一种十五味赛尔斗丸中5种药效成分的含量测定方法

1.本发明涉及药物检测分析领域，具体涉一种十五味赛尔斗丸中5种药效成分的含量测定方法。


背景技术：

2.十五味赛尔斗丸，藏医清肝热，舒胆排石退黄的传统制剂，用于治疗肝胆热症、胆囊炎、胆石症和胆总管结石。在少数民族地区被广泛应用于临床中，主要是与头孢美唑、加替沙星等联合应用，用于胆囊炎、胆结石的治疗。
3.十五味赛尔斗丸的质量标准、基础研究较少，目前唯一的现行质量标准为国家食品药品监督管理局国家药品标准，标准编号：ws-10738(zd-0738)-2002，其中多味药材未进行检查，含量也仅控制了小檗碱的含量。由于其质量标准、基础研究的不足，导致临床应用局限。


技术实现要素：

4.为解决上述问题，本发明提供了一种十五味赛尔斗丸中5种药效成分的含量测定方法，它包括如下步骤：
5.a、对照品溶液的制备：取没食子酸、木兰花碱、芒果苷、鞣花酸和/或盐酸小檗碱对照品，加甲醇溶解，即得；
6.b、供试品溶液的制备：取十五味赛尔斗丸粉末，加甲醇溶液提取，滤过，取滤液，即得；
7.c、分别吸取对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪；色谱条件如下：
8.色谱柱：以亲水性十八烷基硅烷键硅胶为填充剂；以0.1％磷酸溶液为流动相a，以乙腈为流动相b，梯度洗脱程序为：
[0009][0010]
d、按外标法计算各成分的含量。
[0011]
进一步地，步骤a所述对照品溶液每1ml含没食子酸10～30μg、木兰花碱20～50μg、芒果苷1～10μg、鞣花酸10～30μg、盐酸小檗碱5～25μg。
[0012]
进一步地，步骤b所述十五味赛尔斗丸与甲醇溶液的质量体积比为0.2～2g：50ml。
[0013]
更进一步地，所述甲醇溶液的浓度为75％，ml/ml。
[0014]
进一步地，步骤b所述提取为超声提取，超声提取的功率比99％，频率45khz，时间45～60min。
[0015]
进一步地，步骤c所述色谱条件中色谱柱为swell c18，5μm，4.6
×
250mm，流速0.6～1.0ml/min，进样量2～16μl，柱温25～35℃，波长254+5nm。
[0016]
更进一步地，所述色谱条件中流速0.8ml/min，柱温30℃，波长254nm。
[0017]
本发明十五味赛尔斗丸中5种药效成分的含量测定方法，可以同时定量检测十五味赛尔斗丸中没食子酸、木兰花碱、芒果苷、鞣花酸、盐酸小檗碱，结果准确，快速、灵敏度高，为十五味赛尔斗丸的质量控制提供了新方法，也为十五味赛尔斗丸的质量控制标准的提高提供了方法依据，同时为扩大十五味赛尔斗丸的临床应用提供了参考依据，具有良好的应用前景。
[0018]
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0019]
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
[0020]
图1不同流动相下供试品溶液的hplc图谱(a.乙腈-0.1％磷酸；b.乙腈-0.2％磷酸；c.乙腈-0.3％磷酸；d.乙腈-0.4％磷酸；e.甲醇-0.1％磷酸；1.没食子酸；2.木兰花碱；3.芒果苷；4.鞣花酸；5.盐酸小檗碱)
[0021]
图2不同温度下供试品溶液的hplc图谱(a.25℃；b.30℃；c.35℃；1.没食子酸；2.木兰花碱；3.芒果苷；4.鞣花酸；5.盐酸小檗碱)
[0022]
图3不同流速下供试品溶液的hplc图谱(a.0.6ml/min；b.0.8ml/min；c.1.0ml/min；1.没食子酸；2.木兰花碱；3.芒果苷；4.鞣花酸；5.盐酸小檗碱)
[0023]
