*为p《0.05；**为p《0.01；***
为p《0.001。
116.图6双荧光素法检测e2f结合位点修饰后的htert点突变启动子活性。*为p《0.05；**为p《0.01；***为p《0.001。
117.图7 rt-pcr检测溶瘤腺病毒oad-null感染细胞后的e1a mrna表达。
118.图8 western blot检测溶瘤腺病毒oad-null感染细胞后的e1a蛋白表达。
119.图9 cck8法检测溶瘤腺病毒oad-null的体外杀伤肿瘤细胞活性。*为p《0.05；**为p《0.01；***为p《0.001。
120.图10不同肿瘤模型中oad-null溶瘤腺病毒的肿瘤杀伤活性。a.oad-null溶瘤腺病毒治疗a375肿瘤后的肿瘤体积和肿瘤大小，符号
×
表示肿瘤消退；b.oad-null溶瘤腺病毒治疗u87mg肿瘤后的肿瘤体积和肿瘤大小；c.oad-null溶瘤腺病毒治疗skov3肿瘤后的肿瘤体积和肿瘤大小。*为p《0.05；**为p《0.01。
121.图11利用red/et重组方法构建pbhgff-kana的原理示意图。
122.图12利用gibson组装方法构建pbhgff-rgd的原理示意图。
123.图13构建的pbhgff-rgd经ecorv酶切验证结果。a.pbhgff-rgd经ecorv酶切的理论大小示意图。b.pbhgff-rgd经ecorv酶切的实际电泳图。
124.图14溶瘤腺病毒oad-rgd的制备示意图。
125.图15 cck8法检测溶瘤腺病毒oad-rgd的体外杀伤肿瘤细胞活性。*为p《0.05；**为p《0.01。
126.图16 a375和u87mg肿瘤模型中oad-rgd溶瘤腺病毒的肿瘤杀伤活性。a.oad-rgd溶瘤腺病毒治疗a375肿瘤后的肿瘤体积和肿瘤大小；b.oad-rgd溶瘤腺病毒治疗u87mg肿瘤后的肿瘤体积和肿瘤大小，*为p《0.05；***为p《0.001。
127.图17 oad-rgd-外源基因溶瘤腺病毒制备示意图。
128.图18 cck8法检测溶瘤腺病毒oad-sirpα-fc、oad-siglec-10-fc和oad-tigit-fc的体外杀伤肿瘤细胞活性。
129.图19 western blot法检测溶瘤腺病毒oad-sirpα-fc、oad-siglec-10-fc和oad-tigit-fc体外分泌sirpα-fc、siglec-10和tigit-fc蛋白。
130.图20 mc38肿瘤模型中oad-sirpα-fc溶瘤腺病毒的抗肿瘤活性。a.oad-sirpα-fc溶瘤腺病毒治疗mc38肿瘤后的肿瘤体积和肿瘤大小；b.oad-sirpα-fc溶瘤腺病毒治疗mc38肿瘤后的生存期观察，**为p《0.01；***为p《0.001。
131.图21 4t1肿瘤模型中oad-siglec-10-fc溶瘤腺病毒的抗肿瘤活性。a.oad-siglec-10-fc溶瘤腺病毒治疗4t1肿瘤后的肿瘤体积和肿瘤大小；b.oad-siglec-10-fc溶瘤腺病毒治疗4t1肿瘤后的生存期观察，***为p《0.001。
132.图22 ct26肿瘤模型中oad-tigit-fc溶瘤腺病毒的抗肿瘤活性。a.oad-tigit-fc溶瘤腺病毒治疗ct26肿瘤后的肿瘤体积和肿瘤大小；b.oad-tigit-fc溶瘤腺病毒治疗ct26肿瘤后的生存期观察，*为p《0.05；***为p《0.001。
133.图23溶瘤腺病毒oad-sirpα-fc、oad-siglec-10-fc和oad-tigit-fc诱导全身性免疫反应检测。a.mc38远端治疗模型中，oad-sirpα-fc给药治疗右侧肿瘤，左侧不给药，治疗后两侧肿瘤大小；b.4t1远端治疗模型中，oad-siglec-10-fc给药治疗右侧肿瘤，左侧不给药，治疗后两侧肿瘤大小；c.ct26远端治疗模型中，oad-tigit-fc给药治疗右侧肿瘤，左侧
不给药，治疗后两侧肿瘤大小，*p《0.05；**为p《0.01；***为p《0.001。
134.图24溶瘤腺病毒oad-hepcamt杀伤肿瘤细胞效果检测。a.cck8法检测溶瘤腺病毒oad-hepcamt的体外杀伤a375肿瘤细胞活性；b.流式细胞术检测oad-hepcamt感染a375后细胞膜上表达hepcamt的情况；c.a375肿瘤模型中，oad-hepcamt的抗肿瘤活性检测，图代表肿瘤生长曲线，*p《0.05；**为p《0.01；
135.图25 mc38肿瘤模型中oad-rgd-gm-csf，oad-rgd-ifnα-2b、oad-rgd-il10和oad-rgd-ccl5溶瘤腺病毒的体外和体内抗肿瘤活性检测。a.cck8法检测溶瘤腺病毒oad-rgd-gm-csf，oad-rgd-ifnα-2b、oad-rgd-il10和oad-rgd-ccl5的体外杀伤肿瘤细胞活性；b.mc38肿瘤模型中，四个溶瘤腺病毒抑制肿瘤生长活性检测，*p《0.05。
136.图26 mc38肿瘤模型中oad-rgd-αpd-1和oad-rgd-4-1bb溶瘤腺病毒的抗肿瘤活性检测，*为p《0.05。
137.图27 mc38肿瘤模型中oad-rgd-ph20溶瘤腺病毒的抗肿瘤活性检测，*为p《0.05。
138.图28 mc38肿瘤模型中oad-rgd-sistat3溶瘤腺病毒的抗肿瘤活性检测，*为p《0.05。
具体实施方式
139.溶瘤病毒尤其是溶瘤腺病毒的肿瘤治疗目前还面临一些挑战，其中之一就是溶瘤腺病毒肿瘤特异性增殖能力有限。
140.本发明为增强溶瘤病毒的瘤内增殖能力，特别是肿瘤特异性增殖能力，进行了大量的创造性工作。
141.在前期对启动子的研究中，本发明惊喜的发现，对htert启动子进行特定的改造，可以得到高效率的肿瘤特异性启动子，可用于溶瘤腺病毒的构建。对多种肿瘤细胞的htert启动子区域进行测序的工作发现了启动子两处c突变为t的突变，导致htert基因高表达。
142.发明人预计这两处突变可能会与htert启动子的特异性启动能力强弱有关，有可能可以用于溶瘤腺病毒的启动子上提高其治疗效果。将野生型htert启动子(htertwt，seq id no.2)、c69t突变启动子(seq id no.6)、c47t突变启动子(seq id no.7)和dt双突变启动子(seq id no.8)片段连接于质粒中，转染多种细胞。实验结果表明，在正常细胞中上述启动子控制的报告基因基本不表达，而在多种肿瘤细胞中有强表达，且突变的启动子表达能力强于野生型，dt双突变启动子的肿瘤特异性表达能力最强。
143.进一步的，本发明使用了截短的181bp核心启动子区段(seq id no.1)，对其进行了对应于野生型的c69t突变和/或c47t突变。首先，发现该区段具有启动子功能，能启动荧光素酶在多种肿瘤细胞中表达。而c69t突变(seq id no.3)、c47t突变(seq id no.4)以及dt双突变(seq id no.5)的181bp核心启动子区段，其启动子活性有显著的提高，尤其是dt双突变的181bp核心启动子区段，启动子活性最强。即截短的181bp核心启动子区段为一核心启动元件。该核心启动元件既有独立的启动基因表达的功能，作为启动子使用；也可以作为元件构建其他的启动子。
144.随后，为了更进一步的提高上述的启动子的肿瘤特异性表达能力，发明人使用了在上述的启动子上插入e2f-1启动子上的e2f结合位点的方式进行进一步的改造。结果表明，插入e2f-1启动子上的e2f结合位点能有效增强上述启动子的肿瘤特异性表达能力。本
领域技术人员可以插入一个或者多个(所述多个可以为2、3、4、5、6个或更多)，并且选择合适的插入位点。在本发明的一个实例中，是在启动子的htert 181bp核心片段的上游和/或下游插入e2f结合位点的。构建了在启动子-181bp和-182bp之间插入一个e2f结合位点，在启动子+4bp和+5bp之间插入一个e2f结合位点，以及同时在上述两个位置各插入一个e2f结合位点的改造后的启动子，均能提升其肿瘤特异性表达能力。
145.可见，上述的核心启动元件和启动子特别适用于制备需要在肿瘤细胞中实现特异性表达的重组载体，比如质粒载体或病毒载体。
146.在此基础上，可以将上述的启动子用于构建各种溶瘤病毒，在这些溶瘤病毒中启动主要用于复制或增殖的基因的表达，从而可以制备新的溶瘤病毒。比如溶瘤腺病毒、溶瘤细小病毒、溶瘤疱疹病毒、溶瘤痘病毒、溶瘤水泡性口炎病毒、溶瘤麻疹病毒、溶瘤粘液瘤病毒、溶瘤逆转录病毒、溶瘤呼肠孤病毒、溶瘤痘苗病毒等。
