一种双功能融合蛋白及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种双功能融合蛋白及其制备方法和应用。


背景技术：

2.在肿瘤微环境中，转化生长因子β(transforming growth factor-β，tgf-β)对免疫抑制起着重要作用。tgf-β调节许多类型免疫细胞的产生和功能。它通过直接促进treg细胞的增殖，抑制效应t细胞(teff)和抗原递呈树突状细胞(dc)的产生和功能，控制适应性免疫。类似地，tgf-β通过抑制自然杀伤细胞(nk细胞)和调节巨噬细胞和中性粒细胞的复杂行为来控制先天免疫系统，从而形成一个负性免疫调节输入网络。据研究表明血管生成是恶性肿瘤生长的关键因素之一，而血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，vegf)，是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，对其加以抑制可以有效抑制肿瘤生长。以vegf抗体为代表的抗血管生成药物由于其特异性好、疗效好和不易耐药等特点，已经成为抗肿瘤靶向药研发的热门领域。
3.贝伐珠单抗(bevacizumab，avastin)是由罗氏(roche)旗下genetech公司研发的一种重组人源化免疫球蛋白g1(igg1)单克隆抗体，可以结合vegf-a，抑制其与vegf受体-2(vegfr-2)结合，继而抑制vegf的生物学作用，包括影响血管的渗透性、增生以及内皮细胞迁移与存活，达到抑制肿瘤血管生成、生长以及转移的效果。目前，多种小分子和大分子vegf拮抗剂与pd-1或pd-l1联合治疗已在包括晚期肝癌等在内的多种癌症中展示了非凡的疗效，已成为重要的癌症联合疗法之一。
4.负抑制性肿瘤微环境是业界公认的阻碍和限制包括细胞程序性死亡受体1(pd-1)和程序性死亡配体1(pd-l1)在内的免疫检查点药物有效发挥临床疗效的主要因素。肿瘤微环境的负面影响在实体瘤中尤为突出，无论是在应答率和耐药性方面都是新药研发的重点。譬如m7824是由默克(merck)旗下默克雪兰诺公司研发的一种双功能融合蛋白，由抗pd-l1的单克隆抗体组成，并融合了人tgf-β受体ii(tgf-βrii)的细胞外结构域，可以同时拮抗pd-l1及tgf-β。m7824在早期临床研究中显示出了良好的活性，但在临床iii期研究中并未展示出优势。可见，仅抑制tgf-β还不足以克服肿瘤微环境的负面调控。
5.除此之外，现有的包含tgf-β受体的双功能融合蛋白，以默克的m7824为例，因为tgf-β受体的固有生理特性，导致这类双功能融合蛋白在纯化过程中会出现断裂，这些片段将会极大的降低纯化效率，提高生产成本，并最终影响成药药效。加上pd-l1抗体的临床剂量远大于pd-1抗体，更提高了m7824的临床开发难度和其未来临床应用的限制。


技术实现要素：

6.鉴于以上所述现有理论和技术的缺点，本发明的目的在于提供一种双功能融合蛋白及其制备方法和应用，用于解决现有技术中的问题，同时在高效克服肿瘤微环境方面提供新的技术路线，增强与pd-1或pd-l1联合治疗的疗效。
7.本发明的一个方面是提供一种双功能融合蛋白，所述双功能融合蛋白包括拮抗vegf片段和拮抗tgf-β片段；
8.所述拮抗vegf片段包括重链，所述重链相比原始重链至少包括第453位的氨基酸突变；和/或，所述拮抗tgf-β片段相比原始拮抗tgf-β片段至少包括第8位的氨基酸突变。
9.本发明的另一个方面是提供一种分离的多核苷酸，编码如上所述的双功能融合蛋白。
10.本发明的另一个方面是提供一种构建体，所述构建体含有如上所述的分离的多核苷酸。
11.本发明的另一个方面是提供一种表达系统，所述表达系统含有如上所述的构建体或基因组中整合有外源的如上所述的多核苷酸。
12.本发明的另一个方面是提供如上所述的双功能融合蛋白的制备方法，包括：在合适的条件下培养如上所述的表达系统，使之表达所述双功能融合蛋白，分离、纯化以提供所述双功能融合蛋白。
13.本发明的另一个方面是提供如上所述的双功能融合蛋白在制备药物中的用途。所述药物用于治疗与vegf和/或tgf-β表达相关疾病，优选用于治疗肿瘤。所述治疗肿瘤包括抑制肿瘤血管的生成、生长以及转移，抑制肿瘤细胞的生成、增殖以及转移和浸润，促进肿瘤细胞的凋亡等。
14.本发明的另一个方面是提供一种药物组合物，包括如上所述的双功能融合蛋白或如上所述的表达系统或如上所述的表达系统的培养物。
15.本发明中，所述双功能融合蛋白，与所述双功能融合蛋白相关的生物材料，可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。在一具体实施方式中，本发明所述双功能融合蛋白，与所述双功能融合蛋白相关的生物材料是通过将基因导入大肠杆菌或者酵母菌、哺乳动物细胞如cho细胞、hek293细胞等内，利用大肠杆菌、酵母菌或哺乳动物细胞等表达产生的。
16.本发明的有益效果包括：
17.1)本发明通过调整拮抗vegf片段，将其重链第453位的k氨基酸残基缺失突变，以及调整拮抗tgf-β片段的序列，将其氨基酸序列第8位的k氨基酸残基突变为a(k
→
a的突变)，制备得到的双功能融合蛋白具有良好的稳定性，纯化过程中不易出现断裂，在生产过程中能够提高纯化效率，降低生产成本；本发明纯化得到的双功能融合蛋白的分子量约为179kd，纯度大于98％。
18.2)本发明所述双功能融合蛋白具有非常好的亲和力，能够与重组人tgf-β1/2/3结合，亲和力基本与m7824相当；所述双功能融合蛋白能够与重组人vegf结合，亲和力基本与avastin相当；此外，本发明所述双功能融合蛋白能够同时与重组人tgf-β1/2/3和avastin结合；因此，本发明所述双功能融合蛋白可以应用于与vegf和/或tgf-β表达相关疾病的治疗。
19.3)通过体内抗肿瘤药效实验表明，本发明所述双功能融合蛋白能够有效抑制小鼠肿瘤的生长，可以用于肿瘤的治疗。
附图说明
20.图1显示为本发明实施例4中双功能融合蛋白还原电泳鉴定实验结果示意图。
21.图2显示为本发明实施例4中双功能融合蛋白非还原电泳鉴定实验结果示意图。
22.图3显示为本发明实施例4中还原电泳鉴定双功能融合蛋白的稳定性结果。
23.图4显示为本发明实施例5中tgf-β1elisa实验结果示意图。
24.图5显示为本发明实施例5中tgf-β2elisa实验结果示意图。
25.图6显示为本发明实施例5中tgf-β3elisa实验结果示意图。
26.图7显示为本发明实施例6中vegf elisa实验结果示意图。