图4hplc图谱(a.混合对照品溶液；b.供试品溶液；c.缺诃子阴性供试品溶液；d.缺石榴子阴性供试品溶液；e.缺诃子与石榴子阴性供试品溶液；f.缺小檗皮阴性供试品溶液；g.缺印度獐牙菜阴性供试品溶液；h.空白溶液；1.没食子酸；2.木兰花碱；3.芒果苷；4.鞣花酸；5.盐酸小檗碱)
[0024]
图5各成分的标准曲线
具体实施方式
[0025]
实施例1、十五味赛尔斗丸中5种药效成分的含量测定
[0026]
(1)供试品溶液制备
[0027]
取十五味赛尔斗丸粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇溶液50ml，超声处理(功率比99％，频率45khz)45min，放冷，滤过，取续滤液过0.22μm微孔滤膜，即得；
[0028]
(2)对照品溶液的制备
[0029]
精密称取没食子酸对照品13.66mg、木兰花碱对照品7.51mg、芒果苷对照品6.42mg、鞣花酸对照品5.07mg、盐酸小檗碱对照品8.67mg，分别加甲醇定容于10ml容量瓶中，得到对照品储备液；分别精密吸取上述已制的对照品储备液各适量于同一容量瓶中并用甲醇稀释定容至刻度，得到没食子酸、木兰花碱、芒果苷、鞣花酸、盐酸小檗碱混合对照品
溶液，质量浓度分别为27.32、45.06、6.42、20.28、17.34μg/ml；
[0030]
(3)分别吸取10μl对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪；色谱条件如下：
[0031]
色谱柱：swellc18色谱柱(5μm，4.6
×
250mm)；柱温：30℃；流速：0.8ml/min；检测波长：254nm；流动相：乙腈(b)-0.1％磷酸溶液(a)，梯度洗脱程序为：
[0032][0033]
(4)按外标法计算各成分的含量。
[0034]
以下通过试验例来说明本发明的有益效果。
[0035]
1、仪器
[0036]
表1仪器
[0037][0038][0039]
2十五味赛尔斗丸
[0040]
十五味赛尔斗丸，规格为0.5g/丸，由青海久美藏药药业有限公司提供，批号见下表。十五味赛尔斗丸的十五味药材也均由青海久美藏药药业有限公司提供。
[0041]
表2十一批十五味赛尔斗丸药品
[0042][0043]
3对照品
[0044]
表3对照品
[0045][0046][0047]
4试剂及材料
[0048]
实验所用水为超纯水。
[0049]
表4试剂
[0050][0051]
试验例1十五味赛尔斗丸5种化学成分质量控制研究
[0052]
1 色谱条件考察
[0053]
1.1 测定波长考察
[0054]
确定进行含量控制的化学成分为芒果苷、盐酸小檗碱、木兰花碱、没食子酸和鞣花
酸，前期试验确定，没食子酸、木兰花碱、芒果苷、鞣花酸和盐酸小檗碱的吸收波长最小为210nm，最大可达到366nm，根据各化学成分在含量控制时较常应用的吸收波长，设定了4个波长进行考察:210nm、254nm、270nm、345nm。分别记录4个波长下各药物成分的峰面积，根据峰面积以及各成分的分离度等进行综合考虑，最后选择254nm作为最佳测定波长。
[0055]
表5不同波长考察结果
[0056][0057]
1.2流动相考察
[0058]
对流动相进行考察时，比较了乙腈-0.1％磷酸水溶液、乙腈-0.2％磷酸水溶液、乙腈-0.3％磷酸水溶液、乙腈-0.4％磷酸水溶液以及甲醇-0.1％磷酸水溶液，结果见图1和表6，发现流动相为乙腈-0.1％磷酸水溶液时，各成分色谱峰分离度较好，峰形对称，各成分峰满足hplc含量测定的要求，所以最终选择乙腈-0.1％磷酸水溶液作为含量测定的流动相。
[0059]
表6流动相考察结果
