稳定转甲状腺蛋白四聚体的视黄醇结合蛋白4的双特异性拮抗剂及其制备和在治疗常见年龄相关合并症中的用途

1.本技术要求于2020年7月20日提交的美国临时申请no.63/054,218的优先权，其内容在此通过引用并入本文。
2.在本技术中，括号中引用了某些出版物。这些出版物的完整引用可在紧靠权利要求之前找到。为了更充分地描述本发明所涉及的现有技术，这些出版物的全部内容通过引用并入本技术。


背景技术：

3.年龄相关黄斑变性(amd)是发达国家最常见的失明原因。细胞毒性脂褐素类视色素二聚体(bisretinoids)在视网膜中的年龄依赖性积累可能显著促进amd萎缩形式的发病。必需的维生素全反式视黄醇(维生素a，1)(图1)用作视黄酸(2)的(steinmetz，a.c.等，2001；clagett-dame，m.&deluca，h.f.2002；wolf，g.1984)，11-顺式-视黄醛(3)(kiser，p.d.等，2014；tsin，a.等，2018)，以及许多其它涉及多个细胞过程和全身许多关键生物学功能的关键类视黄醇的生物合成的前体。眼内类视色素二聚体的合成取决于全反式视黄醇(1)从血清流入视网膜。这种流入需要在血清中形成叔视黄醇结合蛋白4(rbp4)-转甲状腺蛋白(ttr)-视黄醇复合物。通过选择性拮抗剂降低rbp4和1的循环水平可以调节视觉周期，降低视网膜色素上皮(rpe)中细胞毒性类视色素二聚体形成的速率，并且在患有萎缩(干燥)年龄相关黄斑变性(amd)和眼底黄色斑点症(stargardt)的患者中阻止地图状萎缩(radu，r.a.等，2005；palczewski，k.2010；petrukhin，k.2013；petrukhin，k.2007)。取代1的竞争性rbp4拮抗剂阻止了结合型-视黄醇类结合蛋白4-甲状腺素运载蛋白(holo-rbp4-ttr)复合物的形成，从而通过快速肾清除诱导循环rbp4和1水平的降低。减少1流入rpe导致视网膜中细胞毒性类视色素二聚体积累的减少，这被认为是干性amd和眼底黄色斑点症病部分病理生理学的基础。(radu，r.a.等,2005；dobris，n.等,2013；racz，b.等,2018；young，r.w.1987；dorey，c.k.等,1989；holz，f.g.等,2001；holz，f.g.等,1999；holz，f.g.等,2007；schmitz-valckenberg,s.等,2009；finnemann，s.c.等,2002；suter，m.等,2000；sparrow，j.r.等,2003；sparrow，j.r.等,2012；delori，f.c.1995；weng，j.等,1999；sparrow，j.r.&cai，b.2001；bergmann，m.等,2004；sparrow，j.r.等,1999；de，s.&sakmar，t.p.2002；vives-bauza，c.等,2008；zhou，j.等,2006；radu，r.a.等,2011；ben-shabat，s.等,2002；rozanowska，m.等,1995；sparrow，j.r.等,2002；dontsov，a.e.等,2009)。该方法由芬瑞替尼(5)(图2)的概念验证数据支持，在临床前期abca4-/-基因敲除小鼠增强视网膜脂褐素生成模型中(radu，r.a.等，2005)和在干燥amd患者的延长ii期临床试验中(berni，r.&formelli，f.1992；adams，w.r.等，1995；mata，n.l.等，2013)进行了研究。发现非类视黄醇rbp4拮抗剂a1120(6)(motani，a.等，2009)可使啮齿类动物的循环rbp4血浆水平降低大于70％，并减少abca4-/-小鼠中视网膜类类视色素二聚体的积累。(dobris，n等，2013)。在急性和慢性给药研究中，选择性的和口服生物可利用的非类视黄醇rbp4拮抗剂7(cioffi，
c.l.等，2014)和bpn-14136(8)(cioffi，c.l.等，2015)显示出良好的药代动力学(pk)图谱和诱导的啮齿类动物血浆rbp4水平的剂量依赖性降低。化合物8还显著降低了血清rbp4水平，并且在非人灵长类动物中经口服给药后表现出优异的药代动力学-药效动力学(pk/pd)相关性(racz，b.等，2020)。在诱导最大血清rbp4减少的剂量下不改变视觉循环动力学的abca4-/-小鼠模型中，化合物8抑制脂褐素类视色素二聚体合成同时视网膜补体系统蛋白表达正常，(racz，b.等，2018)。
4.除了将1转运到靶组织外，rbp4还被鉴定为脂肪因子，并且流行病学的证据表明蛋白质的中度升高水平与2型糖尿病正相关(graham，t.e.等,2006；yang，q.等,2005)，肥胖症(aeberli，i.等，2007),胰岛素耐受性(kowalska，i.等，2008)，心血管疾病(ingelsson，e.等,2009；qi，q.等,2007；norsee，j.等,2012)和肝脂肪变性(lee，s.a.等,2016)。因此，循环rbp4血清水平的药理学降低也可以有望治疗大量代谢性疾病。最近报道rbp4拮抗剂10显著降低啮齿类动物血清rbp4水平(》80％)，降低脂肪组织中产生的循环rbp4的浓度，并在转基因adi-hrbp4肝脂肪变性小鼠模型中证实了其功效，提示其可于治疗非酒精性脂肪性肝病(nafld)(cioffi，c.l.等，2019)。
5.衍生自突变体(ttrm)或野生型(ttrwt)的淀粉样聚集体的沉积导致ttr淀粉样变性(attr)疾病，例如老年性系统性淀粉样变性(ssa)，外周多神经病(attr-pn)，和心肌病(attr-cm)(johnson，s.m.等,2005；foss，t.r.等,2005；falk，r.h.等,1997；brunjes，d.l.等,2016；ton，v.k.等,2014)。ttr四聚体中二聚体-二聚体界面的断裂是ttr四聚体解离过程中的第一步，导致了ttr误折叠。大约50％的血清ttr与结合型-视黄醇类结合蛋白4相关，并且建议形成叔结合型-视黄醇类结合蛋白4-甲状腺素运载蛋白复合物以稳定该部分的血清ttr四聚体，从而保护它们不被解离和误折叠(white，j.t.&kelly，j.w.2001；hyung，s.j.等，2010)。基于rbp4-ttr相互作用能够赋予四聚体ttr额外的稳定性的体外观察结果(white，j.t.&kelly，j.w.2001；hyung，s.j.等，2010)，似乎合理的是从由选择性rbp4拮抗剂诱导的rbp4-ttr-视黄醇复合物中释放ttr四聚体可导致四聚体不稳定及其向二聚体亚基的增强解离。然后，所得二聚体可进一步解离成可误折叠，聚集，低聚，并最终形成不溶性ttr淀粉样原纤维的单体(white，j.t.&kelly，j.w.2001；hyung，s.j.等，2010)。虽然选择性rbp4拮抗剂可以是大多数干amd患者的安全和有效的治疗，但是这类化合物对部分可能容易发生attr的amd患者可能潜在地是相反的指示。除了具有由淀粉样原ttr突变引起的稀有遗传形式的转甲状腺蛋白淀粉样变性的个体之外，选择性rbp4拮抗剂的使用在患有老年系统性淀粉样变性(ssa)的患者中可能不是最佳的，所述老年系统性淀粉样变性是与野生型ttr的误折叠和聚集相关的迟发性非遗传疾病。ssa影响约25％的80岁以上的患者(ruberg，f.l.&berk，j.l.2012；connors，l.h.等，2011；westermark，p.等，2003)，并且基于该疾病和干amd的高人群频率，预计这两种病症之间具有显著的共病态性。另外，选择性rbp4拮抗剂的使用在患有干amd的老年美国黑人患者中可能不是最佳的，所述干amd患者在ttr基因中携带相对高频率的前淀粉样蛋白v122i突变的机会增加(buxbaum，j.n.等,2017；alexander k.m.和falk，r.h.2016)。不希望两种病症之一的有效长期治疗用于另一种情况的患者是相反的作用，开发能够安全地用于attr并发症患者的干amd的最佳治疗是一个重要的目标。
6.attr病理生理学中的初始和速率限制步骤是ttr四聚体的顺序解离(johnson，s.m.等，2005；foss，t.r.等，2005)。尽管报道了甲状腺激素(4)(图1)结合稳定ttr四聚体
(sekijima，y.等，2003)，但是大部分循环中的ttr(高达90％)，包括与结合型-视黄醇类结合蛋白4复合物中的ttr，不与其天然配体结合(white，j.t.&kelly，2001)。目前治疗attr-cm的治疗方法包括ttr四聚体的小分子动力学稳定剂，在t4结合位点结合并增加四聚体解离的能量势垒(kerschen，p.&plante-bordeneuve，v.2016；almeida，m.r.等，2005；almeida，m.r.等，2004；johnson，s.m.等，2005；nencetti，s.&orlandini，e.2012；adams，d.等，2016)。迄今为止临床研究的两种口服生物可利用的动力学稳定剂包括fda批准的他法米迪(11)(图3)(coelho，t.等，2016；nencetti，s.等，2013；lamb，y.n.&deeks，e.d.2019；bulawa，c.e.等，2012)和ag10(12)(penchala，s.c.等，2013；miller，m.等，2018)。ttr稳定剂11目前被批准用于治疗家族性淀粉样多神经病(fap)和attr-cm患者,以及在iii期临床试验中12已证实在患有症状性慢性心力衰竭的attr-cm患者的ttr几乎完全稳定(judge，d.p.等，2019)。另外，重新调整用途的fda批准的非甾体抗炎药(nsaid)二氟尼柳(13)(berk，j.l等，2012)和邻苯二酚-o-甲基转移酶(comt)抑制剂托卡朋(14)(sant
′
anna，r.等，2016)是其他小分子的例子，其也显示出ttr四聚体动力学稳定活性，并且已经研究了其对抗attr-pn的临床功效。
7.本发明描述了一类新的非类视黄醇双特异性化合物，其能够表现出双重视黄醇结合蛋白4(rbp4)拮抗剂和转甲状腺素(ttr)四聚体动力学稳定活性，用于治疗干性老年黄斑变性(amd)和ttr淀粉样变性(attr)并发症。我们在下文中表明，这些化合物可以提供与降低循环rbp4水平相关的治疗益处，同时稳定从结合型-视黄醇类结合蛋白4-甲状腺素运载蛋白复合物中释放的未配体ttr四聚体，从而避免如图4所示淀粉样原纤维形成的潜在风险。此外，由能够对两个靶显示双重活性的单一双特异性分子组成的多药理学方法可能比对每个靶共同施用单一试剂具有优势。这样的优点包括改善患者的依从性，使复合物的pk最小化，并避免可能由多次药物摄取引起的潜在的药物-药物相互作用(rodrigues，d.a.2008)。
8.发明概述
9.本发明提供具有以下结构的化合物：
[0010][0011]
其中
[0012]
x为cr6或n；
[0013]
r1，r2，r3，r4和r6各自独立地为-h，-f，-cl，-br，-i，-no2，-cn，-cf3，-cf2h，-ocf3，-(烷基)，-(卤代烷基)，-(烯基)，-(炔基)，-(芳基)，-(杂芳基)，-(环烷基)，-(环烷基烷基)，-(杂烷基)，杂环，杂环烷基，-(烷基杂烷基)，-(烷基芳基)，-oh，oac，-o-(烷基)，-o-(烯基)，-o-(炔基)，-o-(芳基)，-o-(杂芳基)，-sh，-s-(烷基)，-s-(烯基)，-s-(炔基)，-s-(芳基)，-s-(杂芳基)，-nh2，-nh-(烷基)，-nh-(烯基)，-nh-(炔基)，-nh-(芳基)，-nh-(杂芳基)，-c(o)r7，-s(o)r7，so2r7，-nhso2r7，-oc(o)r7，-sc(o)r7，-nhc(o)r8或-nhc(s)r8,
[0014]
其中r7为h，-(烷基)，-oh，-o(烷基)，-nh2，-nh(烷基)或-n(烷基)2,
[0015]
其中r8为，-(烷基)，-o-(烷基)，-nh2，-nh(烷基)或-n(烷基)2；
[0016]
y为o，s，n，nh或键；
[0017]
z为o，s，n，nh，(ch2)o，或键；
[0018]
r5为h，oh，卤素，烷基,或r5是(ch2)
p
,且当y为n时，与y键合与z形成环；
[0019]
o和p独立地为0，1，2或3；
[0020]
m和n独立地为0，1，2，3或4；
[0021]
a，c和d各自独立地为n或cr9；
[0022]
r9为h，卤素，-oh，烷基，环烷基，环烷基烷基，-o-(烷基)，-s-(烷基)，-nh2，-nh(烷基)，-nh(烷基)2，-co2h，-co(o-烷基)；
[0023]
b和e为n，cr9,或cfg，其中b或e中的至少一个是cfg；
[0024]
f不存在或存在，当存在时为
[0025][0026]
g为h，取代或未取代的单环，双环，杂环，杂二环，芳基，杂芳基，烷基，环烷基，环烷
基烷基，co2h，coor
10
，oh，or
10
，nh2，nhr
10
，nr
10r11
，so2(烷基)，so2(环烷基)，so2(环烷基烷基)，ch2nhr
10
，ch2nr
10r11
或ch2coor
10
,
[0027]
其中每个r
io
和r
11
各自独立地为h，烷基，环烷基，-c(o)-烷基，-c(o)-环烷基，-c(o)oh，-c(o)-o-烷基，-c(o)-o-环烷基，-c(o)nh2，-c(o)nh(烷基)，-c(o)nh(环烷基)，-c(o)n(烷基)2，-ch2nh(烷基)-ch2cooh，-so2ch3，-oh，-o(烷基)，-nh2，-nh(烷基)，-n(烷基)2,
[0028]
或其药学上可接受的盐。
附图说明
[0029]
图1.全反式视黄醇(维生素a)(1)，视黄酸(2)(涉及形态发生的重要视黄醇)，11-顺式-视黄醛(3)(光转导所需的关键视黄醇)和甲状腺激素甲状腺素(t4)(4)。图2.前面报道的rbp4拮抗剂的例子包含芬瑞替尼(5)，a1120(6)，非视黄醇[3.3.0]-八氢环戊并[c]吡咯并rbp4拮抗剂7，bpn-14136(8)，[3.3.0]-八氢环戊[c]吡咯并rbp4拮抗剂9和[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶10。图3.已报道的小分子ttr四聚体动力学稳定剂的例子，包括他法米迪(tafamidis)(11)，ag1o(12)，二氟尼柳(13)和托卡朋(14)。
[0030]
图4.用于治疗具有潜在attr合并症的rbp4适应症的双特异性rbp4拮抗剂和ttr四聚体动力学稳定剂。(a)图解说明了选择性rbp4拮抗剂用于破坏结合型-视黄醇类结合蛋白4-甲状腺素运载蛋白-蛋白相互作用和诱导血清减少1和rbp4的用途。未配体ttr的伴随释放可诱导其聚集，潜在地有助于在易感患者中的attr。(b)具有双重rbp4拮抗剂和ttr四聚体动力学稳定活性的双特异性配体可诱导rbp4和1的循环水平降低，同时还可防止潜在的ttr聚集和不溶性淀粉样原纤维的形成。
[0031]
图5.(
±
)-44在小鼠中的药代动力学和药效学性质。(a)单次25mg/kg口服(
±
)-44后血清rbp4水平。(b)单次口服5mg/kg剂量(
±
)-44后的血液化合物水平。数据以平均值
±
sd表示。每个治疗组使用三只小鼠进行研究。
[0032]
图6.类似物(
±
)-44在酸诱导的聚集试验中减少了高分子量ttr的形成，(a)通过使用乙酸缓冲液(ph 4.0)聚集ttr蛋白(5μg)，并在37℃培养72小时。在50μm氯苯唑酸，50μm苯溴马隆和50μm(
±
)-44的存在下培养后，将样品交联并进行sds-page，随后用ttr抗体进行蛋白质印迹。给出了至少三个独立实验的代表性印迹。(b，c)条形图表示ttr高分子量聚集体(b)和单体(c)的像素体积。纵轴表示免疫印迹上扫描条带任意单位的像素体积平均值
±
s.d.的比率。通过单因素方差分析和holm-sidak事后检验确定统计显著性；
*
，p《0.05；
**
，p《0.01；
***
，p《0.001；
****
，p《0.0001与ttr聚集(ph 4.0)+dmso组比较，
#
，p≤0.05；
##
，p≤0.01；
###
，p≤0.001；
####
，p≤0.0001与没有聚集(ph 7.5)的ttr组相比。
[0033]
图7.abca-/-小鼠长期口服(
±
)-44对血清rbp4水平的影响.在指定的时间点测量赋形剂治疗小鼠的abca-/-小鼠(正方形)和(
±
)-44治疗的abca4-/-鼠(三角形)的血清rbp4水平。与基线相比，在第12周，在(