147.当然，本发明提供的启动子适合参与新的溶瘤腺病毒的构建。如不同血清型的腺病毒中，替换原有的内源性启动子，启动e1等增殖必需基因的表达，进而控制腺病毒在肿瘤细胞中的复制增殖，得到肿瘤特异性增殖能力提高的溶瘤型腺病毒。可以用于各种血清型的溶瘤腺病毒的制备，如血清型中分属a亚属的12、18、31和61型，分属b亚属的3、7、11、14、16、21、34、35、55、66、68、76～79型，分属c亚属的1、2、5、6、57和89型；分属d亚属的8、9、13、15、17、19、20、22～30、32、33、36～39、46、48、49、53、54、56、58～60、62～65、67、69～75、80～88、90～103型；分属e亚属的4型，分属f亚属的40和41型；分属g亚属52型。
148.本领域技术人员知晓，溶瘤病毒尤其是溶瘤腺病毒的制备需要用到一些常用的载体。一般是使用穿梭载体和骨架载体。穿梭载体可选自pdc316、pdc311，pdc312，pdc315，pdc511，pdc512，pdc515，pdc516，pshuttle，pshuttle-cmv，pctap-shuttle系列载体，pntap-shuttle系列载体，padtrack，padtrack-cmv，pacad5系列载体，phbad系列载体，pxc1等。骨架载体可选自pbhgloxdele13cre，pbhgfrtdele13flp，padeasy-1，padeasy-2，pbhge3i，pbhge10i等。将构建好的穿梭载体和骨架载体共同转染入细胞中，即可实现病毒的包装和进一步的增殖。
149.在本发明的一个实例中，使用了质粒pdc316作为穿梭质粒，将改造后的mhtert启动子与腺病毒增殖所必需的e1a/e1b-19k片段连入该质粒。还使用了pbhglox(delta)e1,3cre作为骨架质粒。将构建好的穿梭载体和骨架载体共同转染入hek293细胞中，包装得到溶瘤腺病毒。得到的溶瘤腺病毒的特异性地高效表达e1a基因，同时在体外、体内的抗肿瘤试验中表现出更好的抗肿瘤效果。
150.另一方面，对溶瘤腺病毒进行基因修饰以使其表达外源基因，以增加t细胞浸润、重新激活耗竭t细胞、增强巨噬细胞对肿瘤细胞的杀伤、增强nk细胞功能等方式调节肿瘤微环境，还可以抑制肿瘤细胞生长、直接杀伤肿瘤细胞、降解细胞外基质等方式增强抗肿瘤效果。外源基因一般是插入在重组溶瘤腺病毒的δe3区。所述外源基因一般为肿瘤治疗药物相关基因。
151.上述的肿瘤治疗药物相关基因为可选自包括编码细胞因子、免疫检查点分子、免疫检查点分子抑制剂、免疫调节分子、抗原分子、酶类分子或sirna分子。所述的细胞因子可为白介素、干扰素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子或趋化因子中的至少一种。
152.比如，所示的白介素可选自il-1家族白介素、il-2家族白介素、il-6家族白介素、
il-12家族白介素或il-10家族白介素。所述的干扰素选自i型干扰素或ii型干扰素中至少一种。所述的肿瘤坏死因子为tnf-α或tnf-β。所述的集落刺激因子可选自g-csf、m-csf、gm-csf、multi-csf(il-3)、scf或epo。所述的趋化因子可选自cc趋化因子亚族、cxc趋化因子亚族、xc趋化因子亚族或cx3c趋化因子亚族。所述的免疫检查点分子选自ctla-4、pd-1、pd-l1、lag3、tigit、tim3、b7h3、cd39、cd73、腺苷a2a受体、siglec-10、sirpα、cd24、cd155或cd47。所述的免疫检查点分子为免疫检查点分子自身和/或与fc片段组成的融合蛋白。所述的免疫检查点分子抑制剂为所述免疫检查点分子的多克隆抗体、单克隆抗体、scfv抗体或/和双特异性抗体分子。所述的免疫调节分子可选自4-1bb(cd137)、ox40、gitr、cd40、b7-1、b7-2、mhci或mhcii分子。所述的抗原分子可选自muc1、wt1、e7、mage-a1、mage-a3、claudin6、hpv e6、hpv e7、ny-eso-1、epcam、ror1、her2、cd19、cd20、cd33、cd123、psma、mesothelin、fbp、egfrviii、gd2和survivin。所述酶类分子为胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶或透明质酸酶中的至少一种。所述的sirna分子为致病基因或者免疫抑制基因的sirna分子。
153.上述的外源基因一般是插入在重组溶瘤腺病毒的δe3区，由启动子启动表达。进一步的所述外源基因的末尾还连接有polya序列。所述的polya序列可使用为sv40 polya。启动外源基因可用本领域常用的启动子。比如，所述的启动子可为cmv、mcmv、ef1α、sv40、pgk1、cag、ubc、u6、h1启动子中的至少一种。
154.本发明的再一方面是在溶瘤腺病毒骨架质粒进行rgd修饰，以提高溶瘤腺病毒的感染效率和靶向性。也就是说上述的重组溶瘤腺病毒中还能可操作地插入rgd肽的编码基因。
155.一般来说，上述的rgd肽的编码基因插入在腺病毒纤突蛋白knob区的hi环中。进一步的，上述的rgd肽的编码基因可插入腺病毒纤突蛋白knob区的hi环中的546t密码子与547p密码子之间和/或纤突蛋白knob区的hi环基因的581e密码子和582终止密码子之间。
156.本发明中可以使用的的rgd肽的包括但不限于cdcrgdcfc多肽。
157.本发明将高活性的肿瘤特异性启动子mhtert、外源基因巧妙结合，以及进一步和rgd结合使用，得到具有多重优点的腺病毒，能产生一定的协同作用，提高肿瘤免疫治疗的效果。
158.本发明当然也提供了含有利上述的重组溶瘤腺病毒的宿主细胞。上述的宿主细胞是真核细胞。
159.本发明也提供了使用上述的重组溶瘤腺病毒或述的宿主细胞添加药学上可接受的辅助性成分制备而成的抗肿瘤药物。
160.本发明抗肿瘤药物可用于上皮组织肿瘤、间叶组织肿瘤、神经组织肿瘤、淋巴及造血组织肿瘤等肿瘤类型的治疗中。
161.上述的上皮组织肿瘤包括乳头状瘤、腺癌、囊腺癌、混合癌、移行上皮癌、基底细胞癌；所述的间叶组织肿瘤包括脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、血管肉瘤、淋巴管肉瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、滑膜肉瘤；所述的神经组织肿瘤包括多行胶质母细胞瘤、成髓细胞瘤、恶性神经鞘瘤、成神经节细胞瘤、脑膜肉瘤；所述的淋巴及造血组织肿瘤包括淋巴瘤、白血病、多发骨髓瘤；还可用于治疗包括睾丸癌、恶性畸胎瘤、恶性黑色素瘤等在内的恶性肿瘤。
162.本发明重组溶瘤腺病毒可按以下方法制备的方法：
163.a)、将外源核心启动元件或者启动子可操作地连接腺病毒增殖所必需的基因，构建入穿梭质粒；
164.b)、将外源基因可操作地连接入的骨架质粒的δe3区；
165.c)、将步骤a)得到的穿梭质粒和步骤b)得到的腺病毒骨架质粒转入包装细胞，包装得到溶瘤腺病毒。
166.此外，当需要使用rgd肽时，还包括有将rgd肽编码基因可操作地连接入腺病毒骨架质粒编码腺病毒纤突蛋白knob区的hi环编码区中，对骨架质粒进行rgd修饰的步骤。对骨架质粒进行rgd修饰的步骤可以在将外源基因可操作地连接入的骨架质粒的δe3区的操作之前或者之后。
167.本发明中，所述编码rgd多肽的基因可通过同源重组方法插入腺病毒骨架质粒的纤突蛋白knob区的hi loop编码基因的546t密码子与547p密码子之间和/或581e密码子和582终止密码子之间。所述外源基因可通过同源重组插入腺病毒骨架质粒的δe3区。
168.具体而言，所述的骨架质粒按以下方法制备：
169.1)pbhgff-rgd质粒先进行paci限制性内切酶酶切，回收获得线性质粒片段；
170.2)线性化pbhgff-rgd与外源基因核酸片段在体外经gibson组装重组后转入dh10b感受态细胞中,获得pbhgff-rgd-外源基因质粒。