27.图8显示为本发明实施例7中同时检测tgf-β及vegf结合的elisa实验结果示意图。
28.图9显示为本发明实施例8中抑制vegf诱导的huvec增殖实验结果示意图。
29.图10显示为本发明实施例9中抑制tgf-β诱导的人乳腺癌mda-mb-231细胞迁移实验结果示意图。
30.图11显示为本发明实施例9中抑制tgf-β诱导的人乳腺癌mda-mb-231细胞迁移实验统计结果示意图。
31.图12显示为本发明实施例10中双功能融合蛋白对tgf-β的中和作用实验的实验结果示意图，其中control为pbs；control 2为pbs+tgf-β1；control 3为10nm hsp088-01+tgf-β1；test 1为1nm双功能融合蛋白+tgf-β1；test 2为10nm双功能融合蛋白+tgf-β1；test 3为100nm双功能融合蛋白+tgf-β1。
32.图13显示为本发明实施例11中双功能融合蛋白的小鼠体内抑瘤实验结果示意图。其中，各图中的曲线分别代表该实验组的每只动物肿瘤生长曲线。
具体实施方式
33.为了使本发明的发明目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容容易地了解本技术发明的其他优点及功效。
34.本发明的发明人经过大量实践研究，利用基因定向诱变技术，将融合蛋白中的vegf和tgf-β受体进行基因突变，从而显著改善了蛋白纯化过程中的肽键断裂问题，降低了纯化难度，从而制备出了稳定性高、且可以同时抑制vegf和tgf-β的双功能融合蛋白，在此基础上完成了本发明。
35.本发明第一方面提供一种双功能融合蛋白，所述双功能融合蛋白包括拮抗vegf片段和拮抗tgf-β片段。上述双功能融合蛋白中的拮抗vegf片段通常是经受基因突变后的片段，例如，可以是经任何现有已知的拮抗vegf片段突变后的片段。拮抗vegf片段可以是vegf受体片段。所述拮抗tgf-β片段可以是tgf-β受体片段经受基因突变后的片段，例如，可以是经任何现有已知的拮抗tgf-β片段突变后的片段。
36.所述拮抗vegf片段包括重链，所述重链相比原始重链至少包括第453位的氨基酸突变。
37.所述拮抗tgf-β片段相比原始拮抗tgf-β片段至少包括第8位的氨基酸突变。
38.作为优选，所述拮抗vegf片段的重链第453位的氨基酸突变包括氨基酸的缺失或替代。所述替代是指将第453位氨基酸残基k替换为其他非k氨基酸或其衍生物，如替换为g、
a、v、l、i、p、f、w、m、y、s、t、c、n、q、d、e、r、h氨基酸残基。
39.作为优选，所述拮抗tgf-β片段第8位的氨基酸突变包括氨基酸的缺失或替代。所述替代是指将第8位氨基酸残基k替换为其他非k氨基酸或其衍生物，如替换为g、a、v、l、i、p、f、w、m、y、s、t、c、n、q、d、e、r、h氨基酸残基。优选地，所述拮抗tgf-β片段第8位的氨基酸残基的突变是指将k突变为a(k
→
a)。
40.作为优选，本发明所述双功能融合蛋白包含前述至少一项突变。
41.作为优选，所述原始重链的氨基酸序列如seq id no.6所示。
42.作为优选，所述原始拮抗tgf-β片段的氨基酸序列如seq id no.7所示。
43.在一些优选实施方式中，所述双功能融合蛋白包含第453位的氨基酸的缺失突变以及第8位的氨基酸突变为k
→
a突变。
44.在一些优选实施方式中，所述拮抗vegf片段的重链具体可以包括：
45.a-2)氨基酸序列如seq id no.2所示的多肽片段；或，
46.b-2)氨基酸序列与seq id no.2具有90％以上序列一致性，包含第453位的氨基酸残基缺失突变，且具有a-2)限定的多肽片段的功能的多肽片段。具体的，b-2)中的多肽片段具体指：如seq id no.2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)氨基酸而得到的，或者在n-末端和/或c-末端添加一个或多个(具体可以是1-50个、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)氨基酸而得到的，且具有氨基酸序列如seq id no.2所示的多肽片段的功能的多肽片段，例如，可以是拮抗vegf的功能。所述b-2)中的氨基酸序列可与seq id no.2具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％以上的序列一致性。
47.在一些优选实施方式中，所述拮抗tgf-β片段具体可以包括：
48.c)氨基酸序列如seq id no.3所示的多肽片段；或，
49.d)氨基酸序列与seq id no.3具有90％以上序列一致性，包含第8位氨基酸残基突变k8a(将k突变为a)，且具有c)限定的多肽片段的功能的多肽片段。具体的，d)中的多肽片段具体指：如seq id no.3所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)氨基酸而得到的，或者在n-末端和/或c-末端添加一个或多个(具体可以是1-50个、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)氨基酸而得到的，且具有氨基酸序列如seq idno.3所示的多肽片段的功能的多肽片段，例如，可以是拮抗tgf-β的功能。所述d)中的氨基酸序列可与seq id no.3具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％以上的序列一致性。
50.在一些优选实施方式中，所述拮抗vegf片段还包含轻链。所述轻链具体可以包括：
51.a-1)氨基酸序列如seq id no.1所示的多肽片段；或，
52.b-1)氨基酸序列与seq id no.1具有90％以上序列一致性且具有a-1)限定的多肽片段的功能的多肽片段。具体的，b-1)中的多肽片段具体指：如seq id no.1所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)氨基酸而得到的，或者在n-末端和/或c-末端添加一个或多个(具体可以是1-50个、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)氨基酸而得到的，且具有氨基酸序列如seq id no.1所示的多肽片段的功能的多肽片段，例如，可以是拮抗vegf的功能。所述b)中的氨基酸序列可与seq id no.1具有90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％或99％以上的序列一致性。