±
)-44治疗组中观察到统计学rbp4显著减少79％(sidak事后检验的双向方差分析，p《0.0001)。误差条显示s.d。图表上的每个数据点表示来自单个动物的血清rbp4浓度。
[0034]
图8.长期口服(
±
)-44对abca4-/-小鼠眼内脂褐素荧光团a2e水平的影响。给药12周后，从赋形剂治疗的野生型小鼠(圆形)、赋形剂治疗的abca4-/-敲除小鼠(方形)和(
±
)-44治疗的abca4-/-小鼠(三角形)的眼杯中提取类视色素二聚体，并通过hplc进行分析。与赋
形剂治疗的敲除对照组相比，(
±
)-44治疗的abca4-/-小鼠的a2e浓度显著降低50％；单向方差分析和holm-sidak事后检验，p《0.0001(
****
)。
[0035]
图9.长期口服(
±
)-44对abca4-/-/rdh8-/-小鼠对血清rbp4水平的影响。在指定的时间点测量赋形剂治疗的abca4-/-/rdh8-/-小鼠(正方形)和(
±
)-44治疗的abca4-/-/rdh8-/-小鼠(三角形)的血清rbp4水平。与基线相比，(
±
)-44治疗组在第10周rbp4统计学上显著减少了76％，(双向方差分析和sidak事后检验，p《0.01)。误差条显示s.d.。图上的每个数据点代表单个动物的血清rbp4浓度。
[0036]
图10.长期口服(
±
)-44给药对abca 4-/-/rdh8-/-小鼠眼内脂褐素荧光团a2e水平的影响。10周后从赋形剂治疗的野生型小鼠(圆形)、赋形剂治疗abca 4-/-/rdh8-/-敲除小鼠(方形)和(
±
)-44治疗的abca 4-/-/rdh8-/-小鼠的眼杯中提取类视色素二聚体(三角形)，并通过hplc分析。与赋形剂治疗的双敲除对照组相比，在(
±
)-44治疗的abca 4-/-/rdh8-/-小鼠中检测到a2e浓度显著降低77％；单向方差分析和holm-sidak事后检验，p《0.0001(
****
)。
[0037]
图11.(
±
)-44-治疗的rdh8-/-/abca 4-/-小鼠中的感光体保护。未治疗的rdh8-/-/abca4-/-小鼠视网膜中onl厚度的减少(正方形)与未治疗的野生型c57bl/6小鼠(圆形)相比,被(
±
)-44-治疗(三角形)部分相反。双向方差分析和sidak事后检验分析数据。
[0038]
图12.视网膜脂褐素的细胞毒性成分，类视色素二聚体a2e和异a2e的结构。
[0039]
图13.视网膜脂褐素的细胞毒性成分,类视色素二聚体酸atral di-pe(全经视网膜二聚磷脂酰乙醇胺)和a2-dhp-pe的结构。r1和r2是指各种脂肪酸组分。
[0040]
发明详述
[0041]
本发明提供具有以下结构的化合物：
[0042][0043]
其中
[0044]
x为cr6或n；
[0045]
r1，r2，r3，r4和r6各自独立地为-h，-f，-cl，-br，-i，-no2，-cn，-cf3，-cf2h，-ocf3，-(烷基)，-(卤代烷基)，-(烯基)，-(炔基)，-(芳基)，-(杂芳基)，-(环烷基)，-(环烷基烷基)，-(杂烷基)，杂环，杂环烷基，-(烷基杂烷基)，-(烷基芳基)，-oh，oac，-o-(烷基)，-o-(烯基)，-o-(炔基)，-o-(芳基)，-o-(杂芳基)，-sh，-s-(烷基)，-s-(烯基)，-s-(炔基)，-s-(芳基)，-s-(杂芳基)，-nh2，-nh-(烷基)，-nh-(烯基)，-nh-(炔基)，-nh-(芳基)，-nh-(杂芳
基)，-c(o)r7，-s(o)r7，so2r7，-nhso2r7，-0c(o)r7，-sc(0)r7，-nhc(o)r8或-nhc(s)r8,
[0046]
其中r7为h，-(烷基)，-oh，-o(烷基)，-nh2，-nh(烷基)或-n(烷基)2,
[0047]
其中r8为-(烷基)，-o-(烷基)，-nh2，-nh(烷基)或-n(烷基)2；
[0048]
y为o，s，n，nh或键；
[0049]
z为o，s，n，nh，(ch2)o，或键；
[0050]
r5为h，oh，卤素，烷基或r5为(ch2)
p
且当y为n时与y键合与z形成环；
[0051]
o和p独立地是0，1，2或3；
[0052]
m和n独立地为0，1，2，3或4；
[0053]
a，c和d各自独立地为n或cr9；
[0054]
r9为h，卤素，-oh，烷基，环烷基，环烷基烷基，-o-(烷基)，-s-(烷基)，-nh2，-nh(烷基)，-nh(烷基)2，-co2h，-co(o-烷基)；
[0055]
b和e为n，cr9或cfg，其中b或e中的至少一个为cfg；
[0056]
f不存在或存在，当存在时为
[0057][0058]
g为h，取代或未取代的单环，双环，杂环，杂二环，芳基，杂芳基，烷基，环烷基，环烷基烷基，co2h，coor
10
，oh，or
10
，nh2，nhr
10
，nr
10r11
，so2(烷基)，so2(环烷基)，so2(环烷基烷基)，ch2nhr
10
，ch2nr
10r11
或ch2coor
10
，
[0059]
其中每个r
io
和r
11
各自独立地为h，烷基，环烷基，-c(o)-烷基，-c(o)-环烷基，-c(o)oh，-c(o)-o-烷基，-c(o)-o-环烷基，-c(o)nh2，-c(o)nh(烷基)，-c(o)nh(环烷基)，-c(o)n(烷基
)2
，-ch2nh(烷基)，-ch2cooh，-so2ch3，-oh，-o(烷基)，-nh2，-nh(烷基)，-n(烷基)2，
[0060]
或其药学上可接受的盐。
[0061]
在一些实施例中，化合物中的m为1或2且n为0，1或2。
[0062]
在一些实施例中，化合物中的m为1且n为1。
[0063]
在一些实施例中，化合物中的y和z各自独立地为ch2，o，s或nh。
[0064]
在一些实施例中，化合物中的y为o且z为ch2。
[0065]
在一些实施例中，化合物中的a和b为n，c和d为cr9且e为cfg。
[0066]
在一些实施例中，化合物中的a，b，c和d为cr9且e为cfg。
[0067]
在一些实施例中，化合物中的a为n，b为cfg，c，d和e各自为cr9。
[0068]
在一些实施例中，化合物中的a为n，b，c和d各自为cr9且e是cfg。
[0069]
在一些实施例中，化合物中的a，c和d各自为cr9，b为n，且e为cfg。
[0070]
在一些实施例中，化合物中的x为cr6或n；
[0071]
r1，r2，r3，r4和r6各自独立地为h，叔丁基，环戊基，环己基，cf3，f，cl，cn或-och3。
[0072]
在一些实施例中，化合物中的r1或r4为cf3。
[0073]
在一些实施例中，化合物中的x为cr6[0074]
r1为cf3且r2，r3，r4和r6各自独立地为h，叔丁基，环戊基，环己
[0075]
基，cf3，f，cl，cn或-och3。
[0076]
在一些实施例中，化合物具有以下结构：
[0077][0078]
其中
[0079]
c为cr9；
[0080]
r9为h，卤素，-oh，烷基，环烷基，环烷基烷基，-o-(烷基)，-s-(烷基)，nh2，-nh(烷基)，-nh(烷基)2，-co2h，-co(o-烷基)；
[0081]
f为不存在或存在，当存在时为
[0082][0083]
g为h，取代或未取代的单环，双环，杂环，杂二环，芳基，杂芳基，烷基，环烷基，环烷基烷基，co2h，coor
10
，oh，or
10
，nh2，nhr
10
，nr
10r11
，so2(烷基)，so2(环烷基)，so2(环烷基烷基)，ch2nhr
10
，ch2nr
10r11
或ch2coor
10
，
[0084]
其中每个r
1o
和r
11
各自独立地为h，烷基，环烷基，-c(o)-烷基，-c(o)-环烷基，-c(o)oh，-c(o)-o-烷基，-c(o)-o-环烷基，-c(o)nh2，-c(o)nh(烷基)，-c(o)nh(环烷基)，-c(o)n(烷基)2，-ch2nh(烷基)，-ch2cooh，-so2ch3，-oh，-o(烷基)，-nh2，-nh(烷基)，-n(烷基)2，
[0085]
或其药学上可接受的盐。
[0086]
在一些实施例中，化合物中c为cr9且
[0087]
r9为h，烷基，-o(烷基)或-nh(烷基)
[0088]
在一些实施例中，化合物中r9为-烷基
[0089]
在一些实施例中，化合物具有以下结构：
[0090][0091]
其中
[0092]
f为取代或未取代的杂芳基，
[0093]
在一些实施例中，化合物中f具有以下结构：
[0094][0095]
其中r
12
为h，-(烷基)，-(烯基)，-(炔基)。
[0096]
在一些实施例中，化合物具有以下结构：
[0097][0098]
其中
[0099]
c为cr9；
[0100]
r9为h，卤素，-oh，烷基，环烷基，环烷基烷基，-o-(烷基)，-s-(烷基)，-nh2，-nh(烷基)，-nh(烷基)2，-co2h，-co(o-烷基)；
[0101]
f为不存在或存在，当存在时为
[0102][0103]
g为h，取代或未取代的单环，双环，杂环，杂二环，芳基，杂芳基，烷基，环烷基，环烷基烷基，co2h，coor
10
，oh，or
10
，nh2，nhr
10
，nr
10r11
，so2(烷基)，so2(环烷基)，so2(环烷基烷基)，ch2nhr
10
，ch2nr
10r11
或ch2coor
10
，其中每个r
1o
和r
11
各自独立地为h，烷基，环烷基，-c(o)-烷基，-c(o)-环烷基，-c(o)oh，-c(o)-o-烷基，-c(o)-o-环烷基，-c(o)nh2，-c(o)nh(烷基)，-c(o)nh(环烷基)，-c(o)n(烷基)2，-ch2nh(烷基)，-ch2cooh，-so2ch3，-oh，-o(烷基)，-nh2，-nh(烷基)，-n(烷基)2，
[0104]
或其药学上可接受的盐。
[0105]
在一些实施例中，化合物中c为cr9且
[0106]
r9为h，烷基，-o(烷基)或-nh(烷基)。
[0107]
在一些实施例中，化合物中r9为-烷基。
[0108]
在一些实施例中，具有以下结构的化合物：
[0109]
[0110]
[0111]
[0112][0113]
或该化合物药学上可接受的盐。
[0114]
在一些实施例中，化合物具有以下结构：
[0115][0116]
或该化合物的药学上可接受的盐。
[0117]
在一些实施例中，化合物具有以下结构：
[0118][0119]
或该化合物的药学上可接受的盐。
[0120]
在一些实施例中，化合物具有以下结构：
[0121][0122]
或该化合物的药学上可接受的盐。
[0123]
在一些实施例中，化合物具有以下结构：
[0124][0125]
或该化合物的药学上可接受的盐。
[0126]
在一些实施例中，具有以下结构的化合物：
[0127][0128]
或该化合物的药学上可接受的盐。
[0129]
本发明提供了包含本发明化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。
[0130]
本发明提供了一种稳定哺乳动物ttr四聚体的方法，该方法包括给予哺乳动物有效剂量的本发明化合物或本发明组合物，从而有效地稳定在哺乳动物中的ttr四聚体。
[0131]
本发明提供一种治疗以视网膜中脂褐素过度蓄积为特征的疾病，或ttr淀粉样变性(attr)疾病，或两者兼有以下特征的疾病的方法：在患有ttr淀粉样变性(attr)疾病的哺乳动物中过量的脂褐素和ttr淀粉样变性疾病，包括给予哺乳动物有效剂量的本发明的化合物或本发明的组合物。
[0132]
在所述方法的一些实施例中，其中所述疾病进一步以类视色素二聚体类视色素二聚体介导的黄斑变性为特征。
[0133]
在所述方法的一些实施例中，其中所述化合物的量可有效降低哺乳动物中rbp4的血清浓度，或者其中所述化合物的量可有效降低哺乳动物中脂褐质中类视色素二聚体的视网膜浓度。
[0134]
在所述方法的一些实施例中，其中化合物的量有效地稳定在哺乳动物中的ttr四聚体。
[0135]
在所述方法的一些实施例中，其中类视色素二聚体为a2e。
[0136]
在所述方法的一些实施例中，其中类视色素二聚体为异a2e。
[0137]
在所述方法的一些实施例中，其中类视色素二聚体为a2-dhp-pe。
[0138]
在所述方法的一些实施例中，其中所述类视色素二聚体为atral-di-pe。
[0139]
在所述方法的一些实施例中，其中以视网膜中过多脂褐素积聚为特征的疾病为年龄相关的黄斑变性。
[0140]
在所述方法的一些实施例中，其中以视网膜中过多脂褐素积聚为特征的疾病为干性(萎缩性)年龄相关的黄斑变性。
[0141]
在所述方法的一些实施例中，其中以视网膜中过多脂褐素积聚为特征的疾病为眼底黄色斑点症病。
[0142]
在所述方法的一些实施例中，其中以视网膜中过多脂褐素积聚为特征的疾病为best病。
[0143]
在所述方法的一些实施例中，其中以视网膜中过多脂褐素积聚为特征的疾病为成人卵黄状黄斑病。
[0144]
在所述方法的一些实施例中，其中以视网膜中过多脂褐素积聚为特征的疾病为眼底黄色斑点症样黄斑营养不良。
[0145]
在所述方法的一些实施例中，其中施用可有效减少感光体变性。
[0146]
在所述方法的一些实施例中，其中所述方法进一步有效地稳定哺乳动物中的ttr四聚体。
[0147]
在所述方法的一些实施例中，其中所述哺乳动物进一步患有ttr淀粉样变性(attr)疾病，所述方法对于治疗所述哺乳动物的ttr淀粉样变性(attr)疾病是有效的。
[0148]
在所述方法的一些实施例中，其中ttr淀粉样变性(attr)疾病为老年系统性淀粉样变性(ssa)。
[0149]
在所述方法的一些实施例中，其中ttr淀粉样变性(attr)疾病为周围多神经病(attr-pn)。
[0150]
在所述方法的一些实施例中，其中ttr淀粉样变性(attr)疾病为心肌病(attr-cm)。
[0151]
在所述方法的一些实施例中，其中ttr淀粉样变性(attr)疾病的特征为淀粉样聚集体的沉积。
[0152]
在一些实施例中，类视色素二聚体介导的黄斑变性为年龄相关的黄斑变性或眼底黄色斑点症病。
[0153]
在一些实施例中，类视色素二聚体介导的黄斑变性为年龄相关的黄斑变性。
[0154]
在一些实施例中，类视色素二聚体介导的黄斑变性为干性(萎缩性)年龄相关的黄斑变性。
[0155]
在一些实施例中，类视色素二聚体介导的黄斑变性为眼底黄色斑点症病。
[0156]
在一些实施例中，类视色素二聚体介导的黄斑变性为best病。
[0157]
在一些实施例中，类视色素二聚体介导的黄斑变性为成人卵黄样黄斑病。
[0158]
在一些实施例中，类视色素二聚体介导的黄斑变性为眼底黄色斑点症样黄斑营养不良。
[0159]
所述类视色素二聚体介导的黄斑变性可包括脂褐素沉积物在视网膜色素上皮中的积累。
[0160]
本文所用的“类视色素二聚体脂褐素”是含有细胞毒性类类视色素二聚体的脂褐素。细胞毒性类视色素二聚体包括但不限于a2e，异a2e，atral di-pe(全反式视网膜二聚体-磷脂酰乙醇胺)和a2-dhp-pe(a2-二氢吡啶-磷脂酰乙醇胺)(图7-8)。
[0161]
甲状腺素转运蛋白(ttr)淀粉样变性(attr)为一种神经变性疾病，包括但不限于老年性系统性淀粉样变性(ssa)，周围多发性神经病(attr-pn)或心肌病(attr-cm)。
[0162]
在一些实施例中，ttr淀粉样变性(attr)疾病的特征在于淀粉样聚集体的沉积。
[0163]
在一些实施例中，ttr淀粉样变性(attr)疾病的特征在于衍生自突变体(ttrm)或野生型(ttrwt)的淀粉样聚集体的沉积。
[0164]
在一些实施例中，ttr淀粉样变性(attr)疾病为老年系统性淀粉样变性(ssa)。
[0165]
在一些实施例中，ttr淀粉样变性(attr)疾病是周围多神经病(attr-pn)。
[0166]
在一些实施例中，ttr淀粉样变性(attr)疾病为心肌病(attr-cm)。
[0167]
在一些实施例中，本发明的化合物显示出双重视黄醇结合蛋白4(rbp4)拮抗剂和转甲状腺素(ttr)四聚体动力学稳定活性。
[0168]
在一些实施例中，本发明的化合物显示视黄醇结合蛋白4(rbp4)拮抗剂活性。
[0169]
在一些实施例中，本发明的化合物显示出转甲状腺蛋白(ttr)四聚体动力学稳定活性。
[0170]
在一些实施例中，本发明的化合物降低循环rbp4水平，同时稳定从结合型-视黄醇类结合蛋白4-甲状腺素运载蛋白复合物释放的未配体ttr四聚体。