[0060][0061]
1.3柱温考察
[0062]
在对柱温进行选择时，考察了分别在25℃、30℃以及35℃柱温条件下十五味赛尔斗丸中没食子酸、木兰花碱、芒果苷、鞣花酸及盐酸小檗碱色谱峰的分离情况，结果如图2和表7所示。结果表明，在30℃下，上述药物成分的色谱峰分离度较好，满足hplc含量测定的要求，故最终选择的柱温为30℃。
[0063]
表7柱温考察结果
[0064]
[0065]
1.4流速考察
[0066]
考察了分别在0.6ml/min、0.8ml/min以及1.0ml/min流速条件下十五味赛尔斗丸中没食子酸、木兰花碱、芒果苷、鞣花酸及盐酸小檗碱色谱峰的分离情况，结果如图3和表8所示。结果表明，在0.8ml/min流速下，上述药物成分的色谱峰分离度较好，满足hplc含量测定的要求，故最终选择的流速为0.8ml/min。
[0067]
表8流速考察结果
[0068][0069]
1.5色谱条件确定
[0070]
根据上述结果，确定十五位赛尔斗丸5种化学成分质量控制的最佳色谱条件为：色谱柱：swellc18色谱柱(5μm，4.6
×
250mm)；柱温：30℃；流速：0.8ml/min；检测波长：254nm；流动相：乙腈-0.1％磷酸溶液，洗脱序列见表9。
[0071]
表9梯度洗脱时间表
[0072][0073]
2供试品溶液制备方法考察
[0074]
2.1提取溶媒考察
[0075]
取十五味赛尔斗丸粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，在各锥形瓶中精密加入不同溶剂50ml，超声处理30min，放冷，滤过，取续滤液过0.22μm微孔滤膜，即得供试品溶液。在上述所得色谱条件下，分别精密吸取各供试品溶液10μl，注入液相色谱，进行比较，记录各供试品色谱峰面积，结果见表10。
[0076]
表10提取溶媒考察结果
[0077]
[0078][0079]
根据表中的结果，可以看出，水提取的没食子酸含量最高，甲醇提取的鞣花酸和盐酸小檗碱含量最高，50％甲醇提取的木兰花碱、芒果苷含量最高，但结合整个色谱峰面积以及杂质峰和各成分分离度的情况来看，70％甲醇作为提取溶媒，提取效果较佳，故选择70％甲醇作为十五味赛尔斗丸5种化学成分质量控制研究供试品溶液制备的提取溶媒。
[0080]
2.2提取方法考察
[0081]
取十五味赛尔斗丸粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，在各锥形瓶中精密加入70％甲醇溶液50ml，分别以不同方法提取处理，放冷，滤过，取续滤液过0.22μm微孔滤膜，即得供试品溶液。在上述所得色谱条件下，分别精密吸取各供试品溶液10μl，注入液相色谱，进行比较，记录各供试品色谱峰面积，结果见表11。
[0082]
表11提取方法考察结果
[0083][0084]
比较了冷浸12h、超声45min以及水浴回流1h三种提取方法的实验结果，可以发现，冷浸12h提取方法中各成分含量均偏小，水浴回流1h对鞣花酸的提取效率最高，其他成分的提取效率与超声45min相比相差不大，且水浴回流提取杂质峰较多，综合考虑操作、时间以及分离度等问题，最终选择超声提取作为含量控制的提取方法。
[0085]
2.3提取时间考察
[0086]
取十五味赛尔斗丸粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，在各锥形瓶中精密加入70％甲醇溶液50ml，分别超声处理15min、30min、45min以及60min，放冷，滤过，取续滤液过0.22μm微孔滤膜，即得供试品溶液。在上述所得色谱条件下，分别精密吸取各供试品溶液10μl，注入液相色谱，进行比较，记录各供试品色谱峰面积，结果见表12。