171.具体而言，本发明重组溶瘤腺病毒可按以下方法制备：
172.1)将mhtert启动子-e1a/e1b 19k序列，通过分子克隆方法连入穿梭质粒，构建为重组穿梭质粒；
173.2)pbhgff-rgd质粒先进行paci限制性内切酶酶切，回收获得线性质粒片段；线性化pbhgff-rgd与外源基因核酸片段在体外经gibson组装重组后转入dh10b感受态细胞中,获得pbhgff-rgd-外源基因质粒。
174.3)利用将转染试剂将重组穿梭质粒和重组骨架质粒共同转入hek293细胞，进行溶瘤腺病毒包装，标记为溶瘤腺病毒oad-rgd-外源基因。
175.上述的oad-rgd-外源基因溶瘤腺病毒的制备和结构可参见图17。
[0176]“基因”或“编码序列”是指“编码”特定蛋白质的dna或rna的核苷酸序列或区域。当置于合适的调控区域如启动子的控制下时，编码序列(dna被转录(rna)并被翻译成多肽。基因也可以包含几个可操作地连接的片段，例如启动子、5
′
前导序列、内含子、编码序列和3
′
非翻译序列，也可包含聚腺苷酸化位点或信号序列。一般来说，可操作地插入表示根据基因序列和载体序列将基因插入载体从而能够进行表达。通常，将基因置于启动子序列和转录终止序列之间并使其能够表达。嵌合或重组基因是通常在自然界中找不到的基因，例如这样的基因，该基因中如启动子在自然界中与所转录的dna区域的部分或全部是不相关的。“基因的表达”是指将基因转录成rna和/或翻译成活性蛋白的过程。
[0177]
特别的，本发明优选的实例中，将优化的肿瘤特异性启动子、外源基因和rgd肽三者进行进一步的连用，以协同增加溶瘤腺病毒的抗肿瘤效果。实验也表明，本发明优化的肿瘤特异性启动子与rgd肽，优化的肿瘤特异性启动子与抗肿瘤相关的外源基因都可以起到一定的的协同作用。三者组合在一起制得的溶瘤腺病毒也可起到进一步的协同作用，一些实例中也证明了取得“1+1+1》3”的效果。本发明优化的肿瘤特异性启动子能促进溶瘤病毒在肿瘤细胞中增殖；外源基因的表达主要能够通过各种途径起到抗肿瘤的作用，特别是有
些外源基因随腺病毒进入体内表达后也能起靶向治疗作用；而rgd能更进一步提高溶瘤腺病毒感染肿瘤细胞的效率。因而在本领域的各项实施例的取得好的效果的情况下，本领域技术人员可以，本发明在腺病毒δe3区插入的具有抗肿瘤作用的外源基因，均可明显协同增加溶瘤腺病毒的抗肿瘤作用。
[0178]
以下结合实施例对本发明方法进行进一步的详细说明。
[0179]
实施例中使用的主要试剂为：
[0180]
anti-e1a抗体购自santa cruz biotechnology公司。
[0181]
balb/cnude，balb/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
[0182]
rt-pcr所用逆转录试剂盒和sybr染料检测试剂盒购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司。
[0183]
cck8检测试剂购自mce公司。
[0184]
双荧光素酶检测试剂盒购自promega corporation公司。
[0185]
其他试剂均为进口或国产分析纯产品。
[0186]
实施例一不同人源细胞中人端粒酶逆转录酶的mrna表达检测
[0187]
本实施例所用细胞为人源正常细胞人胚肺成纤维细胞mrc-5(atcc：ccl-171)和人源代真皮成纤维细胞pcs-201-010(atcc：pcs-201-010
tm
)，人源肿瘤细胞：恶性胶质母细胞瘤细胞u87mg(atcc：htb-14)、恶性黑色素瘤a375(atcc：crl-1619)、肺癌细胞a549(atcc：crm-ccl-185)、乳腺癌细胞mcf-7(atcc：htb-22)、宫颈癌细胞hela(atcc：crm-ccl-2)和卵巢癌细胞skov3(atcc：htb-77)。收取细胞，提取细胞总rna并逆转录为cdna，通过rt-pcr检测人端粒酶逆转录酶的表达，gapdh作为内参。
[0188]
结果所示(图1)，在正常细胞mrc-5和pcs-201-010中，人端粒酶逆转录酶几乎不表达，而在6种不同来源的肿瘤细胞中，人端粒酶逆转录酶都高表达。
[0189]
实施例二不同人源肿瘤细胞htert启动子突变检测
[0190]
收集肿瘤细胞u87mg、a375、a549、mcf-7、hela和skov3，提取细胞基因组，对htert启动子核酸序列进行测序。
[0191]
实验结果显示(图2)：在u87mg细胞中，htert启动子存在部分c69t和c47t双突变；在a375细胞中，存在c69t突变；而其他细胞中，htert启动子无突变。因而考虑是否可将这些突变应用到溶瘤腺病毒的启动子优化和溶瘤效果的改进上。
[0192]
实施例三htert启动子初步优化
[0193]
一、htert启动子点突变构建
[0194]
本实施例采用htert启动子的-378～+77区域序列(来自人5号染色体tert 5'调节区域，序列id:ng_055467.1)，共455bp，标记为htert wt(图3中标记为l-wt)序列(seq id no.2)(参见图3)。通过研究其序列，选取了其中的-181～+77的含181bp区段为其有强启动子活性的核心区域，标记为181-wt序列(seq id no.1)(见图3)。图3中+1表示mrna序列第1个核苷酸，-1第1个到转录起始位点的5’核苷酸。c69t(-69位核苷酸c)和c47t(-47位核苷酸c)均表示htert启动子序列具有单一胞嘧啶c突变为胸腺嘧啶t。dt表明序列具有上述-47和-69位c
→
t的双突变。各相关核酸序列见表1：
[0195]
表1.各种htert启动子核酸序列
[0196]
[0197]
[0198][0199]
pgl3-basic质粒(此质粒购自microbixbiosystems inc)可用于启动子活性检测，即多克隆位点区位于萤火虫荧光素酶基因上游。将pgl3-basic质粒用限制性内切酶xhoi和hindiii酶切多克隆位点后，再将上述htertwt、181-wt、181-c69t、181-c47t、181-dt、l-c69t、l-c47t和l-dt片段分别与酶切后的pgl3-basic连接，构建为pgl3-l-wt、pgl3-181-wt、pgl3-181-c69t、pgl3-181-c47t、pgl3-181-dt、pgl3-l-c69t、pgl3-l-c47t和pgl3-l-dt测序正确。
[0200]
二、htert点突变启动子活性检测
[0201]
pgl3-basic质粒携带萤火虫荧光素酶基因，可用于检测启动子活性强弱。96孔板分别铺入u87mg每孔1.5
×
104个细胞，a375每孔1.5
×
104个细胞，mrc-5、pcs-201-010、a549、mcf-7、hela和skov3每孔各1
×
104个细胞，37℃过夜培养。
[0202]
分组(1)control
[0203]
(2)pgl3-basic(100ng)+prl-tk(内参质粒10ng)
[0204]
(3)pgl3-l-wt(100ng)+prl-tk(内参质粒10ng)
[0205]
(4)pgl3-l-c69t(100ng)+prl-tk(内参质粒10ng)
[0206]
(5)pgl3-l-c47t(100ng)+prl-tk(内参质粒10ng)
[0207]
(6)pgl3-l-dt(100ng)+prl-tk(内参质粒10ng)
[0208]
将上述分组中质粒利用lipofectamine 3000转染各细胞24h后检测双荧光。注：prl-tk为hsv tk启动子启动海肾萤光素酶的表达，pcmv-tk为cmv启动子启动海肾萤光素酶的表达。mrc-5和pcs-201-010所用内参质粒为pcmv-tk。
[0209]
结果显示(如图4)，在正常细胞mrc-5和pcs-201-010细胞中，几乎未检测到萤火虫
荧光素酶。而在肿瘤细胞中，与l-wt序列相比，l-dt双突变的启动子活性显著增高，表明htert wt启动子(-378～+77)双突变后活性明显增强。
[0210]
三、htert点突变核心启动元件启动子活性检测
[0211]
进一步的检测截断的181bp核心启动元件核心区域的启动子活性，96孔板分别铺入u87mg每孔1.5