53.本发明所提供的双功能融合蛋白中，双功能融合蛋白还可以包括连接肽片段。优选的，所述连接肽片段富含g、s和/或a，其中，“富含g、s和/或a”是指富含g、s和a，或富含g和s，或富含g和a。更优选的，所述连接肽片段包括氨基酸序列可以如seq id no.5所示的多肽片段。
54.本发明所提供的双功能融合蛋白中，双功能融合蛋白自n端至c端可以依次包括拮抗vegf片段、拮抗tgf-β片段。
55.在本发明一具体实施例中，双功能融合蛋白的氨基酸序列可以包括seq id no.4所示的重链序列和seq id no.1所示的轻链序列。
56.本发明第二方面提供一种分离的多核苷酸，编码本发明第一方面所提供的双功能融合蛋白。
57.本发明第三方面提供一种构建体，所述构建体含有本发明第二方面所提供的分离的多核苷酸。合适的提供上述构建体的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的。例如，上述构建体通常可以通过将上述分离的多核苷酸插入合适的载体中构建获得。
58.本发明第四方面提供一种表达系统，所述表达系统含有本发明第三方面所提供的构建体或基因组中整合有外源的本发明第二方面所提供的多核苷酸，从而可表达所述的融合蛋白。所述表达系统通常可以是宿主细胞，所述宿主细胞可以细菌、真菌或哺乳动物细胞等中的一种或几种。
59.其中，所述细菌选自大肠杆菌、干酪乳杆菌、脆弱拟杆菌、鲁氏不动杆菌、具核梭杆菌、乔氏拟杆菌、拟南芥拟杆菌、鼠李糖乳杆菌、马赛拟杆菌、卵形拟杆菌、空肠弯曲菌、腐生葡萄球菌、粪肠球菌、多形拟杆菌、普通拟杆菌、单形拟杆菌、粪副拟杆菌、死亡梭杆菌以及短双歧杆菌中的一种或几种。
60.其中，所述真菌选自酵母和/或霉菌。所述酵母选自酿酒酵母、杜氏假丝酵母、光滑假丝酵母、季也蒙假丝酵母、乳酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、多形汉逊酵母、毕赤酵母、脆壁克鲁维氏酵母、乳酸克鲁维氏酵母、栗酒裂殖酵母、白假丝酵母、葡萄牙假丝酵母、梅林假丝酵母、嗜油假丝酵母、近平滑假丝酵母、热带假丝酵母以及产朊假丝酵母中的一种或几种；所述霉菌选自棒曲霉、灰绿曲霉群、烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、构巢曲霉、米曲霉、土曲霉、焦曲霉以及杂色曲霉中的一种或几种。
61.其中，所述哺乳动物细胞选自cho细胞、hek 293人胚胎肾细胞、bowes黑色素瘤细胞、cos-7细胞、c127细胞、hela细胞、bhk细胞、sp2/0小鼠浆细胞、ns0小鼠浆细胞、cos猴肾细胞、cho-s、r1小鼠胚胎细胞、3t3小鼠成纤维细胞、bhk21叙利亚仓鼠成纤维细胞、mdck狗上皮细胞、ptk1鼠袋鼠上皮细胞、e14.1小鼠胚胎细胞、h1人胚胎细胞、h9人胚胎细胞以及per c.6人胚胎细胞中的一种或几种。在一些优选实施方式中，所述哺乳动物细胞选自cho细胞和/或hek293人胚胎肾细胞。在另一些优选实施方式中，所述宿主细胞为cho-k1细胞。
62.本发明第五方面提供本发明第一方面所提供的双功能融合蛋白的制备方法。本领域技术人员可选择合适的方法以制备所述融合蛋白。例如，上述多功能融合蛋白的制备方法可以包括：在合适的条件下培养本发明第四方面所提供的表达系统，使之表达所述融合蛋白，收集含有所述融合蛋白的培养物，而后分离及纯化以提供所述融合蛋白。
63.本发明第六方面提供本发明第一方面所提供的双功能融合蛋白在制备药物中的
用途，所述药物用于治疗与vegf和/或tgf-β表达相关疾病，优选地，所述疾病选自肿瘤、自身免疫性疾病和眼科疾病中的一种或几种。本发明所提供的双功能融合蛋白不仅具有良好的稳定性，还同时与tgf-β和vegf具有非常好的亲和力，与原研药物avastin和对照药物m7824进行对比，与抗原的结合能力相似，从而使得双功能融合蛋白可以被应用于与vegf和/或tgf-β表达相关疾病的治疗。
64.上述与vegf和/或tgf-β表达相关疾病可以是肿瘤等，具体可以是实体瘤或血液肿瘤，更具体可以是结直肠癌(crc)、肝细胞癌(hcc)、卵巢癌(oc)、宫颈癌(cca)、甲状腺癌(tc)、黑色素瘤(mm)、肺癌(lc)、头颈癌(hnc)、鼻咽癌(npc)、胶质细胞瘤(gbm)，前列腺癌(pca)、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤(ppgl)、胃癌(gc)、食管癌(ec)、肾细胞癌(rcc)、膀胱尿路上皮癌(blca)、胰腺癌(pac)、乳腺癌(brca)、淋巴瘤(lymphoma)、肉瘤(sar)、急性或慢性白血病等。
65.上述与vegf和/或tgf-β表达相关疾病可以是自身免疫性疾病，所述自身免疫性疾病选自系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、系统性硬化症、口眼干燥综合征、多发性肌炎中的一种或多种。
66.上述与vegf和/或tgf-β表达相关疾病可以是眼科疾病，所述眼科疾病包括但不限于干性amd、湿性amd或脉络膜新生血管(cnv)；例如，可以选自年龄相关性黄斑变性(amd)、脉络膜新生血管(cnv)、脉络膜新生血管膜(cnvm)、黄斑囊样水肿(cme)、视网膜前膜(erm)和黄斑裂洞；近视相关的cnvm、血管样条纹、视网膜脱落、糖尿病视网膜病变、糖尿病黄斑水肿(dme)、视网膜色素上皮细胞(rpe)的萎缩性病变或肥厚性病变，视网膜静脉阻塞、脉络膜视网膜静脉阻塞、黄斑水肿；由于缺氧导致的角膜血管生成、翼状胬肉结膜、视网膜下水肿和视网膜内水肿；由于视网膜静脉阻塞导致的黄斑水肿、色素性视网膜炎、斯特格氏病、青光眼、炎性疾病、白内障、难治性异常现象、圆锥形角膜、早产儿视网膜病变、眼前部血管生成、角膜炎后角膜血管生成、角膜移植或角膜成形中的一种或几种。
67.本发明第七方面提供一种药物组合物，包括本发明第一方面所提供的双功能融合蛋白或本发明第四方面所提供的表达系统或表达系统的培养物。上述药物组合物还可以包括药学上可接受的载体。所述载体可以包括各种赋形剂和稀释剂，这些载体本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体对于本领域技术人员来说应该是熟知的，例如，在remington's pharmaceutical sciences(mack pub.co.，n.j.,1991)中可找到关于药学上可接受的载体的充分讨论。
