一组诊断沙林暴露的生物标志物及其应用

1.本发明涉及医学生物检测领域，具体涉及一组诊断沙林暴露的生物标志物及其应用。


背景技术：

2.沙林(gb)，学名甲氟膦酸异丙酯，属于g类神经性毒剂，经沙林暴露后，其主要的毒理作用是抑制外周和中枢神经系统中的乙酰胆碱酯酶(ache)活性，从而导致乙酰胆碱(ach)在神经系统中大量堆积，造成胆碱能突触过度刺激，使暴露人员因呼吸衰竭、癫痫而死亡。ache属于丝氨酸水解酶，主要存在于神经肌肉接头、中枢神经系统中神经元之间的突触中，这种酶的作用是水解释放的ach，终止神经递质对突触后膜的持续兴奋作用。有机磷酸酯类化合物中磷原子具有亲电子性，ache酯解部位处丝氨酸羟基上具有亲核性的氧原子，两者会以共价键形式结合形成磷酰化ache共键加合物，沙林与ache加合物不能自行水解，且只有在非常有限的程度上，磷酰化的ache才能被重新激活，但这种激活方式需要经毒剂暴露后立即进行。虽然随着体内新ache的合成，幸存人员体内的酶活性会缓慢恢复至正常水平，但若没有对暴露毒剂的幸存人员进行及时治疗，有可能诱发癫痫，造成严重的脑损伤，并带来长期的神经和行为缺陷，尽早对毒剂未暴露人员进行区分，具有非常重要的意义。
3.沙林进入人体后会迅速与人体内多种蛋白质和酶发生反应，最终以三种形式存在于人体：毒剂原型、水解产物异丙基甲基膦酸(isopropyl methylphosphonic acid,impa)、蛋白质加合物(沙林-白蛋白、沙林-胆碱酯酶等)，这均可视为沙林暴露后的生物标志物，通过气相色谱-串联质谱、液相色谱-串联质谱、酶活力测定、氟离子重活化法直接质谱法等方法对这些生物标志物进行检测是目前判定沙林暴露的主要检测手段，可使专业人员评估人体在经沙林暴露后的毒害程度。然而上述生物标志物在检测时需要从血液、血浆、尿液等复杂基质中提取，操作繁琐；而经沙林暴露后毒剂原型、impa虽在人体内含量较高，但随着人体代谢作用，其含量会随暴露时间增加而减少；蛋白质加合物可以长期检测，且具有较高特异性，但与其他生物标志物相比，蛋白质加合物在人体内含量较低，需要精密检测设备，且样品前处理复杂，需要专业人员进行操作；而可以快速检测ache的酶测定法仍存在准确度差的问题，对低剂量毒剂暴露样品无法进行精准检测，只能作为佐证手段。
4.沙林生物标志物是经沙林暴露后生物机体所产生的可以对毒剂有较高特异性的一类化合物，是诊断毒剂暴露的重要指标，也有助于对毒剂毒理作用进行分析，开发解毒特效药物，同时对沙林暴露后快速检测、评估暴露患者的中毒程度、采取相应救治措施对患者进行治疗等意义重大。