[0171]
在一些实施例中，本发明的化合物降低循环视黄醇类结合蛋白水平。
[0172]
在一些实施例中，本发明的化合物稳定从结合型-视黄醇类结合蛋白4-甲状腺素运载蛋白复合物释放的未配体ttr四聚体。
[0173]
在一些实施例中，本发明的化合物或本发明的组合物可用于治疗与年龄相关的干性黄斑变性(amd)和ttr淀粉样变性(attr)并发症。
[0174]
在一些实施例中，本发明的化合物或本发明的组合物可用于治疗干性年龄相关性黄斑变性(amd)和老年性系统性淀粉样变性(ssa)。
[0175]
在一些实施例中，本发明的化合物或本发明的组合物可用于治疗干性年龄相关性黄斑变性(amd)和周围多神经病(attr-pn)。
[0176]
在一些实施例中，本发明的化合物或本发明的组合物可用于治疗与年龄相关的干性黄斑变性(amd)和心肌病(attr-cm)。
[0177]
在一些实施例中，本发明的化合物或本发明的组合物可用于治疗2型糖尿病。
[0178]
在一些实施例中，本发明的化合物或本发明的组合物可用于治疗肥胖症。
[0179]
在一些实施例中，本发明的化合物或本发明的组合物可用于治疗胰岛素抗性。
[0180]
在一些实施例中，本发明的化合物或本发明的组合物可用于治疗心血管疾病。
[0181]
在一些实施例中，本发明的化合物或本发明的组合物可用于治疗肝脂肪变性。
[0182]
在一些实施例中，本发明的化合物或本发明的组合物可用于治疗非酒精性脂肪肝病(nafld)。
[0183]
在一些实施例中，所述哺乳动物为人类。
[0184]
本领域技术人员可以使用本文公开的技术来制备其氘类似物。
[0185]
除非另有说明，本发明化合物的结构包括不对称碳原子，应当理解所述化合物以外消旋物，外消旋混合物，定标混合物和分离的单一对映体的形式存在。这些化合物的所有这些异构体形式明确地包括在本发明中。除非另有说明，每个立体碳可以为r或s构型。因此应当理解，除非另有说明，由这种不对称性产生的异构体(例如，所有对映异构体和非对映异构体)都包括在本发明的范围内。这些异构体可通过经典的分离技术和立体化学控制的合成以基本纯的形式获得，如在j.jacques，a.collet和s.wilen，john wiley&sons,ny,1981出版的“对映体，外消旋体和拆分”所述的。例如，在权利要求1中所述拆分可以通过制备色谱在手性柱上进行。
[0186]
除非另有说明，本发明旨在包括在本文公开的化合物上出现的所有原子同位素。同位素包括具有相同原子序数但不同质量数的那些原子。作为一般例子，但不限于，氢同位素包括氚和氘。碳的同位素包括c-13和c-14。
[0187]
应当注意，在整个本技术中结构中的碳的任何注释，当不用另外的注释时，都是用来表示碳的所有同位素，例如
12
c，
13
c，或
14
c。另外，任何含有下列物质的化合物
13
c或
14
c可以具体具有本文公开的任何化合物的结构。
[0188]
还将注意到，在整个本技术的结构中的氢(h)的任何注释，当在没有进一步注释的
情况下使用时，旨在表示氢的所有同位素，例如1h，2h(d)，或3h(t)。此外，除非另有说明，任何含有下列物质的化合物2h或3h可以具体具有本文公开的任何化合物的结构。
[0189]
同位素标记的化合物通常可通过本领域技术人员已知的常规技术，使用适当的同位素标记试剂代替所用的非标记试剂来制备。
[0190]
氘(2h或d)是稳定的非放射性同位素，其原子重量为2.0144。化合物中的氢原子天然地以1h(氢或质子)，d(2h或氘)，和t(3h或氚)同位素混合物的形式存在。氘的天然丰度为0.0156％。因此，在包含天然存在的化合物的分子的组合物中，该化合物中特定氢原子位点的氘含量预计为0.0156％。因此，包含在化合物中氢原子的任何位置具有氘水平其富集程度超过其0.0156％天然丰度的化合物的组合物比其天然存在的对应物更具新颖性。
[0191]
术语“取代”，“取代的”和“取代基”是指如上所述的官能团，其中与包含在其中的氢原子的一个或多个键被与非氢或非碳原子的键所取代，条件是保持正常的化合价并且该取代导致稳定的化合物。取代的基团还包括其中一个或多个键合到碳原子或氢原子被一个或多个键(包括双键或三键)取代到杂原子上。取代基的例子包括上述官能团和卤素(即f，cl，br和i)；烷基，例如甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，叔丁基和三氟甲基；羟基；烷氧基，例如甲氧基，乙氧基，正丙氧基和异丙氧基；芳氧基，例如苯氧基；芳基烷氧基，例如苄氧基(苯基甲氧基)和对三氟甲基苄氧基(4-三氟甲基苯基甲氧基)；杂芳氧基；磺酰基，例如三氟甲磺酰基，甲磺酰基和对甲苯磺酰基；硝基，亚硝酰基；巯基；硫烷基，例如甲硫基，乙硫基和丙硫基；氰基；氨基，例如氨基，甲氨基，二甲氨基，乙氨基和二乙氨基；和羧基。当公开或要求保护多个取代基部分时，取代的化合物可以被一个或多个所公开或要求保护的取代基部分单独或多个独立地取代。被独立取代是指(两个或更多个)取代基可以相同或不同。
[0192]
在用于本发明方法的化合物中，取代基可以是取代的或未取代的，除非另有具体定义。
[0193]
在用于本发明方法的化合物中，烷基，卤代烷基，链烯基，炔基，芳基，杂芳基，环烷基，环烷基烷基，杂烷基，杂环，杂环烷基，烷基杂烷基，烷基芳基，单环，双环，杂环和杂双环基团可以通过用交替的非氢基团取代一个或多个氢原子而被进一步取代。这些包括但不限于卤素，羟基，巯基，氨基，羧基，氰基和氨基甲酰基。
[0194]
应当理解，用于本发明方法中的化合物上的取代基和取代模式可由本领域普通技术人员选择，以提供化学稳定的化合物，并且该化合物可通过现有技术通过容易获得的初始原料合成。如果取代基本身被一个以上的基团取代，可以理解，只要得到稳定的结构，这些多个基团可以在相同的碳上或在不同的碳上。
[0195]
在选择用于本发明方法中的化合物时，本领域普通技术人员将认识到各种取代基，即r1，r2等是按照众所周知的化学结构连接原理选择的。
[0196]
本文所用的“烷基”包括具有特定碳原子数的支链和直链饱和脂族烃基，并且可以是未取代的或取代的。因此，如“c
1-cn烷基”中所述的c
1-cn为定义为包括具有1，2，...，n-1的基团或n个碳原子呈线性或支化排列。例如，如“c
1-c6烷基”中所述的c
1-c6定义为包括具有1，2，3，4，5或6个直链或支链排列的碳原子的基团，具体包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、戊基和己基。除非另有说明，否则含有1-10个碳。烷基可以是未取代的或被一个或多个取代基取代，所述取代基包括但不限于卤素、烷氧基、烷硫基、三氟甲基、二氟甲基、甲氧基和羟基。“卤代烷基”包括含有至少一个卤原子的任何烷基。
[0197]
术语“链烯基”是指含有至少1个碳-碳双键的直链或支链的非芳香族烃基，并且可以存在最大可能数量的非芳香族碳-碳双键。因此，c
2-cn烯基被定义为包括具有1，2，...，n-1或n个碳原子的基团。例如，“c
2-c6链烯基”是指分别具有2、3、4、5或6个碳原子且至少1个碳-碳双键的链烯基，且例如在c6链烯基的情况下最多3个碳碳双键。烯基包括乙烯基，丙烯基，丁烯基和环己烯基。如上文关于烷基所述，链烯基的直链，支链或环状部分可以含有双键，并且如果指示一个取代的链烯基，可以被取代。实施例可以是c
2-c
12
烯基或c
2-c8烯基。
[0198]
术语“炔基”是指含有至少1个碳-碳三键的直链或支链烃基，并且可以存在最大可能数量的非芳族碳-碳三键。因此，c
2-cn炔基被定义为包括具有1，2，...n-1或n个碳的基团。例如，“c
2-c
6”炔基是指具有2或3个碳原子和1个碳-碳三键，或具有4或5个碳原子和至多2个碳-碳三键，或具有6个碳原子和至多3个碳-碳三键的炔基。炔基包括乙炔基，丙炔基和丁炔基。如上所述，关于烷基，炔基的直链或支链部分可以含有三键，并且如果指示为取代的炔基，可以被取代。实施例可以是c
2-cn炔基。实施例可以是c
2-c
12
炔基或c
3-c8炔基。
[0199]
本文所用的“芳基”是指在每个环中具有至多10个原子的任何稳定的单环，双环或多环碳环，其中至少一个环是芳族的，并且可以是未取代的或取代的。这些芳基元素的例子包括但不限于：苯基，对甲苯基(4-甲基苯基)，萘基，四氢萘基，茚满基，菲基，蒽基或苊基。在芳基取代基是双环且一个环是非芳环的情况下，应当理解连接是通过芳环。
[0200]
本文所用术语“杂芳基”代表稳定的单环，每个环中最多10个原子的双环或多环,其中至少一个环是芳族的并含有1-4个选自o,n和s的杂原子。双环芳族杂芳基包括苯基，吡啶，嘧啶或哒嗪环，它们为(a)稠合到具有一个氮原子的6元芳族(不饱和)杂环上；(b)稠合到5-或6-元芳族(不饱和)杂环上具有两个氮原子的环；(c)稠合到具有一个氮原子和一个氧原子或一个硫原子的5元芳族(不饱和)杂环上；或(d)稠合到具有一个选自0，n或s的杂原子的5元芳族(不饱和)杂环上。该定义范围内的杂芳基包括但不限于：苯并咪唑基，苯并呋喃基，苯并呋喃唑基，苯并吡唑基，苯并三唑基，苯并噻吩基，苯并噁唑基，咔唑基，咔啉基，肉桂醇啉基，呋喃基，吲哚啉基，吲哚基，吲哚嗪基，吲唑基，异苯并呋喃基，异吲哚基，异喹啉基，异噻唑基，异噁唑基，萘并吡啶基，噁二唑基，噁唑基，噁唑啉，异噁唑啉，氧杂环丁烷基，吡喃基，吡嗪基，哒嗪基，吡啶基，哒嗪基，嘧啶基，1,4-二氧杂环丁烷，六氢氮杂基，二氢苯并咪唑基，二氢苯并呋喃基，二氢苯并噻吩基，二氢苯并噁唑基，二氢呋喃基，二氢咪唑基，二氢吲哚基，二氢异噁唑基，二氢异噻唑基，二氢噁二唑基，二氢噁唑基，二氢吡嗪基，二氢吡唑基，二氢吡啶基，二氢嘧啶基，二氢吡咯基，二氢喹啉基，二氢四唑基，二氢噻二唑基，二氢噻唑基，二氢噻吩基，二氢三唑基，二氢氮杂环丁烷基，亚甲二氧基苯甲酰基，四氢呋喃基，四氢噻吩基，吖啶基，咔唑基，肉桂酰基，喹喔啉基，吡唑基，吲哚基，苯并三唑基，苯苯并噻唑基，苯甲恶唑基，异恶唑基，异噻唑基，呋喃基，噻吩基，苯并噻吩基，苯并呋喃基，喹啉基，异喹啉基，恶唑基，异恶唑基，吲哚基，吡嗪基，哒嗪基，吡啶基，嘧啶基，吡咯基，四氢喹啉。在杂芳基取代基是双环且一个环是非芳族的或不含杂原子的情况下，应当理解连接分别是通过芳环或通过含杂原子的环。如果杂芳基含有氮原子，可以理解其相应的n-氧化物也包括在该定义中。
[0201]
本文所用的“环烷基”包括总碳原子数为3-8的烷烃的环，或该范围内的任意数量(即，环丙基，环丁基，环戊基，环己基，环庚基或环辛基)。“环烷基烷基”包括含有至少一个环烷基环的任何烷基。
[0202]
本文所用的“杂烷基”包括在链或支链内具有至少1个杂原子的支链和直链饱和脂族烃基。“烷基杂烷基”包括含有至少一个杂烷基的任何烷基。
[0203]
术语“杂环”，“杂环基”或“杂环”是指可以是饱和的或含有一个或多个不饱和度并含有一个或多个杂原子的单环或多环体系。优选的杂原子包括n，o和/或s，包括n-氧化物，硫氧化物和二氧化物。优选地，该环是3-10元环，并且是饱和的或具有一个或多个不饱和度。杂环可以是未取代的或取代的，允许有多个取代度。这样的环可任选地与一个或多个其它环稠合“杂环”环，杂芳基环，芳基环或环烷基环。杂环的例子包括但不限于四氢呋喃，吡喃，1，4-二恶烷，1，3-二恶烷，哌啶，哌嗪，吡咯烷，吗啉，硫代吗啉，四氢噻喃，四氢噻吩，1，3-氧硫杂环戊烷等。
[0204]
本文所用的“杂环烷基”是指含有1-4个选自o，n和s的杂原子的5-10元非芳环，并包括二环基团。因此，“杂环基”包括但不限于以下：咪唑基，哌嗪基，哌啶基，吡咯烷基，吗啉基，硫代吗啉基，四氢吡喃基，二氢哌啶基，四氢噻吩基等。如果杂环含有氮，可以理解其相应的n-氧化物也包括在该定义中。
[0205]
术语“烷基芳基”是指如上所述的烷基，其中与其中所含氢的一个或多个键被与上述芳基的键所取代。应当理解，“烷基芳基”基团通过来自烷基的键连接到核心分子上，并且芳基作为烷基上的取代基。芳基烷基部分的例子包括但不限于苄基(苯基甲基)，对三氟甲基苄基(4-三氟甲基苯基甲基)，1-苯基乙基，2-苯基乙基，3-苯基丙基，2-苯基丙基等。
[0206]
本文所用的“单环”包括最多10个原子的任何稳定的多环碳环，并且可以是未取代的或取代的。这种非芳族单环元素的例子包括但不限于：环丁基，环戊基，环己基和环庚基。这种芳族单环元素的例子包括但不限于：苯基。本文所用的“杂环”包括含有至少一个杂原子的任何单环。
[0207]
如本文所用，“双环”包括任何稳定的具有多达10个原子多环碳环，其稠合成每个环独立地未取代的或取代的多达10个原子的多环碳环。这种非芳族双环元素的例子包括但不限于：萘。本文所用的“杂双环”包括含有至少一个杂原子的任何双环。
[0208]
用于本发明方法中的化合物可以通过有机合成中众所周知的技术制备，并且对于本领域普通技术人员来说是熟悉的。然而，这些可能不是合成或获得所需化合物的唯一方法。
[0209]
用于本发明方法中的化合物可以通过vogel的实用有机化学课本a.i.vogel，a.r.tatchell，b.s.furnis,a.j.hannaford,p.w.g.smith(prentice hall)第5版(1996))。march
′
s高等有机化学：反应、机理和结构，michael b.smith,jerry march,(wiley-interscience)第5版(2007)和其中的参考文献中所述的技术制备，其通过引用并入本文。但是，这些可能不是合成或获得所需化合物的唯一方法。
[0210]
本文公开的化合物的芳环上连接的各种r基团可以通过标准方法加入到环中，例如在高等有机化学：b部分：反应和合成，francis carey和richard sundberg，(springer)第5版(2007)中阐述的那些。其内容在此引入作为参考。
[0211]
本发明另一方面包括作为药物组合物的本发明的化合物或组合物。
[0212]
本文所用术语“药物活性剂”是指任何适合给予受试者的物质或化合物，并在疾病的治疗，治愈，缓解，诊断或预防中提供生物活性或其它直接作用，或影响受试者的结构或任何功能。药学活性剂包括但不限于，在医生案头参考(pdr network，llc；第64版；2009年
11月15日)和“批准的具有治疗等效性评价的药物产品”(美国卫生与公众服务部，第30版本，2010)中描述的物质和化合物，在此引入作为参考。具有羧酸侧基的药物活性剂可以根据本发明使用化学合成领域普通技术人员容易获得和已知的标准酯化反应和方法进行修改。在药物活性剂不具有羧酸基团的情况下，本领域普通技术人员能够设计羧酸基团并将其结合到药物活性剂中，只要所述改进不干扰所述药物活性剂的生物活性或作用，则随后可以进行酯化。
[0213]
用于本发明方法中的化合物可以是盐形式。本文所用的“盐”是本发明化合物的盐，其通过制备化合物的酸或碱盐而被改性。在用于治疗疾病或医学病症的化合物的情况下，该盐是药学上可接受的。药学上可接受的盐的例子包括但不限于碱性残基如胺的无机酸或有机酸盐；酸性残基如酚的碱性或有机盐；酸性残基如羧酸的碱性或有机盐。所述盐可使用有机酸或无机酸制备。这样的酸式盐为氯化物，溴化物，硫酸盐，硝酸盐，磷酸盐，磺酸盐，甲酸盐，酒石酸盐，马来酸盐，苹果酸盐，柠檬酸盐，苯甲酸盐，水杨酸盐，抗坏血酸盐等。酚盐是钠盐，钾盐或锂盐等。羧酸盐为钠盐，钾盐或锂盐等。在这方面，术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的相对无毒，无机酸和有机酸或碱的加成盐。这些盐可以在本发明化合物的最终分离和纯化过程中就地制备，或使游离碱或游离酸形式的本发明纯化的化合物分别与合适的有机酸或无机酸或碱反应，并分离而形成的盐。代表性的盐包括氢溴酸盐，盐酸盐，硫酸盐，硫酸氢盐，磷酸盐，硝酸盐，乙酸盐，戊酸盐，油酸盐，棕榈酸盐，硬脂酸盐，月桂酸盐，苯甲酸盐，乳酸盐，磷酸盐，甲苯磺酸盐，柠檬酸盐，马来酸盐，富马酸盐，琥珀酸盐，酒石酸盐，萘甲酸盐，甲磺酸盐，葡萄糖庚酸盐，乳糖酸盐和月桂基磺酸盐等。(参见，例如berge等(1977)
″
药用盐
″
，j.pharm.sci.66:1-19)。
[0214]
盐或药学上可接受的盐可用于本文公开的所有化合物。
[0215]
本文所用的“治疗”是指预防，减缓，阻止或逆转疾病的发展。治疗也可以意味着改善疾病的一种或多种症状。
[0216]
用于本发明方法中的化合物可以以各种形式给药，包括本文详述的那些。用该化合物的治疗可以是联合治疗或辅助治疗的组分，即需要该药物的受试者或患者联合一种或多种本发明化合物被治疗或者被给予另一种药物用于该疾病。这种联合治疗可以是顺序治疗，其中首先用一种药物治疗患者，然后用另一种或两种药物同时给药。根据所使用的剂型，可以通过相同的途径或通过两种或多种不同的给药途径独立地给药。