×
104个细胞，a375每孔1.5
×
104个细胞，mrc-5、pcs-201-010、a549、mcf-7、hela和skov3每孔各1
×
104个细胞，37℃过夜培养。
[0212]
分组(1)control
[0213]
(2)pgl3-basic(100ng)+prl-cmv(内参质粒5ng)
[0214]
(3)pgl3-l-wt(100ng)+prl-cmv(内参质粒5ng)
[0215]
(4)pgl3-181-wt(100ng)+prl-cmv(内参质粒5ng)
[0216]
(5)pgl3-181-c69t(100ng)+prl-cmv(内参质粒5ng)
[0217]
(6)pgl3-181-c47t(100ng)+prl-cmv(内参质粒5ng)
[0218]
(7)pgl3-181-dt(100ng)+prl-cmv(内参质粒5ng)
[0219]
将上述分组中质粒利用lipofectamine 3000转染各细胞24h后检测双荧光。注：pcmv-tk为cmv启动子启动海肾萤光素酶的表达。
[0220]
结果显示(如图5)，在正常细胞mrc-5和pcs-201-010细胞中，几乎未检测到萤火虫荧光素酶。而在肿瘤细胞中，与181-wt序列相比，181-dt双突变的启动子活性显著增高，表明181bp核心启动元件双突变后启动子活性明显增强。
[0221]
四、htert双突变启动子进一步优化
[0222]
e2f-1启动子在本领域也被报道过用于溶瘤腺病毒治疗，在rb缺陷细胞中能够选择性增殖。e2f-1启动子上的e2f结合位点是参与e2f-rb复合物结合的关键位点，e2f结合位点的核酸序列为tcggcggctcgtggctctttcgcggcaaaaaggatttggcgcgtaaaagtgg(seq id no.15)。本发明考虑将其与htert启动子配合可能进一步增强其活性，本发明在l-wt和l-dt基础上将e2f结合位点插入-181bp至-182bp之间形成e2f up，插入+4bp至+5bp之间形成e2f down，两个位点间均插入形成e2f up+down(参见表1和图3)。将pgl3-basic质粒用限制性内切酶xhoi和hindiii酶切后，再将图3所示l-wt-e2f up、l-wt-e2f down、l-wt-e2f up+down、l-dt-e2f up、l-dt-e2f down和l-dt-e2f up+down片段与酶切后的pgl3-basic连接，构建为pgl3-l-wt-e2f up、pgl3-l-wt-e2f down、pgl3-l-wt-e2f up+down、pgl3-l-dt-e2f up、pgl3-l-dt-e2f down和pgl3-l-dt-e2f up+down，测序正确。
[0223]
96孔板分别铺入u87mg每孔1.5
×
104个细胞，a375每孔1.5
×
104个细胞，mrc-5、pcs-201-010、a549、mcf-7、hela和skov3每孔各1
×
104个细胞，37℃过夜培养。
[0224]
分组:
[0225]
(1)control
[0226]
(2)pgl3-basic(100ng)+prl-tk(内参质粒10ng)
[0227]
(3)pgl3-l-wt(100ng)+prl-tk(内参质粒10ng)
[0228]
(4)pgl3-l-wt-e2f down(100ng)+prl-tk(内参质粒10ng)
[0229]
(5)pgl3-l-wt-e2fup(100ng)+prl-tk(内参质粒10ng)
[0230]
(6)pgl3-l-wt-e2fup+down(100ng)+prl-tk(内参质粒10ng)
[0231]
(7)pgl3-l-dt(100ng)+prl-tk(内参质粒10ng)
[0232]
(8)pgl3-l-dt-e2f down(100ng)+prl-tk(内参质粒10ng)
[0233]
(9)pgl3-l-dt-e2fup(100ng)+prl-tk(内参质粒10ng)
[0234]
(10)pgl3-l-dt-e2fup+down(100ng)+prl-tk(内参质粒10ng)
[0235]
将上述分组中质粒利用lipofectamine 3000转染各细胞24h后检测双荧光。mrc-5和pcs-201-010所用内参质粒为pcmv-tk 50ng，其余肿瘤细胞所用内参质粒为prl-tk 10ng。
[0236]
结果显示(如图6)，在正常细胞mrc-5和pcs-201-010细胞中，几乎未检测到萤火虫荧光素酶，但能够检测到海肾萤光素酶。而在肿瘤细胞中，与pgl3-l-dt序列相比，pgl3-l-dt e2f down的启动子活性显著增高，pgl3-l-dt-e2f down和pgl3-l-dt-e2f up+down无显著性差别，因而后续实验中选用l-dt-e2f down序列作为最优启动子序列，标记为mhtret，共504bp(seq id no.12)。
[0237]
实施例四溶瘤腺病毒oad-htert(htert做启动子)和oad-null(mhtert做启动子)的包装和功能验证
[0238]
将pdc316质粒用限制性内切酶xbai和hindiii酶切后，再将htert wt和mhtert(实施例三中最优启动子l-dt-e2f down(seq id no.12)，分别与腺病毒增殖所必需的e1a/e1b-19k(核苷酸序列为seq id no.18所示)连入酶切后的pdc316质粒，构建为pdc316-htert和pdc316-mhtert，htert与e1a之间加入一个ecori酶切位点以方便验证。
[0239]
利用将lipofectamine 3000将pdc316-htert与腺病毒骨架质粒pbhglox(delta)e1,3cre转入hek293细胞，进行溶瘤腺病毒包装，标记为溶瘤腺病毒oad-htert；同样利用将lipofectamine 3000将pdc316-mhtert与腺病毒骨架质粒pbhglox(delta)e1,3cre转入hek293细胞，进行溶瘤腺病毒包装，标记为溶瘤腺病毒oad-null。
[0240]
将6孔板分别铺入mrc-5、pcs-201-010、u87mg、a375、a549和skov3每孔各3
×
105个细胞，37℃过夜培养。次日，a549细胞按照moi(pfu)＝64，其余细胞按照moi(pfu)＝32，分别感染ad-gfp(表达gfp蛋白的腺病毒)、h101、oad-htert和oad-null。感染24h后，收集细胞沉淀，分别用rt-pcr和western blot方法检测e1a的mrna表达水平和蛋白表达水平。h101为阳性对照溶瘤腺病毒(购自上海三维生物技术有限公司)。
[0241]
结果所示(图7rt-pcr检测和图8western blot检测)，在正常细胞mrc-5和pcs-201-010细胞中，几乎检测不到e1a的mrna和蛋白表达。而在肿瘤细胞中，能够检测到e1a的mrna和蛋白表达，并且与h101和oad-htert相比，oad-null感染后e1a显著上调，表明oad-null在肿瘤细胞中高效增殖，且并不影响正常细胞。
[0242]
实施例五溶瘤腺病毒oad-htert和oad-null的肿瘤体外杀伤活性检测
[0243]
将96孔板分别铺入mrc-5、pcs-201-010、u87mg、a375、a549和skov3每孔各3
×
103个细胞，37℃过夜培养。次日，mrc-5、pcs-201-010、u87mg、a375和a549按照moi(pfu)＝128、256、512、1024，skov3细胞按照moi(pfu)＝31.25、62.5、250、1000，分别感染oad-gfp(htert wt启动子后为gfp蛋白)、h101、实施例四制备的oad-htert和oad-null。感染3-6天后，cck8法检测细胞的存活情况。
[0244]
结果显示(图9)，在正常细胞mrc-5和pcs-201-010细胞中，细胞存活较好，并且各组之间生存率无统计学差异。而在肿瘤细胞中，与oad-gfp相比，h101和oad-htert能够有效杀伤肿瘤细胞，而oad-null杀伤肿瘤细胞活性最强，具有统计学差异。