技术实现要素：

5.基于现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种mrna作为诊断沙林暴露的生物标志物的方法。
6.为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
7.一组mrna作为诊断沙林暴露的生物标志物，所述生物标志物包括fosab、tcap、hspb9、ier2a、ier2b、btg2、hspb11、fkbp5、nr4a3、atf3、cebpb、fosl2、klhl13、march8、dctn1b、tbx15、znf648、rnf207b、hcls1、fhl5、cel、cpb1、a1cf共23个沙林易感基因。
8.上述生物标志物可用于制备沙林暴露早期诊断。
9.上述生物标志物可用于制备沙林暴露早期诊断试剂盒。
10.优选地，选用模式生物斑马鱼建立沙林暴露模型，斑马鱼与人类基因同源性高达87％，且与人类基因高度保守被广泛用于各类疾病的研究；斑马鱼产卵量大，每次至少有200-300个卵，样本量大适合高通量筛选，大样本量将动物的个体差异掩盖其中，假阳性率低。
11.首先，建立了斑马鱼沙林暴露模型，对沙林暴露后斑马鱼进行转录组测序，根据p-value验证差异基因是否具有显著性。选择同时具有多维统计分析fold change》＝2或《＝0.5认为沙林暴露斑马鱼和正常斑马鱼之间mrna表达水平存在明显的倍数差异，基于此筛选出不同时间段共同上调或下调基因。然后使用rt-qpcr对相关基因验证，筛选出12个上调表达基因与11个下调表达基因。最后采用morpholino敲低技术对相关基因进行敲低验证。
12.与现有技术相比较，本发明所提供一组诊断沙林暴露的生物标志物及其应用具有以下有益效果：
13.1、本发明使用转录组测序筛选出沙林易感基因，同时使用rt-qpcr对其进行验证，筛选出上调倍数大于5及下调倍数大于2)且p value小于0.05的共23个基因，确定其具有良好的检验效益，可作为沙林暴露生物标志物。
14.2、本发明提出mrna为沙林暴露生物标志物有利于分析沙林毒理作用靶点，为日后的沙林暴露治疗药物的开发提供新的靶点和思路。
15.3、本发明以mrna作为生物标志物进行沙林暴露早期诊断，简单易行，诊断标准受主观因素影响较小，安全有效。
附图说明
16.图1为差异基因聚类分析热图，a.染毒后1h组与对照组ck；b.染毒后4h组与对照组ck；c.染毒后12h组与对照组ck。
17.图2为差异基因表达频数分布直方图。
18.图3为沙林暴露后斑马鱼相关上调基因rt-qpcr结果(n＝15)；其中，与ck组相比，*：p＜0.05；**：p＜0.01；***：p＜0.001；****：p＜0.0001。
19.图4为沙林暴露后斑马鱼相关下调基因rt-qpcr结果(n＝15)；其中，与ck组相比，*：p＜0.05；**：p＜0.01；***：p＜0.001；****：p＜0.0001。
20.图5为mo斑马鱼毒剂暴露统计；a.染毒mo斑马鱼心包水肿数量；b.染毒mo斑马鱼脊柱侧弯数量；c.染毒mo斑马鱼死亡数；d.gb-tcap-mo斑马鱼表型。
21.图6为对照组与mo基因敲低组经沙林暴露斑马鱼不同表型。
具体实施方式
22.以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验
方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
23.实施例1
24.1、实验步骤
25.(1)斑马鱼染毒模型建立。本发明以4日龄斑马鱼幼鱼为实验对象，首先给予不同浓度的沙林进行染毒，分为高、中、低三个浓度组，观察沙林染毒一小时斑马鱼存活情况，最后确立染毒浓度。对实验进行分组，共分四组，ck组、染毒后1h、4h、12h组。ck组不做处理，其余组均进行1h沙林暴露，液氮保存。其余换水进行正常培养，换水3h后取出40条，为染毒后4h组，液氮保存，换水11h后取出40条，为染毒后12h组，液氮保存。
26.(2)差异表达基因筛选。实验完成后样本送到联川生物公司进行转录组基因测序。测序数据我们以差异倍数fc》＝2或fc《＝0.5(即log2fc的绝对值》＝1)且p值《0.05作为标准，认为由此筛选出的基因为差异表达基因。
27.(3)差异表达基因验证。对筛选出来的差异表达基因进行设计引物及验证，使用rt-qpcr剔除假阳性，同时采用2
‑△△
ct
法对数据归一化，进行单因素方差分析。其中，p《0.05为具有统计学意义，p《0.01为具有极显著统计学意义。以此筛选出沙林暴露易感基因。
28.(4)morpholino敲低验证。为探究筛选上调基因是否为沙林毒剂作用靶标，选用morpholino并结合相关文献选取了六个重要的上调基因(fosab、tcap、btg2、atf3、ier2a、cebpb)进行敲低，并进行染毒处理，记录不同时间段内各组幼鱼的行为、体态，以及24h死亡数。
29.2、实验结果
30.(1)本发明对转录组测序数据进行差异基因聚类分析，如图1所示，红色表示高表达基因，蓝色表示低表达基因，根据样品基因表达谱的相近程度，将基因进行聚类分析，直观地展示基因在不同样品(或不同处理)中的表达情况。
31.(2)本发明对总计32 057个斑马鱼基因进行生物信息学分析，以差异倍数fc》＝2或fc《＝0.5(即log2fc的绝对值》＝1)且p值《0.05作为标准。其中，染毒1h后，共发现上调差异表达基因254个，下调差异表达基因437个；染毒4h后，共发现上调差异表达基因461个，下调差异表达基因326个；染毒12h后，共发现上调差异表达基因212个，下调差异表达基因219个。差异基因表达频数分布直方图如图2所示。
32.(3)差异较大基因引物设计如表1所示，其中上调基因为fosab、tcap、hspb9、ier2a、ier2b、btg2、hspb11、fkbp5、nr4a3、atf3、cebpb、fosl2，下调基因为klhl13、march8、dctn1b、tbx15、znf648、rnf207b、hcls1、fhl5、cel、cpb1、a1cf。使用rt-qpcr对相关基因进行验证，上调基因rt-qpcr结果如图3，下调基因rt-qpcr结果如图4。
33.表1斑马鱼验证引物序列
34.[0035][0036]
(4)morpholino敲低验证
[0037]
为探究筛选上调基因是否为沙林毒剂作用靶标，本发明选用morpholino并结合相
关文献选取了六个重要的上调基因(fosab、tcap、btg2、atf3、ier2a、cebpb)进行敲低验证，morpholino基因敲低序列如表2所示。经过对斑马鱼胚胎进行morpholino显微注射，待胚胎发育至4日龄，对各组不同morpholino斑马鱼幼鱼进行相同浓度沙林暴露处理，分别记录染毒1h、4h、8h、12h时间段内各组幼鱼的行为、体态，以及24h死亡数(图5、6)。利用morpholino敲低技术对各基因进行敲低处理，结果与对照组的死亡率、心包水肿、体态等均有不同，本发明认为筛选出的基因均与沙林暴露有关。
[0038]
表2 morpholino基因敲低序列
[0039]
morpholino序列(5
’‑3’
)tcap-mogactgagcaaacctgcatcttcagcier2a-mocctctgctgtgacatccattgfosab-moaggctggtaaacatcatcctgtcaabtg2-mocgtgggtcattattatccgtccgatf3-moctgaagcatcatgccgaaatctggtcebpb-mocctcgtaaaaaccggccacttccat
[0040]
综上所示，本发明使用转录组测序筛选出沙林易感基因，同时使用rt-qpcr对其进行验证，筛选出上调倍数大于5及下调倍数大于2共23个基因。同时采用2
‑△△
ct
法对数据归一化，进行单因素方差分析。其中，p《0.05为具有统计学意义，p《0.01为具有极显著统计学意义，确定其具有良好的检验效益，同时，结合相关文献选取了六个重要的上调基因fosab、tcap、btg2、atf3、ier2a、cebpb。利用morpholino敲低技术对各基因进行敲低处理，结果与对照组的死亡率、心包水肿、体态等均有不同，我们认为筛选出的基因均与沙林暴露有关可作为沙林暴露生物标志物。
[0041]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