[0217]
本文所用的“药学上可接受的载体”是药学上可接受的溶剂，悬浮剂或赋形剂，用于将本发明化合物输送给动物或人。载体可以是液体或固体，并且是按照计划的给药方式选择的。脂质体也是药学上可接受的载体，如胶囊，包衣和各种注射器。
[0218]
在治疗中施用的化合物的剂量将根据诸如特定化疗剂的药效特性及其施用方式和途径之类的因素而变化；受体的年龄，性别，代谢速率，吸收效率，健康状况和体重；症状的性质和程度；同时给药的治疗类型；治疗频率；和所需的治疗效果。
[0219]
用于本发明方法中的化合物的剂量单位可以包括单一化合物或其与附加试剂的混合物。该化合物可制成片剂，胶囊剂，丸剂，散剂，颗粒剂，酏剂，酊剂，混悬剂，糖浆剂，乳剂等口服剂型。化合物可以也可以静脉内(丸或输液)，腹膜内，皮下或肌肉内的形式给药，或通过注射，局部应用或其它方法直接导入或到达疾病部位，所有使用的剂型为药学领域普通技术人员所熟知。
[0220]
用于本发明方法中的化合物可以与适当的药物稀释剂，增量剂，赋形剂或载体(在此统称为药学上可接受的载体)混合给药，所述适当的药物稀释剂，增量剂，赋形剂或载体相对于预期的给药形式适当地选择并且与常规药学实践一致。该单元将是适合于口服，直肠，局部，静脉内或直接注射或胃肠外给药的形式。所述化合物可单独给药或与药学上可接受的载体混合给药。该载体可以是固体或液体，并且通常根据所使用的给药类型来选择载体的类型。活性剂可以片剂或胶囊，脂质体，附聚粉末或液体形式共同给药。合适的固体载体的例子包括乳糖，蔗糖，明胶和琼脂。胶囊或片剂可以容易地配制，并且可以容易地吞咽或咀嚼；其它固体形式包括颗粒和散装粉末。片剂可包含合适的粘合剂，润滑剂，稀释剂，崩解剂，着色剂，调味剂，流动诱导剂和熔化剂。合适的液体剂型的例子包括在水，药学上可接受的脂肪和油，醇或其它有机溶剂中的溶液或悬浮液，包括酯，乳液，糖浆或酏剂，悬浮液，由非泡腾颗粒重构的溶液和/或悬浮液，以及由泡腾颗粒重构的泡腾制剂。这种液体剂型可以包含例如合适的溶剂，防腐剂，乳化剂，悬浮剂，稀释剂，甜味剂，增稠剂和熔化剂。口服剂型任选地含有调味剂和着色剂。胃肠外和静脉内的形式也可以包括矿物质和其它材料，使它们与所选择的注射或递送系统的类型相容。
[0221]
用于制备可用于本发明的剂型的技术和组合物在以下参考文献中描述：7《现代药学》，第9章和第10章(banker&rhodes，编者，1979)；药物剂型：片剂(lieberman,等，1981)；ansel，“药物剂型介绍”第二版(1976):雷明顿药物科学，第17版。(mack publishing company，easton，pa.，1985)；《药学进展》(david ganderton，trevor jones，编辑，1992)；药学进展第7卷。(david ganderton，trevor jones，james mcginity，编辑，1995)；水性聚合物涂料药物剂型(药物和药物科学，系列36(james mcginity，编辑，1989)；药物微粒载体：治疗应用：药物和药物科学，第61卷(alain rolland，编辑，1993)；药物输送到胃肠道(ellis horwood生物学书。制药技术系列；j.g.hardy、s.s.davis、clive g.wilson,编辑)；《现代药剂学药物和药物科学》，第40卷(gilbert s.banker，christopher t.rhodes，编辑)。所有上述出版物通过引用并入本文。
[0222]
片剂可包含合适的粘合剂，润滑剂，崩解剂，着色剂，调味剂，流动诱导剂和熔化剂。例如，用于以片剂或胶囊的剂量单位形式口服给药，该活性药物组分可与口服，无毒，药学上可接受的惰性载体如乳糖，明胶，琼脂，淀粉，蔗糖，葡萄糖，甲基纤维素，硬脂酸镁，磷酸氢钙，硫酸钙，甘露醇，山梨醇等结合。合适的粘合剂包括淀粉，明胶，天然糖如葡萄糖或-乳糖，玉米甜味剂，天然和合成树胶如阿拉伯胶，黄蓍胶或海藻酸钠，羧甲基纤维素，聚乙二醇，蜡等。在这些剂型中使用的润滑剂包括油酸钠，硬脂酸钠，硬脂酸镁，钠苯甲酸盐，醋酸钠，氯化钠等。崩解剂包括但不限于淀粉，甲基纤维素，琼脂，膨润土，黄原胶等。用于本发明方法中的化合物也可以脂质体递送系统的形式给药，例如小的单层囊泡，大的单层囊泡和多层囊泡。脂质体可以由多种磷脂形成，例如胆固醇，硬脂酰胺或磷脂酰胆碱。所述化合物可以作为组织靶向乳剂的组分给药。
[0223]
用于本发明方法中的化合物也可以作为可靶向药物载体或作为前药与可溶性聚合物偶联。这样的聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮，吡喃共聚物，多羟基丙基甲基丙烯酰胺-苯酚，多羟基乙基天冬氨酸-米得苯酚，或被棕榈酰基残基取代的聚环氧乙烷-聚赖氨酸。此外，所述化合物可偶联到一类可生物降解的聚合物上，所述聚合物可用于实现药物的控释，例如聚乳酸，聚乙醇酸，聚乳酸和聚乙醇酸的共聚物，聚己内酯，聚羟基丁酸，聚原酸酯，聚
缩醛，聚二氢吡喃，聚氰基酰化物和水凝胶的交联或两亲嵌段共聚物。
[0224]
明胶胶囊可以含有活性成分化合物和粉末状载体，例如乳糖，淀粉，纤维素衍生物，硬脂酸镁，硬脂酸等。类似的稀释剂可用于制备压缩片剂。片剂和胶囊都可以制成速释产品或缓释产品，以提供药物在一段时间内的连续释放。压缩片剂可以是糖包衣或薄膜包衣以掩盖任何令人不快的味道并保护片剂免受大气影响，或肠溶包衣以选择性地在胃肠道中崩解。
[0225]
对于以液体剂型口服给药，所述口服药物组分与任何口服的，无毒的，药学上可接受的惰性载体例如乙醇，甘油，水等结合。合适的液体剂型的例子包括在水，药学上可接受的脂肪和油，醇或其它有机溶剂中的溶液或悬浮液，包括酯，乳液，糖浆或酏剂，悬浮液，由非泡腾颗粒重构的溶液和/或悬浮液，以及由泡腾颗粒重构的泡腾制剂。这种液体剂型可以包含例如合适的溶剂，防腐剂，乳化剂，悬浮剂，稀释剂，甜味剂，增稠剂和熔化剂。
[0226]
口服给药的液体剂型可包含着色剂和调味剂，以提高患者的接受度。通常，水，合适的油，盐水，右旋糖(葡萄糖)水溶液以及相关的糖溶液和二醇如丙二醇或聚乙二醇是肠胃外溶液的合适载体。肠胃外给药的溶液优选含有活性成分的水溶性盐，合适的稳定剂，以及如果需要的话，缓冲物质。抗氧化剂如亚硫酸氢钠，亚硫酸钠或抗坏血酸单独或组合是合适的稳定剂。还使用柠檬酸及其盐和edta钠。此外，肠胃外溶液可含有防腐剂，如苯扎氯铵，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯和氯丁醇。合适的药物载体描述于雷明顿药物科学，第17版，1989，这一领域的标准参考文本中。
[0227]
用于本发明方法中的化合物也可以鼻内形式通过使用合适的鼻内载体，或通过经皮途径，使用本领域普通技术人员熟知的那些透皮贴形式给药。为了以经皮传递系统的形式给药，在整个给药方案中，剂量给药通常是连续的，而不是间歇的。
[0228]
胃肠外和静脉内的形式还可以包括矿物质和其它材料，以使它们与所选择的注射或递送系统的类型相容。
[0229]
本文公开的每个实施例被认为适用于其它公开的实施例中的每一个。因此，这里所述的各种元素的所有组合都在本发明的范围之内。所公开的任何通用或特定化合物可适用于任何所公开的组合物、工艺或方法。
[0230]
通过参考下面的实验细节将更好地理解本发明，但是本领域的技术人员将容易理解详细的具体实验仅仅是后面的权利要求书中更全面地描述的本发明的说明。
[0231]
实验细节
[0232]
一般化学。除非另有说明，所有反应都在氮的干燥气氛下进行。所示反应温度是指反应浴，而室温(室温)是指25℃。商业级试剂和无水溶剂从销售商处得到，没有进一步尝试纯化或干燥这些组分。减压下除去溶剂是用buchi旋转蒸发器在约28mmhg的压力下使用teflon连接的knf真空泵完成。使用具有荧光指示剂的1
″×3″
analtech no.02521硅胶板进行薄层层析。通过用短波uv光(254nm灯)，在乙醇中的10％磷钼酸或在碘蒸气中观察tlc板来使其可视化。使用analtech，20
×
20厘米，1000微米的制备性tlc板进行制备性薄层层析。使用带有teledyne isco redisep rf和biotage sfar硅胶柱的teledyne isco combiflash companion装置和selekt系统进行快速柱色谱。如果需要，使用带有redisep gold c18反相柱的teledyne isco combiflash companion unit和selekt system通过反相色谱纯化产品。质子nmr谱在400mhz varian核磁共振光谱仪上获
得。化学位移(μ)以百万分之一(ppm)报告，耦合常数(j)值以hz给出，具有以下光谱模式标记：s，单峰；d，双峰；t，三重峰，q，四重峰；dd，双二重峰；m，多重峰；br，宽峰。使用四甲基硅烷作为内标。所提供的任何熔点都是未校正的，并且使用mel-temp电热熔点装置获得。在waters aquity uplc ms三四极质谱仪上使用esi电离进行质谱分析。使用waters breeze2 hplc系统用二元溶剂系统a和b进行高压液相色谱(hplc)纯度分析，使用梯度洗脱[a，h2o与0.1％甲酸；b，ch3cn与0.1％甲酸]，流速＝0.5ml/min，紫外检测波长254nm(系统配备光电二极管阵列(pda)检测器)。使用acqity upl cbeh c18柱，130a，1.7μm，2.1mm
×
50mm。所有用于体外和体内生物学测试的最终化合物被纯化到≥95％纯度，这些纯度水平通过1h nmr和hplc两种方法测量。
[0233]
方案1
[0234][0235]
试剂和条件：(a)nabh4，ch3oh，0℃至室温，8小时；(b)tscl，dmap,et3n，ch2cl2，0℃至室温，16小时；(c)2-(三氟甲基)苯酚，cs2co3，dmf，80℃，16小时；(d)tfa，ch2c12，0℃至室温，8小时；(e)2-氯-6-甲基嘧啶-4-甲酸甲酯，i-pr2net，thf,回流16小时；(f)(i)lioh，ch3oh，thf，h20，室温，16小时；(ii)2n hcl水溶液。
[0236]
实施例1：6-甲基-2-(4-(2-(三氟甲基)苯氧基)哌啶-1-基)嘧啶-4-甲酸21。步骤a：向冷却至0℃的4-氧代哌啶-1-甲酸叔丁酯15(5.0g，25.1mmol)在ch3oh(50ml)中的溶液中加入nabh4(1.14g，30.1mmol)。混合物搅拌8小时，同时逐渐升温至室温。减压浓缩混合物，所得残留物用h2o(100ml)稀释，并用ch2cl2(2
×
100ml)萃取。合并的有机提取物用na2so4干燥,过滤，减压蒸发，得到白色固体(4.5g，89％)的4-羟基哌啶-1-甲酸叔丁酯16：1h nmr(400mhz，cdcl3)；δ3.91-3.75(m，3h)，3.05-2.96(m，2h)，1.90-1.79(m，2h)，1.49-1.40(m，11h)；es ms：m/z 224[m+na]
+
。
[0237]
步骤b：向冷却至0℃的4-羟基哌啶-1-甲酸叔丁酯酯16(4.5g，22.3mmol)在ch2cl2(50ml)中的溶液加入et3n(4.7ml，33.5mmol)和dmap(0.127g，1.10mmol)，随后加入tscl(5.10g，26.8mmol)。将所得溶液搅拌16小时，同时在n2气氛下逐渐升温至室温。混合物用饱和naoh水溶液(50ml)稀释，并用etoac(3
×
100ml)萃取。合并的有机提取物用h2o(100ml)，盐水(100ml)洗涤，用na2so4干燥,过滤，减压浓缩。所得残留物在硅胶上(在己烷中0％至
50％的etoac)层析，得到4-(甲苯酰氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯17的无色液体(6.6g，84％)：1h nmr(400mhz，cdcl3)δ；δ7.82(d，2h)，7.49(d，2h)，4.69(b.s，1h)，3.49(b.m，2h)，3.15(b.m，2h)，2.43(bs，3h)，1.70(b.m，2h)，1.51(b.m，2h)，1.38(s，9h)；esi ms m/z 356[m+h]
+
。
[0238]
步骤c：在无水dmf(4ml)中的4-(甲苯酰氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯17(0.250g，0.703mmol)溶液中加入cs2co3(0.450g，38mmol)和2-(三氟甲基)苯酚(95.0mg，0.586mmol)，将所得溶液在80℃和n2气氛下搅拌16小时。使混合物冷却至室温，然后用h2o(20ml)稀释。水性混合物用etoac(3
×
25ml)提取，合并的有机提取物用h2o(3
×
25ml)，盐水(25ml)洗涤，用na2so4干燥,过滤，减压浓缩。将所得残余物在硅胶(在己烷中0％-30％的etoac)上层析，得到4-(2-(三氟甲基)苯氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯18的白色固体(0.118g，56％)的：1h nmr(400mhz，丙酮-d6)δ7.65-7.55(m，2h)，7.30(d，1h)，7.08(t，1h)，4.92-4.82(m，1h)，3.67-3.57(m，2h)，3.50-3.40(m，2h)，2.0-1.90(m，2h)，1.80-1.70(m，2h)，1.45(s，9h)；esi ms m/z 346[m+h]
+
。
[0239]
步骤d：向冷却至0℃的4-(2-(三氟甲基)苯氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯18(0.118g，0.341mmol)在ch2cl2(10ml)中的溶液加入tfa(0.33ml，4.31mmol)，将所得溶液搅拌16小时，同时逐渐升温至室温。小心地将混合物倒入饱和nahco3水溶液(10ml)中中和。分离两相混合物，进一步用ch2cl2(3
×
20ml)萃取水层。合并的有机提取物用盐水(20ml)洗涤，用na2so4干燥，过滤，减压浓缩得到的4-(2-(三氟甲基)苯氧基)哌啶19的白色固体(80.0mg，95％)：1h nmr(400mhz，丙酮-d6)δ7.70-7.60(m，2h)，7.37(d，1h)，7.14(t，1h)，5.10-5.03(m，1h)，3.50-3.40(m，4h)，2.47-2.37(m，2h)，2.21-2.11(m，2h)；esi ms m/z246[m+h]
+
。
[0240]
步骤e：4-(2-(三氟甲基)苯氧基)哌啶19(0.100g，0.408mmol)，2-氯-6-甲基嘧啶-4-甲酸甲酯(76.1mg，0.408mmol)和i-pr2net(0.21ml，22mmol)在thf(10ml)中的混合物在n2气氛下回流加热16小时。反应在减压下浓缩，所得残留物在硅胶(在己烷中0％-100％的etoac)上层析，得到6-甲基-2-(4-(2-(三氟甲基)苯氧基)哌啶-1-基)嘧啶-4-甲酸甲酯20的灰白色固体(0.140g，87％):ms(esi+)m/z 396[m+h]
+
。步骤f：6-甲基-2-(4-(2-(三氟甲基)苯氧基)哌啶-1-基)嘧啶-4-甲酸甲酯20(0.100g，0.253mmol)和lioh(18.1mg，0.758mmol)在ch3oh(5ml)，thf(5ml)和h2o(5ml)中的溶液在室温下搅拌16小时。用2n hcl水溶液将混合物酸化至ph＝5，并用ch2cl2(3
×
10ml)萃取。合并的有机提取物用盐水(20ml)洗涤，用na2so4干燥,过滤，减压浓缩，得到6-甲基-2-(4-(2-(三氟甲基)苯氧基)哌啶-1-基)嘧啶-4-甲酸21的灰白色固体(87.8mg，91％)的：1h nmr(400mhz，cdcl3)δ7.56-7.53(m，2h)，7.22(d，j＝6hz，2h)，7.02-7.51(m，1h)，4.86(brs，1h)，3.99-3.85(m，4h)，2.37(s，3h)，2.05-1.95(m，2h)，1.81-1.80(m，2h)；esi ms m/z 382[m+h]
+
；hplc》99％(auc)，tr＝16.8分钟。
[0241]
方案2