[0087]
表12提取时间考察结果
[0088][0089]
结果表明，当提取时间为45min时，提取基本完全，超声60min时提取效率反而降低，故确定提取时间为45min。
[0090]
2.4供试品溶液制备方法
[0091]
综合上述考察结果，最终确定十五味赛尔斗丸供试品溶液的制备方法为：取十五味赛尔斗丸粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇溶液50ml，超声处理(功率比99％，频率45khz)45min，放冷，滤过，取续滤液过0.22μm微孔滤膜，即得供试品溶液。
[0092]
3对照品溶液的制备
[0093]
精密称取没食子酸对照品13.66mg、木兰花碱对照品7.51mg、芒果苷对照品6.42mg、鞣花酸对照品5.07mg、盐酸小檗碱对照品8.67mg，分别加甲醇定容于10ml容量瓶中，得到对照品储备液；分别精密吸取上述已制的对照品储备液各适量于同一容量瓶中并用甲醇稀释定容至刻度，得到没食子酸、木兰花碱、芒果苷、鞣花酸、盐酸小檗碱混合对照品溶液，质量浓度分别为27.32、45.06、6.42、20.28、17.34μg/ml。
[0094]
4阴性对照溶液的制备
[0095]
按照十五味赛尔斗丸处方比例分别称取各味药材，按“2.4”项下方法制备得到缺诃子、小檗皮、印度獐牙菜、石榴子以及同时缺诃子与石榴子的阴性对照溶液。
[0096]
5系统适应性试验
[0097]
按照上述色谱条件，分别进样混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液和空白溶液，结果如图4。在下面色谱图中，十五味赛尔斗丸中5个成分分离度均大于1.5，同时空白溶液对此无干扰，符合hplc含量测定的要求。
[0098]
6方法学考察
[0099]
6.1线性关系考察
[0100]
取“3”项下混合对照品溶液，照“1.5”项下液相色谱条件，分别进样2、4、6、8、10、12、14、16μl，测定其峰面积，以进样量为横坐标、峰面积为纵坐标，进行线性回归，得到各成分的标准曲线方程，具体见表13和图5。
[0101]
表13线性范围与标准曲线方程
[0102][0103]
结果显示，没食子酸在0.05464～0.43712μg范围内，木兰花碱在0.09012～0.72096μg范围内，芒果苷在0.01264～0.10272μg范围内，鞣花酸在0.04056～0.32448μg范围内，盐酸小檗碱在0.03468～0.27744μg范围内，峰面积与进样量线性关系良好。
[0104]
6.2精密度试验
[0105]
精密吸取“3”项下混合对照品溶液10μl，照“1.5”项下液相色谱条件，于一日内连续进样6次，记录各成分峰的峰面积，见表14，结果没食子酸、木兰花碱、芒果苷、鞣花酸及盐酸小檗碱成分峰峰面积的rsd值分别为0.32％、1.00％、0.29％、0.15％、0.17％，均小于4.00％，表明仪器日内精密度良好。
[0106]
表14日内精密度试验结果
[0107][0108]
另外同时将该混合对照品溶液连续测定3天，每天照“1.5”项下液相色谱条件进样2次，记录各成分峰的峰面积，见表15，结果没食子酸、木兰花碱、芒果苷、鞣花酸及盐酸小檗碱成分峰峰面积的rsd值分别为0.28％、3.80％、0.21％、0.23％、0.39％，均小于4.00％，表明仪器日间精密度良好。
[0109]
表15日间精密度试验结果
[0110][0111]
6.3重复性试验
[0112]
取十五位赛尔斗丸批次十粉末约0.5g，共6份，精密称定，照“2.4”项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按“1.5”项下液相色谱条件进样，测定峰面积，记录峰面积并计