68.本发明中，上述药物或组合物等中，本发明第一方面所提供的双功能融合蛋白可以是作为单一有效成分，也可以与其他活性组分进行组合使用。
69.本发明第八方面提供一种治疗方法包括：向个体施用治疗有效剂量的本发明第一方面所提供的双功能融合蛋白、或本发明第七方面所提供的组合物。本发明所提供的治疗方法可以用于治疗与vegf和/或tgf-β表达相关疾病，具体可以是肿瘤等。
70.本发明所述抗体、应用或药物组合物中，所述双功能融合蛋白还可以与肿瘤治疗的其他手段或药物联合使用(包括肿瘤标准治疗方法/手段)，包括但不限于手术、放疗、化疗、肿瘤免疫治疗等。所述双功能融合蛋白与肿瘤治疗的其他药物联合使用时，可以制备成药物组合物，或与其他肿瘤治疗的其他药物分别施用。制备成药物组合物时，所述药物组合物的活性成分除包含本发明所述双功能融合蛋白外，还包括肿瘤治疗的其他药物，所述双
功能融合蛋白与肿瘤治疗的其他药物的质量比可以为任何合适的比例，如1：(1-99)，具体例如是1:99、1:98、1:97、1:96、1:95、1:94、1:93、1:92、1:91、1:90、1:89、1:88、1:87、1:86、1:85、1:84、1:83、1:82、1:81、1:80、1:79、1:78、1:77、1:76、1:75、1:74、1:73、1:72、1:71、1:70、1:69、1:68、1:67、1:66、1:65、1:64、1:63、1:62、1:61、1:60、1:59、1:58、1:57、1:56、1:55、1:54、1:53、1:52、1:51、1:50、1:49、1:48、1:47、1:46、1:45、1:44、1:43、1:42、1:41、1:40、1:39、1:38、1:37、1:36、1:35、1:34、1:33、1:32、1:31、1:30、1:29、1:28、1:27、1:26、1:25、1:24、1:23、1:22、1:21、1:20、1:19、1:18、1:17、1:16、1:15、1:14、1:13、1:12、1:11、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1。所述肿瘤治疗的其他药物与双功能融合蛋白的质量比可以为任何合适的比例，如1：(1-99)，具体例如是1:99、1:98、1:97、1:96、1:95、1:94、1:93、1:92、1:91、1:90、1:89、1:88、1:87、1:86、1:85、1:84、1:83、1:82、1:81、1:80、1:79、1:78、1:77、1:76、1:75、1:74、1:73、1:72、1:71、1:70、1:69、1:68、1:67、1:66、1:65、1:64、1:63、1:62、1:61、1:60、1:59、1:58、1:57、1:56、1:55、1:54、1:53、1:52、1:51、1:50、1:49、1:48、1:47、1:46、1:45、1:44、1:43、1:42、1:41、1:40、1:39、1:38、1:37、1:36、1:35、1:34、1:33、1:32、1:31、1:30、1:29、1:28、1:27、1:26、1:25、1:24、1:23、1:22、1:21、1:20、1:19、1:18、1:17、1:16、1:15、1:14、1:13、1:12、1:11、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1。所述分别施用可以是在施用本发明所述双功能融合抗体之前、同时或之后施用肿瘤治疗的其他药物。
71.对于肿瘤放疗，常见辐射类型包括但不限于x射线、γ射线和带电粒子如电子、质子和重离子。
72.对于肿瘤化疗，常见的化疗药物包括：
①
细胞毒类药物：烷化剂类如氮芥、卡莫司汀(卡氮芥)、环磷酰胺、白消安(马利兰)、洛莫司汀(环己亚硝脲)等；
②
抗代谢类药：如氟尿嘧啶、甲氨喋呤、阿糖胞苷、巯基嘌呤、替加氟(呋喃氟尿嘧啶)等；
③
抗生素类：如放线菌素d(更生霉素)、丝裂霉素、博菜霉素、阿毒素、平阳霉素、柔红霉素、光辉霉素等；
④
生物碱类：如长春新碱、长春碱、羟基树碱及鬼臼毒素类依托泊苷(vp-16)、替尼泊苷(vm-26)；
⑤
激素类，如他莫昔芬(三苯氧胺)、乙烯雌酚、黄体酮、丙酸睾丸酮、甲状腺素、泼尼松及地塞米松等；
⑥
其它：如甲基苄肼、羟基脲、l-门冬酰胺酶、顺铂、卡铂、抗癌锑、三嗪咪唑胺等。
73.对于肿瘤免疫治疗，主要包括免疫调节剂、过继性细胞转移疗法(act)、肿瘤特异性疫苗、小分子免疫药物等。
74.其中，免疫调节剂包括共刺激分子的激活剂、免疫检查点抑制剂(icb)、免疫检查点激活剂等。
75.在某些实施方式中，所述免疫调节剂是共刺激分子的激活剂。在一个实施方式中，所述共刺激分子的激动剂选自ox40、cd2、cd27、cds、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)、4-1bb(cd137)、gitr、cd30、cd40、baffr、hvem、cd7、light、nkg2c、slamf7、nkp80、cd160、b7-h3或cd83配体的激动剂(如激动性抗体或其抗原结合片段或可溶性融合蛋白)。
76.在某些实施方式中，所述免疫调节剂是免疫检查点分子的抑制剂(icb)或激活剂，所述免疫检查点分子是免疫检查点刺激途径和抑制途径的分子。免疫检查点抑制剂是针对相应的免疫检查点的单抗类药物，其主要作用为阻断表达免疫检查点的肿瘤细胞与免疫细胞之间的作用，从而阻断肿瘤细胞对免疫细胞的抑制作用，从而影响免疫反应。在一个实施方式中，所述单抗分子是全抗体或其片段(如fab、f(ab')2、fv、或单链fv片段(scfv))。在其
它实施方式中，所述单抗分子具有重链恒定区(fc)，选自例如igg1、igg2、igg3、igg4、igm、iga1、iga2、igd和ige的重链恒定区。在一个实施方式中，所述恒定区被改变(如突变)以修饰抗体分子特性(例如增加或降低以下一种或多种：fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基数目、效应细胞功能或补体功能)。