氯-6-甲基嘧啶-4-甲酸甲酯(80.6mg，0.432mmol)和i-pr2net(0.23ml，0.29mmol)在thf(10ml)的混合物在n2气氛下回流加热16小时。使反应冷却至室温，然后减压浓缩。将所得残留物在硅胶(在己烷中的0％-100％etoac)上层析，得到(
±
)6-甲基-2-(3-(2-(三氟甲基)苯氧基)吡咯烷-1-基)嘧啶-4-甲酸甲酯(
±
)-26的灰白色固体(0.145g，88％)：1h nmr(400mhz，cdcl3)δ7.52(d，j＝8.0hz，1h)，7.45(t，j＝7.6hz，1h)，7.00(s，1h)，6.98-6.95(m，2h)，5.10(s，1h)，4.00-3.86(m，3h)，3.89(s，3h)，3.76-3.74(m，2h)，2.38(s，3h)，2.22-2.19(m，1h)；esi ms m/z 382[m+h]
+
。
[0248]
步骤e:将(
±
)6-甲基-2-(3-(2-(三氟甲基)苯氧基)吡咯烷-1-基)嘧啶-4-甲酸甲酯(
±
)(
±
)-26(48.8g，0.128mmol)和lioh(9.21mg，0.384mmol)在ch3oh(5ml)、thf(5ml)和h2o(5ml)中的溶液在室温下搅拌16小时。用2n hcl水溶液将混合物酸化至ph5，并用ch2cl2(3
×
10ml)萃取。合并的有机提取物用盐水洗涤，用na2so4干燥,过滤，减压浓缩得到(
±
)
‑‑
6-甲基-2-(3-(2-(三氟甲基)苯氧基)吡咯烷-1-基)嘧啶-4-羧酸(
±
)-27的灰白色固体(0.043g，91％):1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ7.61-7.54(m，2h)，7.34-7.33(m，1h)，7.00-6.93(m，2h)，5.31(s，1h)，3.77-3.86(m，3h)，3.50-3.48(m，1h)，2.30(s，3h)，2.29-2.20(m，2h)；esi ms m/z 368[m+h]
+
；hplc》99％(auc)，tr＝14.5分钟。
[0249]
方案3
[0250][0251]
试剂和条件:(a)2-(三氟甲基)苯酚，cs2co3，dmf，80℃，16小时；(b)tfa，ch2cl2，0℃至室温，8小时；(c)2-氯-6-甲基嘧啶-4-甲酸甲酯，i-pr2net，thf，回流16小时；(d)(i)lioh，ch3oh，thf，h2o，室温，16小时；(ii)2n hcl水溶液。
[0252]
实施例3：6-甲基-2-(3-(2-(三氟甲基)苯氧基)氮杂环丁烷-1-基)嘧啶-4-甲酸32。步骤a：向3-(甲苯磺酰氧基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯28(0.500g,1.52mmol)在dmf(20ml)中的溶液中加入cs2co3(990mg，3.05mmol)和2-(三氟甲基)苯酚(0.272g，1.68mmol)，所得溶液在80℃和n2气氛下搅拌16小时。使混合物冷却至室温，然后用h2o(50ml)稀释，并用etoac(3
×
50ml)萃取。有机组合物提取物用h2o(3
×
50ml)，盐水洗涤，na2so4干燥，过滤，减压浓缩。所得残留物在硅胶上(在己烷中0％至30％的etoac)层析，得到3-(2-(三氟甲基)苯氧基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯29的无色液体(0.400g，82％)：1h nmr(400mhz，cdcl3)δ7.59(d，j＝7.3hz，1h)，7.61-7.45(m，1h)，7.06-7.03(m，1h)，6.65(d，j＝7.9hz，1h)，4.99-4.91(m，1h)，4.35-4.30(m，2h)，4.10-4.05(m，2h)，1.44(s，9h)；esi ms m/z 318[m+h]
+
。
[0253]
步骤b：向3-(2-(三氟甲基)苯氧基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯29(0.400g，1.20mmol)在ch2cl2(20ml)中的0℃冷却溶液中加入tfa(0.96ml，12.0mmol)，将所得溶液搅拌16小时，同时逐渐升温至室温。小心地将混合物倒入饱和nahco3水溶液(10ml)中中和。分离两相混合物，并进一步用ch2cl2(3
×
20ml)萃取水层。合并的有机提取物用盐水(20ml)洗涤，用na2so3干燥，过滤，减压浓缩，得到3-(2-(三氟甲基)苯氧基)氮杂环丁烷30的白色固体(0.240g，87％):esi ms m/z 218[m+h]
+
。
[0254]
步骤c：3-(2-(三氟甲基)苯氧基)氮杂环丁烷30(0.100g，0.460mmol)、2-氯-6-甲基嘧啶-4-甲酸甲酯(85.9mg，0.460mmol)和i-pr2net(0.24ml，1.38mmol)在thf(10ml)中的混合物在n2气氛下回流加热16小时。减压浓缩反应物，所得残余物在硅胶上(在己烷中0％至100％的etoac)层析，得到6-甲基-2-(3-(2-(三氟甲基)苯氧基)氮杂环丁烷-1-基)嘧啶-4-甲酸甲酯31的灰白色固体(0.152g，90％)：ms(esi+)m/z[m+h]
+
。
[0255]
步骤d：6-甲基-2-(3-(2-(三氟甲基)苯氧基)氮杂环丁烷-1-基)嘧啶-4-甲酸甲酯31(0.100g，0.272mmol)和lioh(19.5mg，0.816mmol)在ch3oh(5ml)、thf(5ml)和h2o(5ml)中的溶液在室温下搅拌16小时。混合物用2n hcl水溶液酸化至ph5，并用ch2cl2(3
×
20ml)萃取。合并的有机提取物用盐水(10ml)洗涤。用na2so3干燥，过滤，减压浓缩得到6-甲基-2-(3-(2-(三氟甲基)苯氧基)氮杂环丁-1-基)嘧啶-4-甲酸32的灰白色固体(83.6mg，87％)：1h nmr(400mhz，cdc13)δ7.59-7.54(m，2h)，7.14(s，1h)，7.08(t，j＝7.6hz，1h)，6.94(d，j＝8.0hz，1h)，5.28(m，1h)，4.61-4.60(m，2h)，4.15-4.12(m，2h)，2.40(s，3h)；esi ms m/z 354[m+h]
+
；esi ms m/z 354[m+h]
+
；hplc》99％(auc)，tr＝14.1分钟。
[0256]
方案4
[0257][0258]
试剂和条件：(a)tscl，dmap,et3n，ch2cl2，0℃至室温，16小时；(b)2-(三氟甲基)苯酚，cs2co3，dmf，80℃，16小时；(c)tfa，ch2cl2，0℃至室温，8小时；(d)2-氯-6-甲基嘧啶-4-甲酸甲酯，i-pr2net，回流，16小时；(e)(i)lioh，ch3oh，thf，h2o，室温，16小时；(ii)2n hcl水溶液。
[0259]
实施例4：6-甲基-2-(3-((2-(三氟甲基)苯氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-基)嘧啶-4-甲酸38。步骤a：向3-(羟甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯33(3.0g，16.0mmol)在ch2cl2(50ml)的0℃冷却溶液中加入et3n(4.5ml，32.0mmol)和dmap(97.0mg，0.736mmol)，随后加入tscl(3.35g，17.6mmol)。将所得溶液搅拌16小时，同时在n2气氛下逐渐升温至室温。混合物用饱和naoh水溶液(50ml)稀释，并用etoac(3
×
100ml)萃取。合并的有机提取物用h2o和盐水(50ml)洗涤。用na2so4干燥,过滤，减压浓缩，得到3-((甲苯酰氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯34的无色液体(5.0g，92％):esi ms m/z 342[m+h]
+
。
[0260]
步骤b：向3-((甲苯酰氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯34(5.0g，14.6mmol)
在dmf(50ml)的0℃冷却至溶液中加入cs2co3(9.5g，29.32mmol)和2-(三氟甲基)苯酚(2.3g，14.6mmol)，所得混合物在80℃和n2气氛下搅拌16小时。使混合物冷却至室温，然后用h2o(100ml)稀释，并用etoac(3
×
50ml)萃取。合并的有机提取物用h2o(3
×
50ml)，盐水(50ml)洗涤，用na2so4干燥，过滤，减压浓缩，得到3-((2-(三氟甲基)苯氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯35的棕色液体(4.5g，93％):esi ms m/z 332[m+h]
+
。
[0261]
步骤c：向3-((2-(三氟甲基)苯氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯35(4.50g，13.59mmol)在ch2cl2(50ml)的0℃冷却溶液中加入tfa(10.3ml，135mmol)，将所得溶液在逐渐升温至室温的同时搅拌8小时。通过小心地将混合物倒入饱和nahco3水溶液(10ml)中中和混合物。分离两相混合物，并进一步用ch2cl2(3
×
20ml)萃取水层。合并的有机提取物用盐水(20ml)洗涤，用na2so4干燥,过滤，减压浓缩，得到3-((2-(三氟甲基)苯氧基)甲基)哌啶36的白色固体(2.8g，90％粗品)：esi ms m/z 232[m+h]
+
。
[0262]
步骤d：3-((2-(三氟甲基)苯氧基)甲基)氮杂环丁烷36(1.0g，4.32mmol)、2-氯-6-甲基嘧啶-4-甲酸甲酯(0.807g，4.32mmol)和i-pr2net(2.25ml，12.9mmol)在thf(20ml)中的混合物在n2气氛下回流加热16小时。减压浓缩反应物，所得残留物在硅胶上(在己烷中的0％-100％etoac)层析，得到6-甲基-2-(3-((2-三氟甲基)苯氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-基)嘧啶-4-甲酸甲酯37的灰白色固体(1.64g，86％)：1h nmr(400mhz，cdcl3)δ7.52(d，j＝7.6hz，1h)，7.45(t，j＝7.6hz，1h)，7.05(s，1h)，7.00-6.95(m，2h)，4.33(t，j＝8.8hz，2h)，4.22-4.21(m，2h)，4.08-4.04(m，2h)，3.91(s，3h)，3.18-3.16(m，1h)，2.40(s，3h)；esi ms m/z382[m+h]
+
。
[0263]
步骤e：6-甲基-2-(3-((2-三氟甲基)苯氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-基)嘧啶-4-甲酸甲酯37(1.0g，2.62mmol)和lioh(0.188g，7.86mmol)在ch3oh(10ml)、thf(10ml)和h2o(10ml)中的溶液在室温下搅拌16小时。用2n hcl水溶液将混合物酸化至ph＝5，并用ch2cl2(3
×
10ml)萃取。合并的有机提取物用盐水(10ml)洗涤，用na2so4干燥，过滤，减压浓缩，得到6-甲基-2-(3-((2)-(三氟甲基)苯氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-基)嘧啶-4-甲酸38的白色固体(0.914g，95％)：1h nmr(400mhz，cdcl3)δ7.51(d，j＝7.6hz，1h)，7.46(t，j＝7.6hz，1h)，7.00(s，1h)，7.00-6.94(m，2h)，4.33(t，j＝8.4hz，2h)，4.24-4.22(m，2h)，4.07-4.03(m，2h)，3.17-3.15(m，1h)，2.42(s，3h)；esi ms m/z 368[m+h]
+
；hplc 98.2％(auc)，tr＝13.5分钟。
[0264]
方案5
[0265][0266]
试剂和条件：(a)tscl，dmap，et3n，ch2cl2，0℃至室温，16小时；(b)2-(三氟甲基)苯酚，cs2co3，dmf，80℃，16小时；(c)tfa，ch2cl2，0℃至室温，8小时；(d)2-氯-6-甲基嘧啶-4-甲酸甲酯，i-pr2net，thf，回流16小时；(e)(i)lioh，ch3oh，thf，h2o，室温，16小时；(ii)2n hcl水溶液。
[0267]
实施例5:(
±
)-6-甲基-2-(3-((2-(三氟甲基)苯氧基)甲基)吡咯烷-1-基)嘧啶-4-甲酸(
±
)-44。步骤a:向(
±
)-3-(羟甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(
±
)-39(2.0g，9.93mmol)，et3n(2.8ml，83.7mmol)和dmap(60.4mg，0.494mmol)在ch2cl2(50ml)的0℃冷却溶液中加入tscl(2.27g，11.9mmol),所得混合物搅拌16小时，同时在n2气氛下逐渐升温至室温。混合物用饱和naoh水溶液(50ml)稀释，然后用etoac(3
×
100ml)萃取。合并的有机提取物用h2o(50ml)，盐水(50ml)洗涤，用na2so4干燥，过滤，减压浓缩。所得残留物在硅胶(在己烷中的0-30％etoac)上层析得到(
±
)-3-((甲苯酰氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(
±
)-40的白色固体(3.1g，88％)：1nmr(400mhz，dmso-d6)δ7.76(d，j＝8.4hz，2h)，7.46(d，j＝8.4hz，2h)，3.97(d，j＝6.8hz，2h)，3.28-3.25(m，1h)，3.24-3.19(m，2h)，3.13-3.10(m，1h)，2.85-2.81(m，1h)，2.39(s，3h)，1.82-1.81(m，1h)，1.49-1.47(m，1h)，1.33(s，9h)；esi ms m/z 356[m+h]
+
。
[0268]
步骤b：向(
±
)-3-((甲苯酰氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(
±
)加入-40(1.0g，2.81mmol)在dmf(10ml)中的溶液加入cs2co3(2.74g，8.41mmol)和2-(三氟甲基)苯酚(0.410g，2.53mmol)，所得混合物在80℃和n2气氛下搅拌16小时。使混合物冷却至室温，然后用h2o(30ml)稀释。水性混合物用etoac(3
×
50ml)萃取，合并的有机提取物用h2o(3
×
50ml)，盐水(50ml)洗涤，用na2so4干燥，过滤，减压浓缩。将所得残余物在硅胶(在己烷中0％-30％的etoac)上层析，得到(
±
)-3-((2-(三氟甲基)苯氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(
±
)-41的白色固体(0.816g，84％)：1nmr(400mhz，dmso-d6)δ7.61-7.56(m，2h)，7.22(d，j＝8.8hz，1h)，7.06(t，j＝7.6hz，1h)，4.09-4.02(m，2h)，3.44-3.35(m，1h)，3.36-3.33(m，
1h)，3.25-3.19(m，1h)，3.11-3.01(m，1h)，2.62-2.55(m，1h)，97(brs，1h)，1.96-1.64(m，1h)，1.35(s，9h)；esi ms m/z 346[m+h]
+
。
[0269]
步骤c：向((
±
)-3-((2-(三氟甲基)苯氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(
±
)-41(0.800g，2.32mmol)在ch2cl2(10ml)中的0℃冷却溶液加入tfa(3.5ml，46.3mmol)，将所得混合物搅拌16小时，同时在n2气氛下逐渐升温至室温。通过小心地将混合物倒入饱和nahco3水溶液(50ml)中来中和混合物，分离得到的两相混合物。水层进一步用ch2cl2(3