算其rsd值。结果见表16，没食子酸、木兰花碱、芒果苷、鞣花酸及盐酸小檗碱的rsd值分别为1.03％、1.18％、0.35％、0.41％、0.30％，rsd值均小于3％，表明方法重复性良好。
[0113]
表16重复性试验结果
[0114][0115]
6.4稳定性试验
[0116]
取十五位赛尔斗丸批次十粉末约0.5g，精密称定，照“2.4”项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液，分别精密吸取该供试品溶液10μl，按“1.5”项下液相色谱条件于0、2、4、8、12、24h进样，测定峰面积，记录峰面积并计算其rsd值。结果见表17，没食子酸、木兰花碱、芒果苷、鞣花酸及盐酸小檗碱的rsd值分别为1.01％、1.24％、0.37％、0.78％、1.51％，rsd值均小于3％，表明供试品溶液24h内稳定性较好。
[0117]
表17稳定性试验结果
[0118][0119]
6.5加样回收率试验
[0120]
取同一批十五味赛尔斗丸粉末6份，每份约0.25g，精密称定，按已知含量的100％水平加入没食子酸、木兰花碱、芒果苷、鞣花酸及盐酸小檗碱对照品，再按照“2.4”项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液，进样测定，记录峰面积，计算含量和加样回收率。加样回收率(％)＝(测得量-样品含量)/加入量*100％。结果见表18，结果表明，没食子酸、木兰花碱、芒果苷、鞣花酸及盐酸小檗碱的加样回收率均在90％～110％之间，rsd《3％,说明此方法可靠性良好。
[0121]
表18加样回收率试验结果(n＝6)
[0122][0123][0124]
7样品含量测定
[0125]
分别称取各批次的十五味赛尔斗丸粉末约0.5g，共11批，每批平行3次，精密称定，
按“2.4”项下供试品溶液制备方法制备即得。精密吸取供试品溶液10μl，按照“1.5”项下液相色谱条件进样，记录各成分色谱峰面积，计算含量，取平均值，结果见表19。
[0126]
表19十五味赛尔斗丸含量测定
[0127][0128][0129]
8、小结
[0130]
本发明考察了不同的检测波长(210nm、254nm、270nm、345nm)、流动相(乙腈-0.1％磷酸水溶液、乙腈-0.2％磷酸水溶液、乙腈-0.3％磷酸水溶液、乙腈-0.4％磷酸水溶液、甲醇-0.1％磷酸水溶液)、柱温(25℃、30℃、35℃)、流速(0.6ml/min、0.8ml/min、1.0ml/min)，根据十五味赛尔斗丸中5个成分的峰型、峰面积、分离度以及杂质峰等确定了最佳色谱条件。对供试品溶液制备方法的考察中，考察了不同提取溶剂(水、乙醇、甲醇、50％甲醇、70％甲醇)、提取方法(冷浸12h、超声45min、水浴回流1h)、提取时间(15min、30min、45min、60min)，确定制备供试品溶液的最佳方法。
[0131]
本发明对十五味赛尔斗丸中5个成分进行定量分析，确定了没食子酸在0.05464～0.43712μg范围内，木兰花碱在0.09012～0.72096μg范围内，芒果苷在0.01264～0.10272μg范围内，鞣花酸在0.04056～0.32448μg范围内，盐酸小檗碱在0.03468～0.27744μg范围内，峰面积与进样量线性关系良好。精密度、重复性、稳定性、加样回收率的rsd值均符合要求，所建立的方法为十五味赛尔斗丸的质量标准的制定提供了依据。
[0132]