4c插入的无痕改造，获得pbhgff-rgd载体(此步骤重组示意图见图12)。
[0267]
(4)pbhgff-rgd经ecorv酶切验证，结果显示酶切结果正确(图13)
[0268]
3、利用将lipofectamine 3000将pdc516-mhtert和pbhgff-rgd转入hek293细胞，进行溶瘤腺病毒包装，标记为溶瘤腺病毒oad-rgd(包装示意图见图14)。
[0269]
实施例八溶瘤腺病毒oad-rgd的肿瘤体外杀伤活性检测
[0270]
将96孔板分别铺入u87mg、a375、a549、skov3和t98g每孔各3
×
103个细胞，37℃过夜培养。次日，u87mg、a375、skov3和t98g按照moi(pfu)＝62.5、125、250和500，a549按照moi(pfu)＝125、250、500和1000，分别感染ad-null(复制缺陷型腺病毒，此腺病毒无复制能力)、oad-null和oad-rgd。感染3-6天后，cck8法检测细胞的存活情况。
[0271]
结果显示(图15)，在肿瘤细胞u87mg、a375、a549、skov3和t98g中，与ad-null相比，oad-null能够有效杀伤这5种肿瘤细胞。oad-rgd与oad-null相比，oad-rgd杀伤肿瘤细胞活性更强，具有统计学差异(p《0.05)。
[0272]
实施例九溶瘤腺病毒oad-rgd的体内肿瘤杀伤活性检测
[0273]
(1)a375肿瘤模型：4周大小的balb/c nude小鼠皮下接种1
×
107个a375细胞，待肿瘤体积长至约50-100mm3时，给药，分组如下：
[0274]
①
pbs:50μl无菌pbs；
[0275]
②
oad-null：每只1
×
107pfu，体积50μl；
[0276]
③
oad-rgd:每只1
×
107pfu，体积50μl；
[0277]
给药方式：将溶瘤病毒给药次数减少，每周一次，共2次，瘤内给药。定期量取小鼠肿瘤大小。
[0278]
(2)u87mg肿瘤模型：4周大小的balb/c nude小鼠皮下接种2
×
106个u87mg细胞，待肿瘤体积长至约50-100mm3时，给药，分组如下：
[0279]
①
pbs:50μl无菌pbs；
[0280]
②
oad-null：每只5
×
106pfu，体积50μl；
[0281]
③
oad-rgd:每只5
×
106pfu，体积50μl；
[0282]
给药方式：每周一次，共2次，瘤内给药。定期量取小鼠肿瘤大小。
[0283]
从结果看(图16a)，在a375肿瘤模型中，pbs组肿瘤生长较快，与pbs相比，oad-null在显著抑制肿瘤生长(p《0.05)，抑瘤率为46.2％。而oad-rgd溶瘤腺病毒抑制肿瘤生长最为明显，与pbs相比有极显著差异(p《0.01)肿瘤抑制率达到77％。在u87mg模型中(图16b)，pbs组肿瘤生长也相对较快，与pbs相比，oad-null溶瘤腺病毒能够有效抑制肿瘤生长(p《0.05)，肿瘤抑制率达到61.5％。而与oad-null相比，oad-rgd显著抑制u87mg肿瘤生长(p《0.05)，肿瘤抑制率达65.5％。
[0284]
实施例十溶瘤病毒oad-rgd-外源基因的构建和包装方法
[0285]
1、重组穿梭质粒的构建
[0286]
将pdc516质粒用限制性内切酶xbai和hindiii酶切后，再将mhtert启动子与腺病毒增殖所必需的e1a/e1b-19k连入酶切后的pdc516质粒，构建为pdc516-mhtert。
[0287]
2、骨架质粒pbhgff-rgd的构建
[0288]
(1)将腺病毒载体pbhgfrtdele13flp(简写pbhgff)与predet(表达重组酶)共转入dh10b细菌中，获得阳性克隆菌dh10b(pbhgff+predet)，目的是获得表达重组酶并含有腺病
100mm3，通过蛇形分组对小鼠进行分组，共4组，治疗方法如下：
[0316]
①
mc38肿瘤模型：每组5只
[0317]
pbs组(注射生理盐水，50μl/只)；
[0318]
ad-null组(注射ad-null病毒1
×
108pfu/只，50μl)；
[0319]
oad-null组(注射oad-null病毒1
×
108pfu/只，50μl)；
[0320]
oad-sirpα-fc组(注射oad-sirpα-fc病毒1
×
108pfu/只，50μl)。注射方式为瘤内多点注射，每两天注射一次，共5次。每次注射前测量肿瘤体积并记录，治疗结束后，每隔一天测量一次肿瘤体积。
[0321]
②
4t1肿瘤模型：每组7只
[0322]
pbs组(注射生理盐水，50μl/只)；
[0323]
ad-null组(注射ad-null病毒3
×
108pfu/只，50μl)；
[0324]
oad-null组(注射oad-null病毒3
×
108pfu/只，50μl)；
[0325]
oad-siglec-10-f组(注射oad-siglec-10-f病毒3
×
108pfu/只，50μl)。注射方式为瘤内多点注射，每两天注射一次，共5次。每次注射前测量肿瘤体积并记录，治疗结束后，每隔一天测量一次肿瘤体积，
[0326]
③
ct26肿瘤模型：每组5只
[0327]
pbs组(注射生理盐水，50μl/只)；
[0328]
ad-null组(注射ad-null病毒1
×
108pfu/只，50μl)；
[0329]
oad-null组(注射oad-null病毒1
×
108pfu/只，50μl)；
[0330]
oad-tigit-fc组(注射oad-tigit-fc病毒1
×
108pfu/只，50μl)。注射方式为瘤内多点注射，每两天注射一次，共5次。每次注射前测量肿瘤体积并记录，治疗结束后，每隔一天测量一次肿瘤体积。
[0331]
结果：
①
在mc38模型中(图20a和b)，ad-null有微弱的肿瘤抑制作用，但生存期与pbs无差异。oad-null能够明显抑制mc38的生长并且有效延长小鼠生存期。而oad-sirpα-fc能够显著抑制mc38肿瘤的生长，与pbs和ad-null相比有显著统计学差异(p《0.01)。当生存期观察到第100天时，oad-sirpα-fc组小鼠存活率为60％，oad-null组小鼠存活率为20％，且存活的小鼠其背部肿瘤全部消退。因此，oad-sirpα-fc治疗可显著延长mc38荷瘤小鼠生存期。
[0332]
②
在4t1模型中(图21a和b)，ad-null同样有微弱的肿瘤抑制作用，但生存期与pbs无差异。oad-null能够明显抑制4t1的生长并且有效延长小鼠生存期。而oad-siglec-10-fc能够显著抑制4t1肿瘤的生长，与pbs组相比有统计学差异(p《0.001)，在治疗第19天，oad-siglec-10的抑瘤率达到60.4％，并且显著延长小鼠的生存期。结果表明，oad-siglec-10能够有效抑制4t1肿瘤的生长并延长小鼠生存期。
[0333]
③
在ct26模型中(图22a)，pbs对照组小鼠肿瘤平均体积为2520
±
407.5mm3，ad-null组小鼠肿瘤平均体积为1684
±
337.4mm3，oad-null组小鼠肿瘤平均体积为967.6
±
84.94mm3，oad-tigit-fc组小鼠肿瘤平均体积为153.9
±
84.94mm3。其中，oad-null组与pbs对照组小鼠肿瘤体积差异显著(p＜0.05)，oad-tigit-fc组与pbs对照组小鼠肿瘤体积差异极显著(p＜0.001)。在小鼠生存期实验中(图22b)，pbs对照组和ad-null组小鼠分别在接种肿瘤后33天和37天全部死亡，oad-null组小鼠存活率为20％，oad-tigit-fc组存活率为
40％。表明溶瘤腺病毒oad-tigit-fc组对ct26皮下瘤模型具有很好的治疗效果。
[0334]
(4)oad-sirpα-fc，oad-siglec-10-fc和oad-tigit-fc激活全身免疫反应检测
[0335]
采用远端肿瘤模型进一步检测了oad-sirpα-fc，oad-siglec-10-fc和oad-tigit-fc激发的全身性免疫反应。
[0336]
方法：在c57bl/c小鼠的左侧和右侧背部分别皮下接种mc38肿瘤，建立远端肿瘤模型。4t1和ct26的远端肿瘤模型使用balb/c小鼠，建立方法同mc38.