×
50ml)萃取,合并的有机提取物用盐水(50ml)洗涤，用na2so4干燥,过滤，减压浓缩得到(
±
)-3-((2-(三氟甲基)苯氧基)甲基)吡咯烷(
±
)-42的白色固体(0.520g，90％)：1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ9.25(brs，1h)，7.62-7.57(m,2h),7.22(d,j＝8.4hz,1h),7.07(t,j＝7.6hz,1h),4.16-4.05(m,2h),3.38-3.33(m,1h),3.28-3.16(m,2h),2.98(t,j＝8.0hz,1h),2.77-2.69(m,1h),2.11-2.03(m,11h),1.78-1.69(m,1h)；esi ms m/z 346[m+h]
+
；esi ms m/z 246[m+h]
+
。
[0270]
步骤d:向(
±
)-3-((2-(三氟甲基)苯氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(
±
)-42(0.265g 1.08mmol)在thf(5ml)中的溶液中加入i-pr2net(0.6ml，3.24mmol)和2-氯-6-甲基嘧啶-4-甲酸甲酯(0.242g，1.29mmol)，所得混合物在回流下搅拌16小时。所得残余物在硅胶(在己烷中的0％-50％etoac)上层析，得到(
±
)-6-甲基-2-(3-((2-(三氟甲基)苯氧基)甲基)吡咯烷-1-基)嘧啶-4-甲酸甲酯(
±
)-43的白色固体(0.362g，85％)：1h nmr(400mhz，cdcl3)δ7.54(d，j＝7.6hz，1h)，7.44(t,j＝7.6hz,1h),6.99(s,1h),6.97-6.92(m,2h),4.10-4.06(m,1h),4.00-3.96(m,1h),3.91(s,3h),3.89-3.86(m,1h),3.79-3.76(m,1h),3.66-3.61(m,1h),3.51-3.47(m,1h),2.86-2.82(m,1h),2.39(s,3h),2.24-2.20(m,1h),1.99-1.94(m,1h)；esi ms m/z 396[m+h]
+
。
[0271]
步骤e：向(
±
)-6-甲基-2-(3-((2-(三氟甲基)苯氧基)甲基)吡咯烷-1-基)嘧啶-4-甲酸甲酯(
±
)-43(0.250g，0.632mmol)在ch3oh(4ml)、thf(4ml)和h2o(2ml)中的溶液中加入lioh(0.151g，6.32mmol)，并在室温下搅拌混合物16小时。减压浓缩该混合物以除去挥发性溶剂，所得产物用水性混合物用另外的h2o(10ml)稀释，并用2n hcl水溶液酸化至ph＝3。酸化的混合物用etoac(3
×
50ml)提取，合并的有机提取物用盐水(50ml)洗涤，用na2so4干燥,过滤，减压浓缩，得到(
±
)1(4-(2-(三氟甲基)苯基)哌啶-1-羰基)吡咯烷-2-甲酸(
±
)-44的白色固体(0.160g，66％)：1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ7.59(m，2h)，7.24(m，1h)，7.06-7.02(m，1h)，6.93(s，1h)，4.16-4.11(m，2h)，3.95-3.61(m，2h)，3.50-3.44(m，1h)，3.35-3.09(m，1h)，2.75-2.68(m，1h)，2.35(s，3h)，2.14-2.06(m，1h)，1.87-1.78(m，1h)；esi ms m/z 382[m+h]
+
；hplc 98.7％(auc)，tr＝14.5分钟。
[0272]
方案6
[0273][0274]
试剂和条件：(a)tscl，dma，pet3n，ch2cl2，0℃至室温，16小时；(b)2-(三氟甲基)苯酚，cs2co3，dmf，80℃，16小时；(c)tfa，ch2cl2，0℃至室温，8小时；(d)2-氯-6-甲基嘧啶-4-甲酸甲酯，i-pr2net，回流，16小时；(e)(i)lioh，ch3oh，thf，h2o，室温，16小时；(ii)2n hcl水溶液。
[0275]
实施例6:(r)-6-甲基-2-(3-((2-(三氟甲基)苯氧基)甲基)吡咯烷-1-基)嘧啶-4-甲酸(r)-50。化合物(r)-50由(r)-3-(羟甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(r)-45按照合成(
±
)-44所述的类似步骤制备：1h nmr(400mhz,cdc13)δ7.55(d,j＝7.6hz,1h),7.45(t,j＝7.6hz,1h),7.12(s,1h),7.01-6.94(m,2h),4.07-4.06(m,2h),3.86-3.77(m,2h),3.62-3.51(m,2h),2.89-2.86(m,1h),2.43(s,3h),2.27-2.23(m,1h),2.14-2.01(m,1h)；esi ms m/z 382[m+h]
+
；hplc》99％(auc),tr＝14.5分钟。
[0276]
实施例7:(s)-6-甲基-2-(3-((2-(三氟甲基)苯氧基)甲基)吡咯烷-1-基)嘧啶-4-甲酸(s)-56。化合物(s)-56由(s)-3-(羟甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(s)-51按照合成(
±
)-44所述的类似步骤制备:1hnmr(400mhz，cdcl3)δ7.56(d，j＝8.0hz，1h)，7.46(t，j＝8.4hz，1h)，7.12(s，1h)，7.01-6.94(m，2h)，4.07-4.06(m，2h)，3.86-3.77(m，2h)，3.62-3.51(m，2h)，2.90-2.85(m，1h)，2.44(s，3h)，2.26-2.24(m，1h)，2.14-2.01(m，1h)；esi ms m/z 382[m+h]
+
；hplc》99％(auc)，tr＝14.5分钟。
[0277]
方案7
[0278][0279]
试剂和条件：(a)tscl，dmap，et3n，ch2cl2，0℃至室温，16小时；(b)2-(三氟甲基)苯酚，cs2co3，dmf，80℃，16小时；(c)tfa，ch2cl2，0℃至室温，8小时；(d)2-氯-6-甲基嘧啶-4-甲酸甲酯，i-pr2net，回流，16小时；(e)(i)lioh，ch3oh，thf，h2o，室温，16小时；(ii)2n hcl水溶液。
[0280]
实施例8:(
±
)-6-甲基-2-(3-((2-(三氟甲基)苯氧基)甲基)哌啶-1-基)嘧啶-4-甲酸(
±
)-62。步骤a:(
±
)-3-(羟甲基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(
±
)-57(1.0g，4.65mmol)在ch2cl2(20ml)中的0℃冷却溶液加入et3n(0.81ml，5.80mmol)和dmap(52.0mg，0.426mmol)，然后加入tscl(0.883g，4.65mmol)。所得溶液搅拌16小时，同时逐渐升温至室温。用饱和naoh水溶液(50ml)稀释反应混合物，并用etoac(3
×
100ml)萃取。合并的有机提取物用h2o(100ml)和盐水(100ml)洗涤，用na2so4干燥,过滤，减压浓缩得到(
±
)-3-((甲苯酰氧基)甲基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(
±
)-58的无色液体(1.6g，94％):esi ms m/z 370[m+h]
+
。
[0281]
步骤b:向(
±
)-3-((甲苯磺酰氧基)甲基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(
±
)-58(0.500g，1.35mmol)在dmf(20ml)中的溶液中加入cs2co3(0.650g，2.00mmol)和2-(三氟甲基)苯酚(0.219g，1.35mmol)，将所得混合物在80℃在n2气氛下搅拌16小时。使反应混合物冷却至室温，然后用h2o(50ml)稀释，并用etoac(3
×
50ml)萃取。合并的有机提取物用h2o(3
×
50ml)，盐水(50ml)洗涤，用na2so4干燥,过滤，减压浓缩得到(
±
)-3-((2-(三氟甲基)苯氧基)甲基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(
±
)-59的褐色油状物(0.400g，82％):esi ms m/z 360[m+h]
+
。
[0282]
步骤c：向(
±
)-3-((2-(三氟甲基)苯氧基)甲基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(
±
)-59(0.400g，1.11mmol)在ch2cl2(20ml)中的0℃溶液中加入tfa(0.85ml，11.1mmol)，将所得溶液搅拌8小时，同时逐渐升温至室温。小心地将混合物倒入饱和nahco3水溶液(10ml)中中和混合物。分离两相混合物，并进一步用ch2cl2(3
×
20ml)萃取水层。合并的有机提取物用盐水(20ml)洗涤，用na2so4干燥，过滤，减压浓缩得到(
±
)-3-((2-(三氟甲基)苯氧基)甲基)哌啶(
±
)-60的白色固体(0.250g，86％)：esi ms m/z 260[m+h]
+
。
[0283]
步骤d:(
±
)-3-((2-)(三氟甲基)苯氧基)甲基)哌啶(
±
)-60(0.100g，0.385mmol)在thf(5ml)中的溶液加入i-pr2net(0.20ml，1.16mmol)和2-氯-6-甲基嘧啶-4-甲酸甲酯(71.8mg，0.385mmol)，所得混合物在n2氛下回流搅拌16小时，使混合物冷却至室温，然后减
压浓缩。将所得残留物在硅胶(在己烷中的0％-50％etoac)上层析，得到(
±
)-6-甲基-2-(3-((2-(三氟甲基)苯氧基)甲基)哌啶-1-基)嘧啶-4-甲酸甲酯(
±
)-61的白色固体(0.137g，87％)：1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ7.59-7.55(m，2h)，7.22(d，j＝8.4hz，1h)，7.05(t，j＝7.6hz，1h)，6.94(s，1h)，4.79(d，j＝12.8hz，1h)，4.55(d，j＝12.8hz，1h)，4.04-3.96(m，2h)，3.80(s，3h)，2.93-2.83(m，3h)，2.29(s，3h)，85-1.71(m，4h)；esi ms m/z 410[m+h]
+
。
[0284]
步骤e：向(
±
)-6-甲基-2-(3-((2-(三氟甲基)苯氧基)甲基)哌啶-1-基)嘧啶-4-甲酸甲酯(
±
)-61(0.100g，0.244mmol)在ch3oh(4ml)、thf(4ml)和h2o(2ml)中的溶液中加入lioh(58.4mg，2.44mmol)，混合物在室温下搅拌16小时。减压浓缩混合物以除去挥发性溶剂，所得含水混合物用另外的h2o(10ml)稀释，用2n hcl水溶液酸化至ph＝3。酸化的混合物用etoac(3
×
50ml)提取，合并的有机提取物用盐水(50ml)洗涤，用na2so4干燥，过滤，减压浓缩得到(
±
)-6-甲基-2-(3-((2-(三氟甲基)苯氧基)甲基)哌啶-1-基)嘧啶-4-甲酸(
±
)-62的白色固体(96.4mg，66％)：1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ7.60-7.56(m，2h)，7.23(d,j＝8.8hz,1h),7.06(t,j＝8.0hz,1h),6.91(s,1h),4.77(d,j＝10.4hz,1h),4.57(d,j＝13.2hz,1h),4.02-4.00(m,2h),2.92-2.84(m,3h),2.29(s,3h),1.93-1.71(m,4h),1.41-1.39(m,2h)；esi ms m/z396[m+h]
+
；hplc》99％(auc),tr＝16.2分钟。
[0285]
方案8
[0286][0287]
试剂和条件：(a)l-溴-2-(三氟甲基)苯，x-phos，pd2(dba)3，cs2c03，1，4-二恶烷，110℃，16小时；(b)tfa，ch2c12，0℃至室温，8小时；(c)2-氯-6-甲基嘧啶-4-甲酸甲酯，i-pr2net，thf，回流16小时；(d)(i)lioh，ch3oh，h20，室温，16小时；(ii)2n hcl水溶液。
[0288]
实施例9:(
±
)-6-甲基-2-(7-(2-(三氟甲基)苯基)-2，7-二氮杂螺[4.4]壬烷-2-基)嘧啶-4-甲酸(
±
)-67。步骤a:将(
±
)-2,7-二氮螺[4.4]壬烷-2-甲酸叔丁酯(
±
)-63(0.250g，1.11mmol)和1-溴-2-(三氟甲基)苯(0.273g，1.22mmol)在1,4-二恶烷中的混合物用n2脱气5分钟，然后加入cs2co3(1.08g，3.31mmol)、x-phos(0.105mg，0.223mmol)以及pd2(dba)3(0.101g，0.112mmol)。将反应混合物在密封容器中在110℃下搅拌16小时。然后将混
合物冷却至室温并减压浓缩。将所得残留物在硅胶(在己烷中0％-30％的etoac)上层析，得到(
±
)-7-(2-(三氟甲基)苯基)-2,7-二氮杂螺[4.4]壬-2-甲酸甲酯叔丁酯(
±
)-64的灰白色无定形固体(0.230g，56％):esi ms m/z 371[m+h]
+
。
[0289]
步骤b:向(
±
)-7-(2-(三氟甲基)苯基)-2,7-二氮杂螺[4.4]壬-2-甲酸甲酯叔丁酯(
±
)-64(0.100g，2.69mmol)在ch2c12(5ml)中的0℃溶液中加入tfa(0.20ml，2.61mmol)，将所得溶液搅拌8小时，同时逐渐升温至室温。小心将混合物倒入饱和nahco3水溶液(10ml)中中和。分离两相混合物，并进一步用ch2cl2(3
×
20ml)萃取水层。合并的有机提取物用盐水(20ml)洗涤，用na2so4干燥，过滤，减压浓缩得到(
±
)-2-(2-(三氟甲基)苯基)-2，7-二氮杂螺[4.4]壬烷(
±
)-65的白色固体(65.0mg，90％)：esi ms m/z 271[m+h]
+
。
[0290]
步骤c：向(
±
)-2-(2-(三氟甲基)苯基)-2，7-二氮杂螺[4.4]壬烷(
±
)-65(0.150g，0.554mmol)在thf(5ml)中的溶液中加入i-pr2net(0.29ml，66mmol)和2-氯-6-甲基嘧啶-4-甲酸甲酯(0.103g，0.554mmol)，所得混合物在氮气气氛下回流搅拌16小时，使混合物冷却至室温，然后减压浓缩。将所得残留物在硅胶(在己烷中0％-50％的etoac)上层析，得到(
±
)-6-甲基-2-(7-(2-(三氟甲基)苯基)-2,7-二氮杂螺[4.4]壬烷-2-基)嘧啶-4-甲酸甲酯(
±
)-66的白色固体(0.205g，88％)：1h nmr(400mhz,cdc13)δ7.55(d,j＝6.4hz,1h),7.35(t,j＝7.6hz,1h),7.00(s,1h),6.95(d,j＝8.4hz,1h),6.87(t,j＝7.6hz,1h),3.91(s,3h),3.74-3.61(m,4h),3.47-3.44(m,2h),3.30(s,2h),2.39(s,3h),2.08-1.93(m,4h)；esi ms m/z421[m+h]
+
。
[0291]
步骤d：向(
±
)-6-甲基-2-(7-(2-(三氟甲基)苯基)-2,7-二氮杂螺[4.4]壬烷-2-基)嘧啶-4-甲酸甲酯(
±
)-66(0.100g，0.237mmol)在ch3oh(4ml)、thf(4ml)和h2o(2ml)中的溶液中加入lioh(56.9mg，2.37mmol)，混合物在室温下搅拌16小时。减压浓缩混合物以除去挥发性溶剂，所得含水混合物用另外的h2o(10ml)稀释，用2n hcl水溶液酸化至ph＝3。酸化的混合物用etoac(3
×
50ml)提取，合并的有机提取物用盐水(50ml)洗涤，用na2so4干燥，过滤，减压浓缩得到(
±
)-6-甲基-2-(7-(2-(三氟甲基)苯基)-2，7-二氮杂螺[4.4]壬烷-2-基)嘧啶-4-甲酸(