在含量测定的结果中，青海久美藏药药业有限公司生产的11个批次的十五味赛尔斗丸中没食子酸、木兰花碱、芒果苷、鞣花酸、盐酸小檗碱的平均含量分别为2.91mg/g、3.62mg/g、0.61mg/g、1.14mg/g、1.15mg/g。其中没食子酸与鞣花酸这两种成分的含量差异较大，提示生产企业在制作药物制剂时，应严格控制原药材的质量，生产工艺标准化，从而保证药物制剂的均一性和稳定性。
[0133]
在各批次十五味赛尔斗丸样品中，没食子酸、木兰花碱、盐酸小檗碱含量较其他成
分比较高，这种情况除了是处方比例的原因外，还有可能与各种成分在提取溶媒中的溶解度有关。印度獐牙菜为君药，对肝胆疾病的治疗起着重要的作用。综合考虑，最终选择没食子酸、木兰花碱、芒果苷、盐酸小檗碱为含量测定指标成分。
[0134]
综上，本发明十五味赛尔斗丸中5种药效成分的含量测定方法，可同时定量检测十五味赛尔斗丸中没食子酸、木兰花碱、芒果苷、鞣花酸、盐酸小檗碱，结果准确，快速、灵敏度高，为十五味赛尔斗丸的质量控制提供了新方法，也为十五味赛尔斗丸的质量控制标准的提高提供了方法依据，同时为扩大十五味赛尔斗丸的临床应用提供了参考依据，具有良好的应用前景。

技术特征：
1.一种十五味赛尔斗丸中5种药效成分的含量测定方法，其特征在于：它包括如下步骤：a、对照品溶液的制备：取没食子酸、木兰花碱、芒果苷、鞣花酸和/或盐酸小檗碱对照品，加甲醇溶解，即得；b、供试品溶液的制备：取十五味赛尔斗丸粉末，加甲醇溶液提取，滤过，取滤液，即得；c、分别吸取对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪；色谱条件如下：色谱柱：以亲水性十八烷基硅烷键硅胶为填充剂；以0.1％磷酸溶液为流动相a，以乙腈为流动相b，梯度洗脱程序为：d、按外标法计算各成分的含量。2.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于：步骤a所述对照品溶液每1ml含没食子酸10～30μg、木兰花碱20～50μg、芒果苷1～10μg、鞣花酸10～30μg、盐酸小檗碱5～25μg。3.根据权利要求1所述含量测定方法，其特征在于：步骤b所述十五味赛尔斗丸与甲醇溶液的质量体积比为0.2～2g：50ml。4.根据权利要求3所述含量测定方法，其特征在于：所述甲醇溶液的浓度为75％，ml/ml。5.根据权利要求1所述含量测定方法，其特征在于：步骤b所述提取为超声提取，超声提取的功率比99％，频率45khz，时间45～60min。6.根据权利要求1所述含量测定方法，其特征在于：步骤c所述色谱条件中色谱柱为swellc18，5μm，4.6
×
250mm，流速0.6～1.0ml/min，进样量2～16μl，柱温25～35℃，波长254+5nm。7.根据权利要求6所述检测方法，其特征在于：所述色谱条件中流速0.8ml/min，柱温30℃，波长254nm。

技术总结
本发明公开了一种十五味赛尔斗丸中5种药效成分的含量测定方法，它包括如下步骤：a、对照品溶液的制备：取没食子酸、木兰花碱、芒果苷、鞣花酸和/或盐酸小檗碱对照品，加甲醇溶解，即得；b、供试品溶液的制备：取十五味赛尔斗丸粉末，加甲醇溶液提取，滤过，取滤液，即得；c、分别吸取对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪检测；d、按外标法计算各成分的含量。本发明可以同时定量检测十五味赛尔斗丸中没食子酸、木兰花碱、芒果苷、鞣花酸、盐酸小檗碱，结果准确，快速、灵敏度高，为十五味赛尔斗丸的质量控制提供了新方法。控制提供了新方法。控制提供了新方法。


技术研发人员：孟宪丽 赖先荣 久美彭措
受保护的技术使用者：成都中医药大学
技术研发日：2022.01.19
技术公布日：2023/8/1