技术特征：
1.fosab、tcap、btg2、atf3、ier2a、cebpb中至少一种mrna作为生物标志物在制备沙林暴露诊断试剂中的应用。2.fosab、tcap、btg2、atf3、ier2a、cebpb中至少一种mrna作为生物标志物在沙林暴露诊断方法中的应用，所述方法为非诊断目的。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述方法为采用rt-qpcr分析法分别检测待测样本中上述基因表达量。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述rt-qpcr采用特异性扩增引物，所述特异性扩增引物序列为seq id no.1至seq id no.4、seq id no.7至seq id no.8，seq id no.11至seq id no.12和seq id no.19-seq id no.22所示。5.检测fosab、tcap、btg2、atf3、ier2a、cebpb中至少一种mrna的试剂在制备沙林暴露诊断产品中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述产品为试剂盒或者芯片。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述试剂为特异性扩增引物，所述特异性扩增引物序列为seq id no.1至seq id no.4、seq id no.7至seq id no.8，seq id no.11至seq id no.12和seq id no.19-seq id no.22所示。8.一种用于沙林暴露诊断的检测产品，其特征在于：所述产品包含权利要求4所述的引物。

技术总结
本发明公开了一组诊断沙林暴露的生物标志物。本发明通过对沙林暴露斑马鱼进行转录组测序分析，筛选出23个沙林易感基因，其中上调基因为fosab、tcap、hspb9、ier2a、ier2b、btg2、hspb11、fkbp5、nr4a3、atf3、cebpb、fosl2，下调基因为klhl13、march8、dctn1b、tbx15、znf648、rnf207b、hcls1、fhl5、cel、cpb1、a1cf，同时使用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，RT-qPCR)和反义寡核苷酸(Morpholino,MO)技术进行验证，证明了其中fosab、tcap、btg2、atf3、ier2a、cebpb在诊断沙林暴露的准确性。本发明一方面有利于用作沙林暴露生物标志物，用于诊断或辅助诊断沙林暴露，另一方面可分析沙林毒理作用靶点，为日后的沙林暴露治疗药物的开发提供新的靶点和思路。开发提供新的靶点和思路。开发提供新的靶点和思路。


技术研发人员：卢荣灿 罗康 王德强 陈萧寒 周硕
受保护的技术使用者：中国科学院重庆绿色智能技术研究院
技术研发日：2023.04.07
技术公布日：2023/8/1