±
)-67的白色固体(65.5mg，68％)：1h nmr(400mhz，cdcl3)δ7.56(d，j＝8.0hz，1h)，7.37(t，j＝7.6hz，1h)，7.13(s，1h)，7.01-6.99(m，1h)，6.93-6.88(m，1h)，3.67-3.55(m4h)，3.46(t，j＝6.8hz，2h)，3.31-3.26(m，2h)，2.44(s，3h)，2.10-1.97(m，4h)；esi ms m/z 407[m+h]+；hplc 98.4％(auc)，tr＝15.5分钟。
[0292]
方案9
[0293][0294]
试剂和条件:(a)2-(三氟甲基)苯硫醇，cs2co3，dmf，80℃，16小时；(b)tfa，ch2c12，0℃至室温，8小时；(c)2-氯-6-甲基嘧啶-4-甲酸甲酯，i-pr2net，thf，回流16小时；(d)(i)lioh，ch3oh，thf，h20，室温，16小时；(ii)2n hcl水溶液。
[0295]
实施例10:(
±
)-6-甲基-2-(3-(((2-(三氟甲基)苯基)硫代)甲基)吡咯烷-1-基)嘧啶-4-甲酸(
±
)-71。化合物(
±
)-71由(
±
)-3-((甲苯酰氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(
±
)-40和2-(三氟甲基)苯硫醇按照合成(
±
)-44所述的类似步骤制备：1h nmr(400mhz，丙酮-d6)δ7.72(t，j＝7.2hz，2h)，7.61(t，j＝7.2hz，1h)，7.40(t，j＝8.0hz，1h)，7.05(s，1h)，3.89-3.70(m，2h)，3.59-3.55(m，1h)，3.42-3.74(m，1h)，3.25(d，j＝7.2hz，2h)，2.64-2.62(m，1h)，2.40(s，3h)，2.27-2.24(m，1h)，1.92-1.87(m，1h)；esi ms m/z 398[m+h]
+
；hplc 97.1％(auc)，tr＝14.9分钟。
[0296]
方案10
[0297][0298]
试剂和条件:(a)2-(三氟甲基)苯胺，nabh(oac)3，hoac，ch2cl2，室温，16小时；(b)tfa，ch2c12，0℃至室温，12小时；(c)2-氯-6-甲基嘧啶-4-甲酸甲酯，i-pr2net，dmf，80℃，16小时；(d)(i)lioh，ch3oh，thf，h20，室温，12小时；(ii)2n hcl水溶液。
[0299]
实施例11:(
±
)-6-甲基-2-(3-(((，2-(三氟甲基)苯基)氨基)甲基)吡咯烷-1-基)嘧啶-4-甲酸(
±
)-76。
[0300]
步骤a：向(
±
)-3-甲酰基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(
±
)-72(0.300g，1.51mmol)和2-(三氟甲基)苯胺(0.242g，1.53mmol)在ch2cl2(10ml)中的溶液中加入nabh(oac)3(0.960g，4.53mmol)，混合物在室温下搅拌16小时。将混合物用饱和nahco3水溶液(5ml)、盐水(5ml)洗涤，用na2so4干燥，过滤，减压浓缩，得到油状粗(
±
)3-(((2-(三氟甲基)苯基)氨基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(
±
)-73(0.400g，77％粗产率)，用于下一步：esi ms m/z 345[m+h]
+
。
[0301]
步骤b：向(
±
)-3-(((2-(三氟甲基)苯基)氨基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(
±
)-73(0.400g，1.16mmol)在ch2cl2(5ml)中的0℃溶液中加入tfa(0.89ml，11.6mmol)，将所得溶液搅拌12小时，同时逐渐升温至室温。小心地将混合物倒入饱和nahco3水溶液(10ml)中中和。分离双相混合物，用ch2cl2(3
×
20ml)进一步萃取水层。合并的有机提取物用盐水(20ml)洗涤，用na2so4干燥，过滤，并在减压下浓缩，得到(
±
)-n-(吡咯烷-3-基甲基)-2-(三氟甲基)苯胺(
±
)-74的黄色油状物(0.360g)，用于下一步：esi ms m/z245[m+h]
+
。
[0302]
步骤c：向((
±
)-n-(吡咯烷-3-基甲基)-2-(三氟甲基)苯胺(
±
)-74(0.360g，1.16mmol)在thf(5ml)中的溶液中加入i-pr2net(0.61ml，3.48mmol)和2-氯-6-甲基嘧啶-4-甲酸甲酯(0.216g，1.16mmol)，所得混合物在n2气氛下回流搅拌16小时。将混合物冷却至室温，然后在减压下浓缩。所得残余物在硅胶(在己烷中0％-50％的etoac)上层析，得到(
±
)-6-甲基-2-(3-(((2-(三氟甲基)苯基)氨基)甲基)吡咯烷-1-基)嘧啶-4-甲酸甲酯(
±
)-75的白色固体(0.290g，63％)：1h nmr(400mhz,cdc13)δ7.43-7.40(m,1h),7.35-7.31(m,1h),7.00(s,1h),6.71-6.68(m,2h),4.40(brs,1h),3.91(s,3h),3.90-3.86(m,1h),3.79-3.58(m,1h),3.41-3.19(m,4h),2.68-2.62(m,1h),2.40(s,3h),2.22-2.16(m,1h),1.82-1.77(m,1h)；esi ms m/z 395[m+h]
+
。
[0303]
步骤d：向(
±
)-6-甲基-2-(3-(((2-(三氟甲基)苯基)氨基)甲基)吡咯烷-1-基)嘧啶-4-甲酸甲酯(
±
)-75，(0.110g，0.278mmol)在ch3oh(4ml)、thf(4ml)和h2o(2ml)中的溶液中加入lioh(56.9mg，2.37mmol)，并将混合物在室温下搅拌16小时。在减压下浓缩混合物以除去挥发性溶剂，所得水性混合物用额外的h2o(10ml)稀释，并用2n hcl水溶液酸化至ph＝3。酸化的混合物用etoac(3
×
50ml)萃取，合并的有机提取物用盐水(50ml)洗涤，用na2so4干燥，过滤，减压浓缩得到(
±
)-6-甲基-2-(3-(((2-(三氟甲基)苯基)氨基)甲基)吡咯烷-1-基)嘧啶-4-甲酸(
±
)-76的白色固体(90.0mg，68％)：1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ7.36-7.32(m，2h)，6.84-6.79(m，2h)，6.20(t，j＝7.6hz，1h)，5.53(brs，1h)，3.63-3.58(m，2h)，3.41-3.39(m，1h)，3.25-3.17(m，3h)，2.58-2.57(m，1h)，2.23(s，3h)，1.98-1.95(m，1h)，1.70-1.67(m，1h)；esi ms m/z 381[m+h]
+
；hplc》99％(auc)，tr＝14.5分钟。
[0304]
方案11
[0305][0306]
试剂和条件:(a)1-(溴甲基)-2-(三氟甲基)苯，nah，dmf，0℃至室温，16小时；(b)tfa，ch2cl2，0℃至室温，8小时；(c)2-氯-6-甲基嘧啶-4-甲酸甲酯，i-pr2net，thf，回流16小时；(d)(i)lioh，ch30h，thf，h2o，室温，16小时；(ii)2n hcl水溶液。
[0307]
实施例12:(
±
)-6-甲基-2-(3-((2-(三氟甲基)苄基)氧基)吡咯烷-1-基)嘧啶-4-甲酸(
±
)-80。
[0308]
步骤a：向3-羟基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(
±
)-22(0.500g，2.67mol)在dmf(5ml)中的0℃冷却溶液中加入nah(0.267g，6.68mmol)。将混合物在0℃在n2气氛下搅拌30分钟，然后加入1-(溴甲基)-2-(三氟甲基)苯(0.766g，3.20mmol)，将所得混合物搅拌16小时，同时逐渐升温至室温。将混合物冷却回0℃，并通过用h2o(20ml)稀释小心淬灭。水性混合物用etoac(3
×
30ml)萃取，合并的有机提取物用h2o(3
×
30ml)和盐水(30ml)洗涤，用na2so4干燥，过滤，减压浓缩得到(
±
)-3-((2-(三氟甲基)苄基)氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(
±
)-77的灰白色固体(0.900g，97％粗产率)，用于下一步：esi ms m/z 346[m+h]
+
。
[0309]
步骤b：向(
±
)-3-((2-(三氟甲基)苄基)氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(
±
)-77(0.900g 2.61mmol)在ch2cl2(5ml)中的0℃冷却溶液中加入tfa(2.0ml，26.0mmol)，所得溶液搅拌8小时，同时逐渐升温至室温。小心地将混合物倒入饱和nahco3水溶液(30ml)中进行中和。分离双相混合物，用ch2cl2(3
×
30ml)进一步萃取水层。合并的有机提取物用盐水(30ml)洗涤，用na2so4干燥，过滤，减压浓缩，得到(
±
)-3-((2-(三氟甲基)苄基)氧基)吡咯烷(
±
)-78的白色固体(0.450g，70％粗产率)：esi ms m/z 246[m+h]
+
。
[0310]
步骤c:向(
±
)-3-((2-(三氟甲基)苄基)氧基)吡咯烷(
±
)-78(0.100g，0.407mmol)在thf(5ml)中的溶液中加入i-pr2net(0.25ml，1.23mmol)和2-氯-6-甲基嘧啶-4-甲酸甲酯(76.2mg，0.408mmol)，所得溶液在80℃在n2气氛下搅拌16小时。将混合物冷却至室温，然后在减压下浓缩。所得残余物在硅胶(在己烷中0％-50％的etoac)上层析，得到
(
±
)-6-甲基-2-(3-((2-(三氟甲基)苄基)氧基)吡咯烷-1-基)嘧啶-4-甲酸甲酯(
±
)-79的白色固体(0.110g，68％)：1h nmr(400mhz，丙酮-d6)δ7.75-7.68(m，2h)，7.62(t，j＝7.2hz，1h)，7.47(t，j＝7.6hz，1h)，6.97(s，1h)，4.78-4.76(m，2h)，4.41-4.39(m，1h)，3.85(s，3h)，3.74-3.66(m，4h)，2.36(s，3h)，2.31-2.04(m，2h)；esi ms m/z 396[m+h]
+
。
[0311]
步骤d：向(
±
)-6-甲基-2-(3-((2-(三氟甲基)苄基)氧基)吡咯烷-1-基)嘧啶-4-甲酸甲酯(
±
)-79(90.0mg，0.228mmol)在ch3oh(4ml)、thf(4ml)和h2o(2ml)中的溶液中加入lioh(54.5mg，2.28mmol)，混合物在室温下搅拌16小时。将混合物减压浓缩，用额外的h2o(10ml)稀释所得水层，并用2n hcl水溶液酸化至ph＝3。混合物用etoac(3
×
30ml)萃取，合并的有机提取物用盐水(30ml)洗涤，用na2so4干燥，过滤，减压浓缩，得到(
±
)-6-甲基-2-(3-(2-(三氟甲基)苄基)氧基)吡咯烷-1-基)嘧啶-4-甲酸(
±
)-80的白色固体(60.0mg，85％)：1h nmr(400mhz，dmso-d6)；7.67-7.59(m，3h)，7.47-7.45(m，1h)，6.90(s，1h)，4.64-4.58(m，2h)，4.28-4.23(m，1h)，3.66-3.46(m，4h)，2.25(s，3h)，2.05-98(m，2h)；esi ms m/z382[m+h]
+
；hplc 98.1％(auc)，tr＝14.4分钟。
[0312]
方案12
[0313][0314]
试剂和条件：(a)取代的苯酚，cs2co3，dmf，80℃，16小时；(b)tfa，ch2cl2，0℃至室温，8小时；(c)2-氯-6-甲基嘧啶-4-甲酸甲酯，i-pr2net，thf，回流16小时；(d)(i)lioh，ch3oh，thf，h2o，室温，16小时；(ii)2n hcl水溶液。
[0315]
实施例13:(
±
)-2-(3-((2-(叔丁基)苯氧基)甲基)吡咯烷-1-基)-6-甲基嘧啶-4-甲酸(
±
)-83。化合物(
±
)-83由2-(叔丁基)苯酚和(
±
)-3-((甲苯酰氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(
±
)-40根据合成(
±
)-44的类似程序制备：1h nmr(400mhz，cdcl3)δ7.28(d，j＝8.0hz，1h)，7.17-7.12(m，2h)，6.91-6.82(m，2h)，4.06-4.00(m，3h)，3.93-3.82(s，1h)，3.63-3.51(m，2h)，2.93-2.90(m，1h)，2.44(s，3h)，2.31-2.28(m，1h)，2.00-1.98(m，1h)，1.38(s，9h)；esi ms m/z 370[m+h]
+
；hplc 96.4％(auc)，tr＝16.2分钟。
[0316]
实施例14:(
±
)-2-(3-((2-环戊基苯氧基)甲基)吡咯烷-1-基)-6-甲基嘧啶-4-甲酸(
±
)-84。化合物(
±
)-84由2-环戊基苯酚和(
±
)-3-((甲苯磺酰氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(
±
)-40根据合成(
±
)-44所述的类似步骤制备：1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ7.16-7.07(m，j＝8.0hz，2h)，6.94(s，1h)，6.90(d，j＝7.6hz，1h)，6.83(t，j＝7.2hz，1h)，3.98(d，j＝6.4hz，2h)，3.76-3.63(m，2h)，3.53-3.39(m，2h)，3.22-3.15(m，1h)，2.77-2.71(m，1h)，2.32(s，3h)，2.17-2.11(m，1h)，1.90-1.83(m，3h)，1.68-1.66(m，2h)，1.61-1.44(m，
nmr(400mhz，cdcl3)δ7.47(d，j＝8.8hz，1h)，6.94(s，1h)，6.75(s，1h)，6.58(d，j＝8.4hz，1h)，4.13-4.07(m，2h)，3.79(s，3h)，3.74-3.64(m，2h)，3.51-3.45(m，1h)，3.36-3.31(m，1h)，2.73-2.70(m，1h)，2.31(s，3h)，2.12-2.08(m，1h)，1.87-1.80(m，1h)；esi ms m/z412[m+h]
+
；hpl c》99％(auc)，tr＝14.6分钟。
[0323]
实施例21:(
±
)-2-(3-((3,5-双(三氟甲基)苯氧基)甲基)吡咯烷-1-基)-6-甲基嘧啶-4-甲酸(
±
)-91。化合物(
±
)-91由3,5-双(三氟甲基)苯酚和(
±
)-3-((甲苯磺酰氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(
±
)-40根据合成(
±
)-44所述的类似步骤制备：1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ7.61-7.59(m，3h)，6.94(s，1h)，4.23-4.14(m，2h)，3.76-3.71(m，1h)，3.69-3.63(m，1h)，3.53-3.47(m，1h)，3.42-3.38(m，1h)，2.78-2.71(m，1h)，2.32(s，3h)，2.16-2.08(m，1h)，1.89-1.81(m，1h)；esi ms m/z 450[m+h]
+
；hplc 97.0％(auc)，tr＝16.0分钟。
[0324]
实施例22:(
±
)-6-甲基-2-(3-((4-(三氟甲基)吡啶-3-基)氧基)甲基)吡咯烷-1-基)嘧啶-4-甲酸(
±
)-92。化合物(
±
)-92由4-(三氟甲基)吡啶-3-醇和(
±
)-3-((甲苯磺酰氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(