[0337]
当小鼠右侧肿瘤体积达到80-100mm3，通过蛇形分组对小鼠进行分组，共4组。给予右侧肿瘤溶瘤腺病毒治疗方法，分组方式、给药方式和给药时间参照本实施例3(3)所示。
[0338]
结果：在mc38模型中(图23a),oad-null和oad-sirpα-fc给药组左侧肿瘤生长显著受到抑制，且oad-sirpα-fc组的抑制效果更为明显。在4t1模型中(图23b),同样oad-null和oad-siglec-10-fc给药组左侧肿瘤生长显著受到抑制，且oad-siglec-10-fc组的抑制效果更为明显。在ct26模型中(图23c),oad-null和oad-tigit-fc给药组左侧肿瘤生长显著受到抑制，尽管oad-tigit-fc组与oad-null组的肿瘤受抑制程度一致，但oad-tigit-fc组的左侧8个肿瘤中有4个完全消退，而但oad-null组的左侧8个肿瘤中有2个完全消退，表明oad-tigit-fc诱导的全身免疫反应更强。
[0339]
实施例十二表达抗原分子epcam的溶瘤病毒oad-hepcamt的构建和功能验证
[0340]
上皮细胞粘附分子(epcam)是一种跨细胞粘附分子-膜糖蛋白，主要以有序和定向的方式表达于某些管腔上皮细胞，细胞恶性转化后，epcam在癌细胞细胞表面过度表达从而成为epcam特异性car-t细胞治疗的有效靶点。本实验中采用无胞内信号段的人源肿瘤抗原epcam，标记为hepcamt。
[0341]
1.oad-hepcamt具备“溶瘤”能力并且能够显著提高肿瘤细胞表达hepcamt。
[0342]
方法：按照实施例十的方法构建溶瘤腺病毒oad-hepcamt。不同moi的ad-gfp(阴性对照，不具有增殖能力)、oad-null和oad-hepcamt感染hepcam阴性细胞系a375，在感染48和72h后，用cck8法检测a375细胞存活并用流式细胞术检测a375细胞中hepcamt的表达。
[0343]
结果：与ad-gfp相比，oad-null和oad-hepcamt能够显著抑制a375的增强，表明oad-null和oad-hepcamt具有显著的“溶瘤”能力(图24a)。流式细胞术检测发现随着感染时间和moi的增加，a375细胞表达hepcamt显著上升(图24b)。
[0344]
2.oad-hepcamt能够显著抑制a375肿瘤生长
[0345]
方法：在体内实验中，建立裸鼠a375皮下瘤模型，在接瘤第12天肿瘤体积约50-100mm3，将小鼠随机分为6组，每组5只，给药方案如下：
[0346]
①
pbs组：瘤内注射生理盐水，50μl/只；
[0347]
②
oad-null组：注射oad-rgd病毒1
×
107pfu/只，50μl；
[0348]
③
oadhepcamt组；(注射oadhepcamt病毒1
×
107pfu/只，50μl)；
[0349]
注射方式为瘤内多点注射，每周给药一次，共2次，测量肿瘤的长和宽，并记录。
[0350]
结果：结果显示，与pbs组相比，oadhepcamt治疗显著抑制a375细胞的生长(p《0.01)，抑瘤率达73.8％。并且与oad-null相比，oadhepcamt治疗的抑瘤效果也有统计学差异(p《0.05)(图24c)。
[0351]
实施例十三表达细胞因子的溶瘤病毒oad-rgd-gm-csf，oad-rgd-ifnα-2b、oad-rgd-il10和oad-rgd-ccl5的构建和功能验证
[0352]
按照实施例十的方法构建溶瘤腺病毒oad-rgd-gm-csf，oad-rgd-ifnα-2b、oad-rgd-il10和oad-rgd-ccl5。
[0353]
(1)首先在体外验证了这4个溶瘤腺病毒的杀伤活性和表达细胞因子活性
[0354]
方法：ad-null、oad-rgd、oad-rgd-gm-csf，oad-rgd-ifnα-2b、oad-rgd-il10和oad-rgd-ccl5。用不同moi的病毒量感染mc38肿瘤细胞72h后，使用cck8试剂和细胞样品在37℃孵育1h，用酶标仪测定在450nm处的吸光度计算溶瘤腺病毒感染孔的细胞活率。
[0355]
结果：从实验结果看(图25a),ad-null对mc38细胞无杀伤活性(作为阴性对照)。而oad-rgd、oad-rgd-gm-csf，oad-rgd-ifnα-2b、oad-rgd-il10和oad-rgd-ccl5。0能够特异性杀伤肿瘤细胞(图25a),依然表明溶瘤腺病毒表达细胞因子仍具有较好的“溶瘤”活性。
[0356]
(2)为验证oad-rgd-gm-csf、oad-rgd-ifnα-2b、oad-rgd-il10和oad-rgd-ccl5。在动物模型中抑制肿瘤生长的效果，建立了mc38小鼠皮下肿瘤模型。小鼠肿瘤体积达到80-100mm3，通过蛇形分组对小鼠进行分组，共5组，治疗方法如下：
[0357]
pbs组(注射生理盐水，50μl/只)；
[0358]
oad-rgd组(注射oad-rgd病毒5
×
107pfu/只，50μl)；
[0359]
oad-rgd-gm-csf组(注射oad-rgd-gm-csf病毒5
×
107pfu只，50μl)；
[0360]
oad-rgd-ifnα-2b组(注射oad-rgd-ifnα-2b病毒5
×
107pfu/只，50μl)；
[0361]
oad-rgd-il10组(注射oad-rgd-il10病毒5
×
107pfu/只，50μl)；
[0362]
oad-rgd-ccl5组(注射oad-rgd-ccl5病毒5
×
107pfu/只，50μl)；
[0363]
注射方式为瘤内多点注射，每两天注射一次，共5次。每次注射前测量肿瘤体积并记录，治疗结束后，每隔一天测量一次肿瘤体积。
[0364]
结果：从结果看(图25b)，与pbs相比，低剂量的oad-rgd能够有效抑制mc38肿瘤生长。而与oad-rgd相比，表达外源细胞因子的oad-rgd-gm-csf，oad-rgd-ifnα-2b、oad-rgd-il10和oad-rgd-ccl5进一步显著抑制了mc38肿瘤的生长，具有统计学差异(p《0.05),表明溶瘤腺病毒表达的细胞因子起到调节免疫反应的作用。
[0365]
实施例十四表达免疫检查点分子抑制剂pd-1抗体的溶瘤oad-rgd-αpd-1和表达免疫调节分子4-1bb的溶瘤病毒oad-rgd-4-1bb构建和功能验证
[0366]
上述多项结果已经表明，在溶瘤病毒的δe3区插入外源基因，并不影响溶瘤病毒的溶瘤活性，并且也能够成功表达外源基因，因而在下述溶瘤病毒中，我们仅进行动物实验来验证结果。
[0367]
方法：按照实施例十的方法构建溶瘤腺病毒oad-rgd-αpd-1和oad-rgd-4-1bb。为验证oad-rgd-αpd-1和oad-rgd-4-1bb在动物模型中抑制肿瘤生长的效果，建立了mc38小鼠皮下肿瘤模型。小鼠肿瘤体积达到80-100mm3，通过蛇形分组对小鼠进行分组，共4组，治疗方法如下：
[0368]
pbs组(注射生理盐水，50μl/只)；
[0369]
oad-rgd组(注射oad-rgd病毒5
×
107pfu/只，50μl)；
[0370]
oad-rgd-αpd-1组(注射oad-rgd-αpd-1病毒5
×
107pfu只，50μl)；
[0371]
oad-rgd-4-1bb组(注射oad-rgd-4-1bb病毒5
×
107pfu/只，50μl)；
[0372]
注射方式为瘤内多点注射，每两天注射一次，共5次。每次注射前测量肿瘤体积并记录，治疗结束后，每隔一天测量一次肿瘤体积。
[0373]
结果：从结果看(图26)，与pbs相比，低剂量的oad-rgd能够有效抑制mc38肿瘤生长。在给药后第19天，与pbs相比，表达免疫检查点分子抑制剂pd-1抗体的溶瘤oad-rgd-αpd-1或表达免疫调节分子的oad-rgd-4-1bb进一步显著抑制了mc38肿瘤的生长，抑瘤率分别65.2％和50.3％，并且与oad-rgd相比具有统计学差异(p《0.05)，,表明溶瘤腺病毒表达的免疫抑制剂和免疫调节分子起到调节免疫反应的作用。
[0374]
实施例十五表达酶类分子ph20酶的溶瘤oad-rgd-ph20的构建和功能验证
[0375]
方法：按照实施例十的方法构建溶瘤腺病毒oad-rgd-ph20。为验证oad-rgd-ph20在动物模型中抑制肿瘤生长的效果，建立了mc38小鼠皮下肿瘤模型。小鼠肿瘤体积达到80-100mm3，通过蛇形分组对小鼠进行分组，共5组，治疗方法如下：
[0376]
pbs组(注射生理盐水，50μl/只)；
[0377]
oad-rgd组(注射oad-rgd病毒5
×
107pfu/只，50μl)；
[0378]
oad-rgd-ph20组(注射oad-rgd-ph20病毒5
×
107pfu只，50μl)；
[0379]
注射方式为瘤内多点注射，每两天注射一次，共5次。每次注射前测量肿瘤体积并记录，治疗结束后，每隔一天测量一次肿瘤体积。
[0380]
结果：从结果看(图27)，与pbs相比，oad-rgd能够有效抑制mc38肿瘤生长。在给药后第19天，oad-rgd-ph20进一步显著抑制了mc38肿瘤的生长，并且与oad-rgd相比具有统计学差异(p《0.05)，表明oad-rgd-ph20表达的ph20在肿瘤微环境中影响了外基质的性质，提高了抗肿瘤作用。
[0381]
实施例十六表达stat3 sirna的溶瘤病毒oad-rgd-sistat3的构建和功能验证
[0382]
方法：按照实施例十的方法构建溶瘤腺病毒oad-rgd-sistat3(sistat3的核酸序列见seq id no.23)。为验证oad-rgd-sistat3在动物模型中抑制肿瘤生长的效果，建立了mc38小鼠皮下肿瘤模型。小鼠肿瘤体积达到80-100mm3，通过蛇形分组对小鼠进行分组，共5组，治疗方法如下：
[0383]
pbs组(注射生理盐水，50μl/只)；
[0384]
oad-rgd组(注射oad-rgd病毒5
×
107pfu/只，50μl)；
[0385]
oad-rgd-sistat3组(注射oad-rgd-sistat3病毒5
×
107pfu/只，50μl)；