77.在一个实施方式中，所述免疫检查点抑制剂是pd-1、pd-l1、pd-l2、pd-l3、ctla4、tim-3、lag3、ceacam(如ceacam-1、ceacam-3和/或ceacam-5)、vista、vsir、btla、tigit、lair1、lmtk3、tight、ido、cd27l、cd40、cd47、cd137、cd160、cd244、cd270、gitr、b7-h1、b7-1、2b4和/或tgf-βr的抑制剂。在一个实施方式中，所述免疫检查点抑制剂可抑制pd-1、pd-l1、pd-l2、pd-l3、ctla4、tim-3、lag3、ceacam(如ceacam-1、ceacam-3和/或ceacam-5)、vista、vsir、btla、tigit、lair1、lmtk3、tight、ido、cd27l、cd40、cd47、cd137、cd160、cd244、cd270、gitr、b7-h1、b7-1、2b4和/或tgfrβ，或其任意组合。在另一个实施方式中，所述免疫检查点抑制剂可抑制pd-1、pd-l1、lag-3、tim-3、ceacam(如ceacam-1、-3和/或-5)或ctla4，或其任意组合。在另一个实施方式中，所述双功能融合蛋白与可抑制pd-1和/或pd-l1的免疫检查点抑制剂联合使用。术语“抑制”或“抑制剂”包括使指定分子的活性，如pd-1或pd-l1的活性，抑制至少5％、10％、20％、30％、40％或更多。因此，抑制不一定需要是100％。
78.其中，过继性细胞转移疗法(act)包括：肿瘤浸润淋巴细胞(til)疗法、工程t细胞受体(tcr)疗法、嵌合抗原受体t细胞(car-t)疗法、nk细胞疗法。
79.其中，肿瘤特异性疫苗包括：肿瘤全细胞疫苗、树突细胞疫苗、基因疫苗、rna疫苗和蛋白多肽疫苗。
80.肿瘤全细胞疫苗是将自身或异体同种肿瘤细胞经过物理、化学、生物学等方法处理，使之成为丧失致瘤性但保留抗原性的瘤苗，联合非特异性的刺激因子(如卡介苗等)对肿瘤患者进行主动免疫治疗。
81.树突细胞疫苗：树突细胞是一群异质性的免疫细胞，抗原提呈功能最强，是唯一能够激活初始型t细胞的专职抗原递呈细胞。
82.基因疫苗是将病原的保护性抗原编码的基因片段克隆入表达载体，用以转染细胞或真核细胞微生物及原核细胞微生物后得到的产物，或者将病原的毒力相关基因删除掉，使成为不带毒力相关基因的基因缺失疫苗，主要包括病毒载体类疫苗和细菌载体类疫苗；许多病毒被用于重组疫苗的载体，如腺病毒，痘状病毒等；细菌类载体主要是李斯特菌和沙门菌等。
83.蛋白多肽疫苗：是按照病原体抗原基因中已知或预测的某段抗原表位的氨基酸序列，通过化学合成技术制备的疫苗。如果能找到肿瘤细胞中特异的抗原，并以此氨基酸序列开发癌症疫苗，能够激活相关免疫细胞杀伤具体相同抗原的肿瘤细胞；如egf疫苗(cimavax)，mage-a3，tg4010等。
84.本文中，序列一致性(sequence identity)指参与对比的序列中相同残基的百分比。可采用本领域周知的计算软件计算两条或多条目的序列的序列一致性，这些软件可获自如ncbi等渠道。
85.本发明中，“个体”通常包括人类、非人灵长类，及其他哺乳动物如鼠类、狗、猫、马、羊、猪、牛等，其可因利用上述的药物、组合物、制剂、试剂盒或联合制剂进行治疗而获益。
86.本发明中，“治疗有效剂量”通常指某一剂量在经过适当的给药期间后，能够达到治疗如上所列出的疾病的效果。
87.本发明所提供的双功能融合蛋白，可以同时高效地拮抗vegf和tgf-β，且改造后的蛋白稳定性显著提高，在纯化过程中不易发生自然断裂，在保证药效的前提下显著降低了蛋白的纯化难度，提高了纯化效率，降低了生产成本。此外，本发明所提供的vegf/tgf-β双功能融合蛋白还具有药效高且副作用小的优点，具有良好的产业化前景。
88.下面通过实施例对本技术的发明予以进一步说明，但并不因此而限制本技术的范围。
89.除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见sambrook等molecular cloning：a laboratory manual，second edition，cold spring harbor laboratory press，1989and third edition，2001；ausubel等，current protocols in molecular biology，john wiley&sons，new york，1987and periodic updates；the series methods in enzymology，academic press，san diego；wolffe，chromatin structure and function，third edition，academic press，san diego，1998；methods in enzymology，vol.304，chromatin(p.m.wassarman and a.p.wolffe，eds.)，academic press，san diego，1999；和methods in molecular biology，vol.119，chromatin protocols(p.b.becker，ed.)humana press，totowa，1999等。
90.实施例1双功能融合蛋白的制备
91.将含有编码双功能融合蛋白的重链(seq id no.4)的多核苷酸和轻链(seq id no.1)的多核苷酸使用同一表达载体共同转染至cho-k1表达宿主细胞，用蛋氨酸亚氨基代砜(msx)加压筛选高表达克隆，将筛选得到的高表达克隆在emcd cho 104培养基(eminence)中37℃、5％ co2条件下进行大量培养、诱导表达，培养12-14天后收集细胞培养液。
92.实施例2双功能融合蛋白的纯化
93.对实施例1收集的细胞培养液进行离心及高速离心，随后进行亲和层析纯化，采用纳微科技公司的unimab 50hc纯化填料和akta(ge healthcare)蛋白纯化系统，按30mg蛋白/ml介质的剂量上样，平衡缓冲液(equilibration buffer)为ph 7.5的50mm tris-hcl+150mm nacl溶液，洗脱缓冲液(elution buffer)为ph 3.0的20mm na-citrater溶液，流速为5ml/min，收集含有目标蛋白的洗脱液，然后调节ph至7.0，进行理化性质和生物学活性的检测和鉴定。
94.实施例3对照融合蛋白的制备和纯化
95.对照融合蛋白的氨基酸序列包括seq id no.8所示的重链序列和seq id no.7所示的轻链序列。
96.其制备过程同实施例1；纯化过程同实施例2。
97.实施例4双功能融合蛋白的sds-page电泳鉴定
98.4.1sds-page电泳测定双功能融合蛋白的分子量和纯度
99.在还原(β-巯基乙醇)和非还原条件下，对实施例2中获得的双功能融合蛋白进行