[0386]
注射方式为瘤内多点注射，每两天注射一次，共5次。每次注射前测量肿瘤体积并记录，治疗结束后，每隔一天测量一次肿瘤体积。
[0387]
结果：从结果看(图28)，与pbs相比，oad-rgd能够有效抑制mc38肿瘤生长。在给药后第19天，oad-rgd-sistat3进一步显著抑制了mc38肿瘤的生长，并且与oad-rgd相比具有统计学差异(p《0.05)。
[0388]
综合多个表达多个类别抗肿瘤相关的外源基因的溶瘤腺病毒的抗肿瘤效果，本发明优化的肿瘤特异性启动、rgd和δe3区插入的外源基因三者可起到“1+1+1》3”的协同作用，能更进一步地提高溶瘤腺病毒的抗肿瘤作用。
[0389]
本发明其他使用到的氨基酸和核苷酸序列：
[0390]
seq id no.16(e1a(delta24)的核苷酸序列)：
[0391]
atgagacatattatctgccacggaggtgttattaccgaagaaatggccgccagtcttttggaccagctgatcgaagaggtactggctgataatcttccacctcctagccattttgaaccacctacccttcacgaactgtatgatttagacgtgacggcccccgaagatcccaacgaggaggcggtttcgcagatttttcccgactctgtaatgttggcgg
tgcaggaagggattgacttactcacttttccgccggcgcccggttctccggagccgcctcacctttcccggcagcccgagcagccggagcagagagccttgggtccggtttctatgccaaaccttgtaccggaggtgatcgatccacccagtgacgacgaggatgaagagggtgaggagtttgtgttagattatgtggagcaccccgggcacggttgcaggtcttgtcattatcaccggaggaatacgggggacccagatattatgtgttcgctttgctatatgaggacctgtggcatgtttgtctacagtaagtgaaaattatgggcagtgggtgatagagtggtgggtttggtgtggtaattttttttttaatttttacagttttgtggtttaaagaattttgtattgtgatttttttaaaaggtcctgtgtctgaacctgagcctgagcccgagccagaaccggagcctgcaagacctacccgccgtcctaaaatggcgcctgctatcctgagacgcccgacatcacctgtgtctagagaatgcaatagtagtacggatagctgtgactccggtccttctaacacacctcctgagatacacccggtggtcccgctgtgccccattaaaccagttgccgtgagagttggtgggcgtcgccaggctgtggaatgtatcgaggacttgcttaacgagcctgggcaacctttggacttgagctgtaaacgccccaggccataaggtgtaaacctgtgattgcgtgtgtggttaacgcctttgtttgctgaatgagttgatgtaagtttaataaagggtgagataatgttt
[0392]
seq id no.17(e1b 19k的核苷酸序列)
[0393]
tatataatgcgccgtgggctaatcttggttacatctgacctcatggaggcttgggagtgtttggaagatttttctgctgtgcgtaacttgctggaacagagctctaacagtacctcttggttttggaggtttctgtggggctcatcccaggcaaagttagtctgcagaattaaggaggattacaagtgggaatttgaagagcttttgaaatcctgtggtgagctgtttgattctttgaatctgggtcaccaggcgcttttccaagagaaggtcatcaagactttggatttttccacaccggggcgcgctgcggctgctgttgcttttttgagttttataaaggataaatggagtgaagaaacccatctgagcggggggtacctgctggattttctggccatgcatctgtggagagcggttgtgagacacaagaatcgcctgctactgttgtcttccgtccgcccggcgataataccgacggaggagcagcagcagcagcaggaggaagccaggcggcggcggcaggagcagagcccatggaacccgagagccggcctggaccctcgggaatga
[0394]
seq id no.18(e1adelta24-e1b 19k的核苷酸序列)：
[0395]
atgagacatattatctgccacggaggtgttattaccgaagaaatggccgccagtcttttggaccagctgatcgaagaggtactggctgataatcttccacctcctagccattttgaaccacctacccttcacgaactgtatgatttagacgtgacggcccccgaagatcccaacgaggaggcggtttcgcagatttttcccgactctgtaatgttggcggtgcaggaagggattgacttactcacttttccgccggcgcccggttctccggagccgcctcacctttcccggcagcccgagcagccggagcagagagccttgggtccggtttctatgccaaaccttgtaccggaggtgatcgatccacccagtgacgacgaggatgaagagggtgaggagtttgtgttagattatgtggagcaccccgggcacggttgcaggtcttgtcattatcaccggaggaatacgggggacccagatattatgtgttcgctttgctatatgaggacctgtggcatgtttgtctacagtaagtgaaaattatgggcagtgggtgatagagtggtgggtttggtgtggtaattttttttttaatttttacagttttgtggtttaaagaattttgtattgtgatttttttaaaaggtcctgtgtctgaacctgagcctgagcccgagccagaaccggagcctgcaagacctacccgccgtcctaaaatggcgcctgctatcctgagacgcccgacatcacctgtgtctagagaatgcaatagtagtacggatagctgtgactccggtccttctaacacacctcctgagatacacccggtggtcccgctgtgccccattaaaccagttgccgtgagagttggtgggcgtcgccaggctgtggaatgtatcgaggacttgcttaacgagcctgggcaacctttggacttgagctgtaaacgccccaggccataaggtgtaaacctgtgattgcgtgtgtggttaacgcctttgtttgctgaatgagttgatgtaagtttaataaagggtgagataatgtttaacttgcatggcgtgttaaatggggcggggcttaaagggtatataatgcgccgtgggctaatcttggttacatctgacctcatggaggcttgggagtgtttggaagatttttctgctgtgcgtaacttgctggaacagagctctaacagtacctcttggttttggaggtttctgtggggctcatcccaggcaaagttagtctgcagaattaaggaggattacaagtgggaatttgaagagcttttgaaatcctgtggtgagctgtttgattctttgaatctgggtcaccaggcgcttttccaagagaaggt
catcaagactttggatttttccacaccggggcgcgctgcggctgctgttgcttttttgagttttataaaggataaatggagtgaagaaacccatctgagcggggggtacctgctggattttctggccatgcatctgtggagagcggttgtgagacacaagaatcgcctgctactgttgtcttccgtccgcccggcgataataccgacggaggagcagcagcagcagcaggaggaagccaggcggcggcggcaggagcagagcccatggaacccgagagccggcctggaccctcgggaatga
[0396]
seq id no.19(rgd肽的氨基酸序列)：
[0397]
cdcrgdcfc
[0398]
seq id no.20(sirpα-fc核酸序列)：
[0399]