sds-page电泳鉴定，采用分离胶浓度分别为12％和8％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，每孔上样量为3μg蛋白，电泳结果见图1(还原sds-page)、图2(非还原sds-page)，泳道1、2、3分别为靶向vegf与tgf-β的双功能融合蛋白的3个双功能融合蛋白重复样品，电泳结果表明目标蛋白分子量约为179kd，纯度大于98％。
100.4.2sds-page电泳测定双功能融合蛋白的稳定性
101.在还原(β-巯基乙醇)条件下，对实施例2中获得的双功能融合蛋白和实施例3获得的对照融合蛋白进行sds-page电泳鉴定，采用分离胶浓度分别为12％和8％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，每孔上样量为3μg蛋白，电泳结果见图3(还原sds-page)，泳道1、2分别为实施例3获得的对照融合蛋白和实施例2中获得的双功能融合蛋白。由图3可知，对照融合蛋白，即无k
→
a的突变的蛋白容易断裂(箭头标注的地方有明显的断裂蛋白)，含k
→
a突变的双功能融合蛋白，在对应1号泳道箭头处无明显断裂蛋白存在。说明本发明实施例2中获得的双功能融合蛋白具有非常高的稳定性。
102.实施例5重组人tgf-β1/2/3elisa实验
103.使用标准流程进行elisa实验：
104.5.1将溶解于ph 9.6的含有15mmol/l na2co3，35mmol/l nahco3和7.7mmol/l nan3的溶液的重组人tgf-β1、tgf-β2或tgf-β3包被于96孔板，在室温下过夜，每孔包被量为0.5μg。
105.5.2第二天，使用ph 7.4的含有0.05％ tween-20的tbs溶液冲洗96孔板四次，随后使用ph 7.4的含有0.05％ tween-20及5％脱脂奶粉的tbs溶液在室温下封闭孔板1小时。去除封闭液后，向孔板中分别加入不同浓度的双功能融合蛋白或对照药物m7824，并做复孔，在室温下孵育2小时。
106.5.3随后使用清洗液清洗孔板四次，加入抗人igg(fc特异性)-过氧化物酶山羊抗体并在室温下避光孵育30分钟。随后使用1m h2so4终止显色反应。
107.5.4使用envision读数器在450nm处读取吸光度，并在570nm处进行校正，详细结果如图4，图5和图6所示。
108.由图4，图5和图6可知，实施例1制备获得的双功能融合蛋白与tgf-β的亲和力基本与m7824相当，二者与tgf-β2的亲和力均较弱。实施例1制备获得的双功能融合蛋白和m7824与tgf-β1的亲和力ec50分别为2.843nm和2.076nm，与tgf-β3亲和力ec50分别为10.309nm和3.323nm。
109.实施例6重组人vegf elisa实验
110.为了检验实施例1中制备的双功能融合蛋白是否与人vegf结合，将重组人vegf(novoprotein)包被于96孔板中，在室温下过夜，每孔包被量为0.5μg。使用实施例1中制备的双功能融合蛋白或对照药物avastin进行实验，其他实验方法和步骤与实施例3中相同，具体结果如图7所示。
111.由图7可知，实施例1制备获得的双功能融合蛋白与vegf的亲和力基本与avastin相当，与vegf的亲和力ec50分别为0.0659nm和0.0168nm。
112.实施例7同时检测tgf-β及vegf结合的elisa实验
113.为了检验实施例1中制备的双功能融合蛋白是否同时与重组人tgf-β1/2/3及vegf结合，将重组人tgf-β1/2/3及vegf包被于96孔板中，在室温下过夜，每孔包被量tgf-β1/2/3
及vegf的量分别为0.5μg。使用实施例1中制备的双功能融合蛋白或对照药物m7824、avastin进行实验，其他实验方法和步骤与实施例3中相同，具体结果如图8所示。
114.由图8可知，实施例1制备获得的双功能融合蛋白可以同时与重组人tgf-β及vegf结合，ec50为0.0365nm。说明本发明的双功能融合蛋白能够同时与重组人tgf-β及vegf结合，实现同时抑制vegf与vegf受体的结合以及抑制tgf-β对免疫系统的调节作用，从而有效抑制vegf与tgf-β的生物学作用，包括影响血管的渗透性、增生以及内皮细胞的迁移与存活，提升效应t细胞和dc细胞的产生和功能等，进而抑制肿瘤的生长和增殖，达到抗肿瘤的效果。
115.实施例8双功能融合蛋白抑制vegf诱导的人脐静脉内皮细胞(huvec)增殖实验
116.huvec细胞以完全培养基重悬，稀释后接种于96孔板至5000cells/孔，之后将培养板置于37℃、5％co2、高湿度培养箱中孵育过夜。次日，弃去原培养基，加入ecm+1％ fbs培养基饥饿24h。将avastin、实施例1制备获得的双功能融合蛋白及hsp088-01(实施例1制备获得的双功能融合蛋白仅保留tgf-β片段活性的同型对照蛋白)以起始浓度10nm经3倍梯度稀释后加入到含细胞的板孔中，之后置于37℃、5％co2、高湿度培养箱中孵育72小时。96孔板取出后加入新鲜配制的cck-8(10％)检测液，置于37℃培养箱中孵育2～4小时，轻轻震荡后在spectramax m5设备上测定450nm波长处的吸光度，并以650nm处吸光度作为参比计算抑制率(抑制率％＝[1-(od
drug+vegf-od
no vegf
)/(od
only vegf-od
no vegf
)]*100)，用graphpad prism 6软件，拟合抑制曲线并计算ic
50
值，结果见图9。
[0117]
结果显示，avastin和实施例1制备获得的双功能融合蛋白均可有效抑制vegf诱导的huvec细胞增殖，ic
50
分别为0.3869nm和0.1964nm。
[0118]
实施例9双功能融合蛋白抑制tgf-β诱导的人乳腺癌mda-mb-231细胞迁移实验
[0119]
mda-mb-231细胞以完全培养基培养传代，收集对数生长期细胞，待细胞贴壁后，用l15+1％ fbs培养基饥饿16小时。matrigel用无血清的l15培养基按照1：2的比例稀释后加入transwell小室中，37℃孵育30分钟。将经饥饿培养后的mda-mb-231细胞重悬于无血清的l15培养基中，然后加入到每个含matrigel的transwell小室中，并分别加入空白培养基、实施例1制备获得的双功能融合蛋白及hsp088-01(实施例1制备获得的双功能融合蛋白仅保留tgf-β片段活性的同型对照蛋白)。共同孵育1h后，随后向上室再加入tgf-β储备液使其最终浓度为0.23nm(空白培养基组仅加入相同体积的培养基)，小室总体积为400μl(包含200μl matrigel)，下室含有600μl新鲜的l-15培养基，在37℃条件下孵育24h。孵育结束后，使用多聚甲醛固定20分钟，结晶紫染色20分钟。pbs洗涤后用倒置显微镜拍照，并用软件image j对细胞数量进行统计分析，结果分别见图10和图11。
[0120]
结果显示，tgf-β能够诱导mda-mb-231细胞迁移，在加入实施例1制备获得的双功能融合蛋白及hsp088-01之后，mda-mb-231细胞迁移的细胞数明显减少，且随着实施例1制备获得的双功能融合蛋白的浓度增加，对mda-mb-231细胞迁移的抑制能力逐渐增强。100nm的fs8002对mda-mb-231细胞迁移的抑制作用相较于仅含tgf-β的阴性对照具有显著性差异(p《0.05
＊＊
)。
[0121]
实施例10双功能融合蛋白对tgf-β的中和作用实验
[0122]
将mda-mb-231细胞接种于6孔板(1
×
106cells/孔)，37℃培养24小时后，不同孔中分别更换为pbs、pbs+tgf-β1或含有tgf-β1及不同浓度的实施例1制备获得的双功能融合蛋
白及hsp088-01(实施例1制备获得的双功能融合蛋白仅保留tgf-β片段活性的同型对照蛋白)培养液，换液后继续培养1小时。吸走6孔板中培养液上清，孔板中的细胞经d-pbs清洗后使用裂解液进行裂解。充分裂解后的样品立即进行sds-page电泳，并用western blot检测smad2/3及磷酸化(p-smad2/3)信号。实验结果见图12。
[0123]
结果显示，当mda-mb-231细胞仅以tgf-β1处理时，western blot可检测到p-smad2/3，说明tgf-β1可通过结合231细胞上的tgf-β受体(tgf-βr)诱导细胞内经典的smad信号通路。当同时加入tgf-β1和不同浓度的实施例1制备获得的双功能融合蛋白及hsp088-01时，western blot未检测到p-smad2/3，表明实施例1制备获得的双功能融合蛋白及hsp088-01均可中和tgf-β1，阻断了tgf-β1结合231细胞上的tgf-βr，从而阻断了smad下游信号传导。并且，实施例1制备获得的双功能融合蛋白在低至1nm浓度下即可有效中和tgf-β1。
[0124]
实施例11双功能融合蛋白的小鼠体内抑瘤实验
[0125]
将pbs重悬的mda-mb-231细胞以1
×
107个/0.1ml浓度，0.1ml(含30％基质胶)每只，接种于balb/c裸鼠的右侧胁肋部皮下，共转接100只小鼠。在成瘤22天后，淘汰未成瘤及肿瘤体积最大和最小的个体，挑选70只肿瘤体积适中的小鼠入组，每组10只，平均肿瘤体积达到70mm3左右。分组当天开始给药，每周两次分别注射实施例1制备获得的双功能融合蛋白或对照药物，共注射四周。实验期间测量并记录肿瘤体积和荷瘤鼠体重。
[0126]
其中，分组情况为：
[0127]
组1(g1)：对照组(单独使用生理盐水)；
[0128]
组2(g2)：单独使用对照药物贝伐珠单抗；
[0129]
组3(g3)：单独使用对照药物m7824；
[0130]
组4(g4)：单独使用对照药物阿维单抗；
[0131]
组5(g5)：对照药物贝伐珠单抗与阿维单抗联合使用；
[0132]
组6(g6)：单独使用实施例1制备获得的双功能融合蛋白；
[0133]
组7(g7)：实施例1制备获得的双功能融合蛋白+阿维单抗联合使用。
[0134]
结果见图13；将小鼠实验数据进行分析整理以给药时间为横坐标，肿瘤体积变化率为纵坐标做spider plot。可以得出：g6单独使用实施例1制备获得的双功能融合蛋白及g7实施例1制备获得的双功能融合蛋白+阿维单抗联合使用，相较于g1对照组的小鼠平均肿瘤体积，均显示出明显抑制作用。相较于g2单独使用对照药物贝伐珠单抗，g6单独使用实施例1制备获得的双功能融合蛋白对于小鼠肿瘤体积的抑制作用有显著提升。相较于g5对照药物贝伐珠单抗与阿维单抗联合使用，g7实施例1制备获得的双功能融合蛋白+阿维单抗联合使用对于小鼠肿瘤体积的抑制作用效果显著提高，在该组内甚至有四只小鼠经过用药后体内肿瘤完全消除。整体来说，本实施例动物实验展示了实施例1制备获得的双功能融合蛋白在balb/c裸小鼠体内对于mda-mb-231肿瘤细胞的良好抑制作用，且展示了与其他免疫检查点抑制剂联合使用的巨大潜力。
[0135]
综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点且具高度的产业化和商业价值。
[0136]
序列信息：
[0137]
seq id no.1
[0138]
轻链：
[0139]
diqmtqspsslsasvgdrvtitcsasqdisnylnwyqqkpgkapkvliyftsslhsgvpsrfs
[0140]
gsgsgtdftltisslqpedfatyycqqystvpwtfgqgtkveikrtvaapsvfifppsdeqlk
[0141]
sgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskady
[0142]
ekhkvyacevthqglsspvtksfnrgecseq id no.2
[0143]
重链：
[0144]
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[0145]
yaadfkrrftfsldtskstaylqmnslraedtavyycakyphyygsshwyfdvwgqgtl
[0146]
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[0147]
lqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapell
[0148]
ggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeq
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[0154]
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[0167]
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[0194]
kndenitletvchdpklpyhdfiledaaspkcimkekkkpgetffmcscssdecndniifsee
[0195]
yntsnpd
[0196]
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