atgggatggagctgtatcatcctctttctggtggctacagccactggcgtccatagcgaggagctgcaagtcattcagccagataagtccgtgctggtggccgctggagagacagccacactgagatgtacagccacatctctgatcccagtcggacctatccagtggtttaggggcgctggccccggaagggagctgatttacaaccagaaggagggccacttccctagggtcactacagtcagcgatctgactaaaagaaacaacatggacttcagcattaggatcggcaacatcactccagccgacgccggcacatactactgtgtcaagtttaggaagggctccccagatgacgtcgaattcaagagcggcggcggcggaggaagcggaggaggaggcagcggaggcggaggatccgagagcaagtatggcccaccttgtccaccttgtccagccccagaggctgctggcggcccatccgtgttcctcttcccaccaaagccaaaggacactctcatgatctctaggactccagaggtgacatgtgtcgtggtggatgtctcccaagaggatccagaggtccagttcaattggtacgtcgacggagtcgaagtccacaatgccaagacaaagcctagagaggagcagttcaacagcacttatagggtggtgagcgtcctcacagtgctgcatcaagattggctgaacggcaaggagtacaaatgcaaggtgagcaacaagggactgccaagctccatcgagaagacaatcagcaaggccaagggccagcctagggagccacaagtgtatacactgccaccatcccaagaggaaatgactaagaaccaagtgtctctgacttgcctcgtcaagggcttctatcctagcgatatcgctgtggagtgggagagcaatggccagccagagaacaactacaagactactccaccagtgctggatagcgacggctccttttttctctactctaggctgacagtggacaagtccagatggcaagagggcaacgtgttcagctgcagcgtcatgcatgaggctctgcataaccactacactcagaagagcctctctctgtctctgggctga
[0400]
seq id no.21(siglec-10-fc核酸序列)：
[0401]
atgggctggagctgtattatcctctttctggtggccaccgctaccggcgtgcacagcatggacggcagattctggattagagtgcaagagagcgtcatggtccccgagggactctgcatctccgtcccttgcagctttagctaccctaggcaagactggaccggaagcacccccgcttatggatactggttcaaggccgtgaccgagaccacaaagggcgctcccgtggccacaaaccaccaatccagagaggtggagatgagcaccagaggaagattccagctgaccggcgatcccgctaagggcaattgcagcctcgtgattagagacgcccagatgcaagacgaatcccagtacttctttagagtggagagaggaagctacgtgagatacaatttcatgaatgatggcttctttctgaaagtgaccgctctcacacagaagcccgacgtctatatccccgagacactcgagcccggccagcccgtcaccgtgatctgcgtgttcaattgggccttcgaggagtgcccccctccctcctttagctggaccggcgctgctctgtcctcccaaggcacaaagcctaccacaagccatttcagcgtgctgagctttacccctagaccccaagaccacaacaccgatctgacatgtcacgtggacttctctagaaagggagtgagcgcccagagaaccgtgagactgagagtggcctacgctcccagagatctggtgatcagcatcagcagagataacacccccgctctggagcctcagcctcaaggaaatgtgccctatctcgaggcccaaaagggacagttcctcagactgctctgtgctgccgactcccaacctcccgccacactgagctgggtgctgcagaatagggtcctctccagcagccatccttggggccctaggcctctgggactggaactgcccggcgtcaaggctggagattccggcagatacacatgcagagctgagaacagactgggaagccagcaaagggctctggatctgagcgtgcagtatcctcccgagaatctgagggtgatggtcagccaagccaacagaacagtgctggaaaacctcggcaacggcacctctctgcccgtgctggagggccaatctctgtgtctggtgtgcgtgacccattccagcccccccgctagactcagctggacccagagaggacaagtgctgagcccctcccagccttcc
gatcccggcgtgctcgagctgcctagagtgcaagtggagcatgaaggcgagtttacatgccacgctagacatcctctgggcagccagcacgtgtctctgtctctgtccgtccattattcccccaaactgctcggacctagctgtagctgggaggccgagggactgcactgcagctgttccagccaagcctcccccgccccttctctgaggtggtggctgggagaggagctcctcgagggcaactcctcccaagactccttcgaggtgacaccctcctccgctggaccttgggccaattcctctctgtctctgcatggaggactgagctccggactgaggctgagatgtgaagcttggaatgtgcacggcgctcagtccggaagcattctccaactgcccgacaagaagggactgatcagcacagccttcagcaacggcggcggaggaagcggaggcggaggcagcggaggaggaggcagcgaacctaagagctgcgacaagacacacacatgccctccttgccccgcccccgagctcctcggcggaccttccgtcttcctcttccctcccaaacccaaggacacactcatgatctctagaacccccgaggtgacatgtgtggtcgtggacgtcagccatgaggaccccgaggtcaaattcaactggtacgtggatggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaaacctagagaggagcaatacaacagcacatatagagtcgtgtccgtcctcaccgtgctgcaccaagactggctcaacggcaaagagtataagtgcaaagtcagcaacaaggctctgcccgcccccatcgagaagacaatctccaaggccaagggccagcctagagagccccaagtgtatacactgcccccctctagagatgagctcaccaaaaatcaagtgagcctcacatgcctcgtgaagggattttacccctccgacatcgctgtcgagtgggaaagcaacggccaacccgagaacaactacaagaccacccctcccgtcctcgattccgacggaagcttctttctgtactccaaactgaccgtcgacaagtctagatggcagcaaggcaacgtctttagctgcagcgtcatgcacgaggctctgcacaatcattacacccagaagtctctgtctctgtcccccggctga
[0402]
seq id no.22(tigit-fc核酸序列)：
[0403]
atgggatggagctgcattattctgtttctggtggccaccgccaccggcgtgcactccatgatgaccggcaccatcgaaaccaccggaaacatctccgccgagaagggcggcagcatcattctgcagtgccatctgagcagcacaaccgcccaagtgacccaagtgaactgggagcagcaagaccagctgctggccatctgtaacgccgatctgggctggcacatctcccccagctttaaagatagagtcgctcccggccccggactgggactcacactgcagtctctgacagtcaacgacaccggcgaatacttctgcatctaccacacctaccccgatggcacctacaccggaagaatctttctggaggtgctcgaaagcagcgtggctgaacatggcgccagattccaaattcccggaggaggaggaagcggcggaggaggctccggaggcggaggaagcgagcctaagagctgcgataagacccatacatgccctccttgccccgcccccgaactgctgggaggaccttccgtgtttctgtttccccccaagcccaaagacacactgatgatctctagaacacccgaagtgacatgcgtcgtggtggacgtgtcccacgaggatcccgaggtgaagttcaactggtacgtggacggagtcgaggtgcacaacgccaagaccaagcctagagaggagcagtacaactccacctatagagtcgtcagcgtgctgaccgtgctgcaccaagattggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtgagcaacaaggctctgcccgctcctatcgagaagaccatcagcaaggccaagggccaacccagagagccccaagtgtatacactgcccccctctagagatgagctgacaaagaaccaagtgtctctgacatgtctggtgaaaggcttttaccccagcgacatcgctgtcgagtgggagagcaacggccagcccgagaacaactacaagaccacccctcccgtgctggattccgacggatccttctttctgtacagcaagctgacagtggacaagtctagatggcagcaaggcaacgtgttcagctgctccgtgatgcatgaggctctgcataaccactacacccagaagtctctgtctctgagccccggctga
[0404]
seq id no.23(sistat3核酸序列)：
[0405]
sense 5’uuagcccaugugaucugacacccugaa3’。