技术特征：
1.一种双功能融合蛋白，其特征在于，所述双功能融合蛋白包括拮抗vegf片段和拮抗tgf-β片段；所述拮抗vegf片段包括重链，所述重链相比原始重链至少包括第453位的氨基酸突变；和/或，所述拮抗tgf-β片段相比原始拮抗tgf-β片段至少包括第8位的氨基酸突变。2.如权利要求1所述的双功能融合蛋白，其特征在于，所述原始重链的氨基酸序列如seq id no.6所示；和/或，所述原始拮抗tgf-β片段的氨基酸序列如seq id no.7所示。3.如权利要求1所述的双功能融合蛋白，其特征在于，所述第453位的氨基酸的突变包括氨基酸的缺失或替代；和/或，所述第8位的氨基酸突变包括氨基酸的缺失或替代。4.如权利要求3所述的双功能融合蛋白，其特征在于，所述第453位的氨基酸的突变为缺失突变，以及所述第8位的氨基酸突变为k
→
a突变。5.如权利要求4所述的双功能融合蛋白，其特征在于，所述拮抗vegf片段的重链包括：a-1)氨基酸序列如seq id no.2所示的多肽片段；或，b-1)氨基酸序列与seq id no.2具有90％以上序列一致性，且包含第453位的氨基酸的缺失突变，以及具有a-1)限定的多肽片段的功能的多肽片段。6.如权利要求4所述的双功能融合蛋白，其特征在于，所述拮抗tgf-β片段包括：c)氨基酸序列如seq id no.3所示的多肽片段；或，d)氨基酸序列与seq id no.3具有90％以上序列一致性，且包含第8位氨基酸的k
→
a突变，以及具有c)限定的多肽片段的功能的多肽片段。7.如权利要求1～6任一项所述的双功能融合蛋白，所述拮抗vegf片段包括轻链，所述轻链包括：a-1)氨基酸序列如seq id no.1所示的多肽片段；或，b-1)氨基酸序列与seq id no.1具有90％以上序列一致性且具有a-1)限定的多肽片段的功能的多肽片段。8.如权利要求1所述的双功能融合蛋白，其特征在于，所述双功能融合蛋白还包括连接肽片段；优选的，所述连接肽片段富含g、s和/或a；更优选的，所述连接肽片段包括氨基酸序列如seq id no.5所示的多肽片段。9.如权利要求1所述的双功能融合蛋白，其特征在于，所述双功能融合蛋白自n端至c端依次包括拮抗vegf片段、拮抗tgf-β片段。10.如权利要求1所述的双功能融合蛋白，其特征在于，所述双功能融合蛋白的氨基酸序列包括如seq id no.4所示的重链序列和如seq id no.1所示的轻链序列。11.一种分离的多核苷酸，编码如权利要求1～10任一权利要求所述的双功能融合蛋白。12.一种构建体，所述构建体含有如权利要求11所述的分离的多核苷酸。13.一种表达系统，所述表达系统含有如权利要求12所述的构建体或基因组中整合有外源的如权利要求8所述的多核苷酸。14.如权利要求1-10任一权利要求所述的双功能融合蛋白的制备方法，包括：在合适的条件下培养如权利要求13所述的表达系统，使之表达所述双功能融合蛋白，分离、纯化以提供所述双功能融合蛋白。15.如权利要求1-10任一权利要求所述的双功能融合蛋白在制备药物中的用途。
16.如权利要求15所述的用途，其特征在于，所述药物用于治疗与vegf和/或tgf-β表达相关疾病；优选地，所述疾病选自肿瘤、自身免疫性疾病和眼科疾病中的一种或几种。17.如权利要求15所述的用途，其特征在于，所述双功能融合蛋白与肿瘤治疗的其他手段联合使用，所述肿瘤治疗的其他手段包括手术、放疗、化疗、肿瘤免疫治疗。18.如权利要求17所述的用途，其特征在于，所述放疗的辐射类型包括x射线、γ射线和带电粒子；适用于所述化疗的药物选自：
①
细胞毒类药物：氮芥、卡莫司汀、环磷酰胺、白消安、洛莫司汀；
②
抗代谢类药：氟尿嘧啶、甲氨喋呤、阿糖胞苷、巯基嘌呤、替加氟；
③
抗生素类：放线菌素d、丝裂霉素、博菜霉素、阿毒素、平阳霉素、柔红霉素、光辉霉素；
④
生物碱类：长春新碱、长春碱、羟基树碱及鬼臼毒素类依托泊苷、替尼泊苷；
⑤
激素类，他莫昔芬、乙烯雌酚、黄体酮、丙酸睾丸酮、甲状腺素、泼尼松及地塞米松；
⑥
其它：甲基苄肼、羟基脲、l-门冬酰胺酶、顺铂、卡铂、抗癌锑、三嗪咪唑胺中的一种或几种；所述肿瘤免疫治疗选自免疫调节剂、过继性细胞转移疗法、肿瘤特异性疫苗、小分子免疫药物中的一种或几种；其中，所述免疫调节剂选自共刺激分子的激活剂、免疫检查点抑制剂、免疫检查点激活剂中的一种或几种；所述共刺激分子的激动剂选自ox40、cd2、cd27、cds、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)、4-1bb(cd137)、gitr、cd30、cd40、baffr、hvem、cd7、light、nkg2c、slamf7、nkp80、cd160、b7-h3或cd83配体的激动剂中的一种或几种；所述免疫检查点抑制剂选自pd-1、pd-l1、pd-l2、pd-l3、ctla4、tim-3、lag3、ceacam-1、ceacam-3、ceacam-5、vista、vsir、btla、tigit、lair1、lmtk3、tight、ido、cd27l、cd40、cd47、cd137、cd160、cd244、cd270、gitr、b7-h1、b7-1、2b4和/或tgf-βr的抑制剂中的一种或几种；其中，所述过继性细胞转移疗法选自肿瘤浸润淋巴细胞治疗、工程t细胞受体治疗、嵌合抗原受体t细胞疗法和自然杀伤细胞疗法中的一种或几种；其中，所述肿瘤特异性疫苗选自肿瘤全细胞疫苗、树突细胞疫苗、基因疫苗、rna疫苗和蛋白多肽疫苗中的一种或几种。19.一种药物组合物，包括如权利要求1-10任一权利要求所述的双功能融合蛋白或如权利要求13所述的表达系统或如权利要求13所述的表达系统的培养物。

技术总结
本发明涉及生物技术领域，公开了一种双功能融合蛋白及其制备方法和应用。所述双功能融合蛋白包括拮抗VEGF片段和拮抗TGF-β片段，所述拮抗VEGF片段包括SEQ ID No.1和2或与之具有90%以上序列一致性的多肽片段，拮抗TGF-β片段包括SEQ ID No.3或与之具有90%以上序列一致性的多肽片段。本发明还提供了所述双功能融合蛋白的制备方法，以及其在制备治疗与VEGF和/或TGF-β表达相关疾病的药物中的用途。本发明提供的双功能融合蛋白在纯化过程中不易出现断裂，具有良好的稳定性；同时，在生产过程中能够提高纯化效率，降低生产成本，具有广泛的应用前景和良好的商业化价值。的应用前景和良好的商业化价值。


技术研发人员：王辛中 许必雄 周丽波
受保护的技术使用者：赋生康（上海）生物科技有限公司
技术研发日：2023.01.06
技术公布日：2023/8/1