±
)-40根据合成(
±
)-44所述的类似步骤制备：1h nmr(400mhz，cdc13)δ8.44(s，1h)，8.37(d，j＝4.8hz，1h)，7.43(d，j＝4.8hz，1h)，7.13(s，1h)，4.21-4.20(m，2h)，3.87-3.78(m，2h)，3.65-3.64(m，1h)，3.54-3.49(m，1h)，2.93-2.86(m，1h)，2.44(s，3h)，2.29-2.24(m，1h)，2.02-97(m，1h)；esi ms m/z 383[m+h]
+
；hplc》99％(auc)，tr＝12.6分钟。
[0325]
实施例23:(
±
)-6-甲基-2-(3-(((2-(三氟甲基)吡啶-3-基)氧基)甲基)吡咯烷-1-基)嘧啶-4-甲酸(
±
)-93。化合物(
±
)-93由2-(三氟甲基)吡啶-3-醇和(
±
)-3-((甲苯磺酰氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(
±
)-40根据合成(
±
)-44所述的类似步骤制备：1h nmr(400mhz，cdc13)δ8.26(d，j＝4.4hz，1h)，7.45-7.42(m，1h)，7.34(d，j＝8.4hz，1h)，7.13(s，1h)，4.11-4.07(m，2h)，3.86-3.85(m，2h)，3.63-3.61(m，1h)，3.51-3.47(m，1h)，2.91-2.84(m，1h)，2.44(s，3h)，2.28-2.25(m，1h)，2.00-97(m，1h)；esi ms m/z 383[m+h]
+
；hplc 99.0％(auc)，tr＝12.7分钟。
[0326]
方案13
[0327][0328]
试剂和条件：(a)(i)2-氯嘧啶-4-甲酸甲酯，i-pr2net，thf，回流16小时；(ii)lioh，ch3oh，h2o，室温，16小时；(iii)2n hcl水溶液；(b)(i)6-氯-4-甲基吡啶甲酸甲酯，xantphos，pd2(dba)3，cs2co3，1，4-二恶烷，80℃，16小时；(ii)lioh，ch3oh，h20，室温，16小时；(iii)2n hcl水溶液；(c)(i)6-氯吡啶甲酸甲酯，xantphos，pd2(dba)3，cs2co3，1，4-二恶烷，80℃，16小时；(ii)lioh，h20，ch3oh，thf，室温，16小时；(iii)2n hcl水溶液；(d)(i)2-氯烟酸甲酯，xantphos，pd2(dba)3，cs2co3，1，4-二恶烷，80℃，16小时；(ii)lioh，h20，ch3oh，thf，室温，16小时；(iii)2n hcl水溶液；(e)(i)3-溴-4-氟苯甲酸甲酯，xphos，pd2(dba)3，cs2co3，1，4-二恶烷，110℃，16小时；(ii)lioh，h20，ch3oh，thf，室温，16小时；(iii)2nhcl水溶液。
[0329]
实施例24:(
±
)-2-(3-((2-(三氟甲基)苯氧基)甲基)吡咯烷-1-基)嘧啶-4-甲酸(
±
)-94。化合物(
±
)-94由2-氯嘧啶-4-甲酸甲酯和(
±
)-3-((2-(三氟甲基)苯氧基)甲基)吡咯烷(
±
)-42根据合成(
±
)-44所述的类似步骤制备：1h nmr(400mhz，dmso-d6)δ8.50(d，j＝4.8hz，1h)，7.61-7.57(m，2h)，7.26(d，j＝8.4hz，1h)，7.06(t，j＝7.6hz，1h)，7.00(d，j＝5.2hz，1h)，4.15(brs，2h)，3.77-3.63(m，2h)，3.53-3.47(m，1h)，3.37-3.33(m，1h)，2.79-2.72(m，1h)，2.17-2.09(m，1h)，1.90-1.83(m，1h)；esi ms m/z 368[m+h]
+
；hplc》99％(auc)，tr＝14.3分钟。
[0330]
实施例25:(
±
)-4-甲基-6-(3-(2-(三氟甲基)苯氧基)甲基)吡咯烷-1-基)吡啶甲酸(
±
)-95。步骤a：向(
±
)-3-((2-(三氟甲基)苯氧基)甲基)吡咯烷(
±
)-42(0.200g，0.815mmol)、6-氯-4-甲基吡啶甲酸甲酯(0.151g，0.815mmol)和cs2co3(0.796g，2.44mmol)在n2脱气无水1,4-二恶烷(10ml)中的混合物中加入xantphos(0.153g、0.265mmol)和pd2(dba)3(74.6mg，0.082mmol)。将混合物在密封容器中在80℃下加热16小时。将反应混合物冷却至室温，然后用h2o(30ml)稀释，并用etoac(3
×
50ml)萃取。合并的有机提取物用h2o(3
×
50ml)、盐水(50ml)洗涤，用na2so4干燥，过滤，减压浓缩.所得残余物在硅胶(在己烷中的0％-50％的etoac)上层析，得到(
±
)-4-甲基-6-(3-((2-(三氟甲基)苯氧基)甲基)吡咯烷-1-基)吡啶甲酸甲酯的灰白色固体(0.180g，56％)：1h nmr(400mhz，cdc13)δ7.54(d，j＝
7.6hz，1h)，7.44(t，j＝8.0hz，1h)，7.23-7.20(m，1h)，7.00-6.92(m，2h)，6.34(s，1h)，4.08-3.99(m，2h)，3.89(s，3h)，3.76-3.99(m，2h)，3.72(m，1h)，3.69-3.63(m，1h)，3.55-3.49(m，1h)，3.40-3.36(m，1h)，2.89-2.82(m，1h)，2.27(s，3h)，2.25-2.18(m，1h)，2.00-1.93(m，1h)；esi ms m/z 395[m+h]
+
。
[0331]
步骤b:向(
±
)-4-甲基-6-(3-((2-(三氟甲基)苯氧基)甲基)吡咯烷-1-基)吡啶甲酸甲酯(0.190g，0.481mmol)在ch3oh(6ml)、thf(6ml)和h2o(3ml)中的溶液中加入lioh(0.115g，4.81mmol)，混合物在室温下搅拌16小时。减压浓缩混合物以除去挥发性溶剂，用额外的h2o(10ml)稀释所得的含水混合物，并用2n hcl水溶液酸化至ph＝3。用etoac(3
×
20ml)萃取酸化的混合物，用盐水(20ml)洗涤合并的有机提取物，用na2so4干燥，过滤，减压浓缩，得到(
±
)-2-(3-((2-(三氟甲基)苯氧基)甲基)吡咯烷-1-基)嘧啶-4-甲酸(
±
)-95的白色固体(0.136g，77％)：1h nmr(400mhz，dmso-d6)；7.57-7.54(m，2h)，7.15(d，j＝8.4hz，1h)，7.05-7.01(m，2h)，6.18(s，1h)，4.02-3。92(m，2h)，3.68-3.46(m，3h)，3.34-3.32(m，1h)，2.64-2.61(m，1h)，2.13(s，3h)，2.10-2.01(m，1h)，1.81-1.68(m，1h)；esi ms m/z 381[m+h]
+
；hplc》99％(auc)，tr＝12.8分钟。
[0332]
实施例26：(
±
)-6-(3-((2-(三氟甲基)苯氧基)甲基)吡咯烷-1-基)吡啶甲酸(
±
)-96。化合物(
±
)-96由6-氯吡啶甲酸甲酯和(
±
)-3-((2-(三氟甲基)苯氧基)甲基)吡咯烷(
±
)-42根据合成(
±
)-95所述的类似步骤制备：1h nmr(400mhz，cdcl3)；7.63-7.54(m，2h)，7.46-7.42(m，2h)，7.00-6.95(m，2h)，6.62-6.60(m，1h)，4.10-4.04(m，2h)，3.77-3.60(m，2h)，3.51-3.39(m，2h)，2.92-2.80(m，1h)，2.25-2.22(m，1h)，2.08-96(m，1h)；esi ms m/z 367[m+h]
+
；hplc 95.8％(auc)，tr＝12.7分钟。
[0333]
实施例27:(
±
)-2-(3-((2-(三氟甲基)苯氧基)甲基)吡咯烷-1-基)烟酸(
±
)-97。化合物(
±
)-97由2-氯烟酸甲酯和(
±
)-3-((2-(三氟甲基)苯氧基)甲基)吡咯烷(
±
)-42根据合成(
±
)-95所述的类似步骤制备：1h nmr(400mhz，cdcl3)δ8.40(d，j＝4.4hz，1h)，8.23(d，j＝7.6hz，1h)，7.52(d，j＝7.6hz，1h)，7.47-7.43(m，1h)，7.00-6.91(m，3h)，4.10-4.02(m，2h)，3.61-3.37(m，4h)，2.93-2.86(m，1h)，2.29-2.21(m，1h)，1.98-1.89(m，1h)；esi ms m/z 367[m+h]
+
；hplc 98.3％(auc)，tr＝12.0分钟。
[0334]
实施例28:(
±
)-4-氟-3-(3-((2-(三氟甲基)苯氧基)甲基)吡咯烷-1-基)苯甲酸(
±
)-98。
[0335]
步骤a：向(
±
)-3-((2-(三氟甲基)苯氧基)甲基)吡咯烷(
±
)-42(0.300g，1.22mmol)和3-溴-4-氟苯甲酸甲酯(0.342g，1.47mmol)在n2脱气的1,4-二恶烷中的混合物中加入cs2co3(1.2g，3.66mmol)、xphos(58.1mg，0.12mmol)和pd2(dba)3(37.9mg，0.037mmol)。将混合物在密封容器中于110℃下搅拌16小时，然后冷却至室温。减压浓缩混合物，所得残留物在硅胶(在己烷中0％-40％的etoac)上色谱分离，得到4-氟-3-(3-((2-(三氟甲基)苯氧基)甲基)吡咯烷-1-基)苯甲酸甲酯的为白色固体(0.198mg，41％)：1h nmr(400mhz，cdc13)δ7.54(d，j＝7.6hz，1h)，7.45(t，j＝7.6hz，1h)，7.37-7.32(m，2h)，7.00-6.95(m，3h)，4.04(d，j＝7.2hz，2h)，3.85(s，3h)，3.64-3.59(m，1h)，3.52-3.46(m，2h)，3.40-3.35(m，1h)，2.85-2.81(m，1h)，2.22-2.17(m，1h)，1.93-1.88(m，1h)；esi ms m/z 398[m+h]
+
。
[0336]
步骤b：向4-氟-3-(3-((2-(三氟甲基)苯氧基)甲基)吡咯烷-1-基)苯甲酸甲酯
(0.120g，0.63mmol)在ch3oh(4ml)、thf(4ml)和h2o(2ml)混合物的溶液中加入lioh(0.144g，6.04mmol)。混合物在室温下搅拌16小时，减压浓缩除去挥发性溶剂。所得水层用h2o(50ml)稀释，并用2n hcl水溶液酸化至ph＝3。用水性混合物用etoac(3
×
50ml)提取，合并的有机提取物用盐水洗涤，用na2so4干燥，过滤，减压浓缩得到4-氟-3-(3-((2-(三氟甲基)苯氧基)甲基)吡咯烷-1-基)苯甲酸(
±
)-98的白色固体(78.0mg，67％):δ7.59-7.55(d，j＝7.6hz，2h)，7.24-7.20(m，3h)，7.13-7.02(m，2h)，4.13-4.07(m，2h)，3.52-3.48(m，1h)，3.39(brs，2h)，3.29-3.25(m，1h)，2.73-2.70(m，1h)，2.11-2.08(m，1h)，1.81-176(m，1h)；esi ms m/z 384[m+h]
+
；hplc 98.5％(auc)，tr＝16.1分钟。
[0337]
方案14
[0338][0339]
试剂和条件：(a)甲磺酰胺，hbtu，i-pr2net，dmf，室温，18小时；(b)nh4c1，hbtu，i-pr2net，dmf，室温，18小时；(c)nhch3˙
hcl，t3p，i-pr2net，dmf，室温，18h；(d)环丙胺，hbtu，i-pr2net，dmf，室温，18小时。
[0340]
实施例29:(
±
)-6-甲基-n-(甲基磺酰基)-2-(3-((2-(三氟甲基)苯氧基)甲基)吡咯烷-1-基)嘧啶-4-甲酰胺(
±
)-99。步骤a：向6-甲基-2-(3-((2-(三氟甲基)苯氧基)甲基)吡咯烷-1-基)嘧啶-4-甲酸(
±
)-44(50.0mg，0.131mmol)、hbtu(74.5mg，0.197mmol)和i-pr2net(0.08ml，0.393mmol)在dmf(4ml)中的混合物中加入甲磺酰胺(19.1mg，0.197mmol)。将所得溶液在室温下在n2气氛下搅拌18小时。混合物用h2o(10ml)稀释并用etoac(3
×
20ml)萃取。合并的有机提取物用h2o(3
×
20ml)和盐水洗涤，用na2so4干燥，过滤，减压浓缩。将所得粗残留物在硅胶上(在己烷中的0％-80％etoac)层析，得到6-甲基-n-(甲磺酰基)-2-(3-((2-(三氟甲基)苯氧基)甲基)吡咯烷-1-基)嘧啶-4-羧酰胺(
±
)-99的白色固体(30.0mg，50％)：1h nmr(400mhz，丙酮-d6)δ10.36(brs，1h)，7.61-7.57(m，2h)，7.27-7.25(m，1h)，7.10-7.06(m，2h)，4.23(brs，2h)，3.92-3.82(m，2h)，3.65-3.49(m，2h)，3.34(s，3h)，2.92-2.82(m，2h)，2.42(s，3h)，2.25-2.22(m，1h)；esi ms m/z 459[m+h]
+
；hplc 98.4％(auc)，tr1-基)嘧啶-4-甲酰胺(
±
)-100(0.200g，0.526mmol)、nan3(0.142g，0.375mmol)和四氯硅烷(98.5mg，0.579mmol)在ch3cn(4ml)中的混合物在密封容器中在80℃搅拌18小时。使反应混合物冷却至室温，并用饱和nahco3(5ml)稀释。水性混合物用chcl3(3
×
50ml)萃取，合并的有机提取物用盐水(50ml)洗涤，用na2so4干燥，过滤，减压浓缩。所得残留物在硅胶上(在ch2cl2中0-10％的ch3oh)层析得到4-甲基-6-(2h-四唑-5-基)-2-(3-((2-(三氟甲基)苯氧基)甲基)吡咯烷-1-基)嘧啶(
±
)-103的白色固体(66.0mg，30％)：1h nmr(400mhz，丙酮-d6)δ7.62-7.58(m，2h)，7.28-7.25(m，2h)，7.08(t，j＝7.6hz，1h)，4.28-4.21(m，3h)，3.91-3.86(m，1h)，3.80-3.74(m，1h)，3.65-3.58(m，1h)，3.52-3.47(m，1h)，2.92-2.85(m，1h)，2.42(s，3h)，2.27-2.21(m，1h)；esi ms m/z 406[m+h]
+
：hplc 97.4％(auc)，tr＝14.6分钟。
[0348]
实施例34：化合物与rbp4的体外结合。化合物与rbp4的结合在先前描述的辐射闪烁邻近度(spa)测定中评估(cioffi，c.l.等，2014；cioffi、c.l.等，2015；cioffi，c.l.等，2019)。该测定测定了从人尿中纯化的天然rbp4(fitzgerald，30r-ar022l)中放射性标记的视黄醇的竞争性置换。按照制造商的建议，使用thermofisher的ez-link sulfo-nhs lc生物素化试剂盒(cat#21335)对蛋白质进行生物素化。在spa缓冲液(1xpbs，ph 7.4，1mm edta，0.1％bsa，0.5％chaps)中以100μl的最终体积进行结合测定。测定反应包括放射性配体，10nm3h-视黄醇(48.7ci/mmol；perkinelmer，waltham，ma)，以及0.3mg/孔streptavidin-pvt珠(perkinelmer，rpnq0006)和50nm生物素化人类的rbp4。将20μm的未标记视黄醇(sigma，cat#95144)添加到对照孔中以评估非特异性结合。在室温(rt)温和摇动下培养16小时后，使用chameleon平板读取器(hidex oy，turku，finland)测量放射性计数。
[0349]
实施例35：htrf rbp4-ttr相互作用试验中拮抗活性的评估。
[0350]
类似物作为全反式视黄醇依赖性rbp4-ttr相互作用的拮抗剂的能力在htrf(同源时间分辨荧光)测定中进行了测量，如之前所述(cioffi，c.l.等,2014；cioffi、c.l.等,2015；cioffi，c.l.等,2019)。未标记的ttr(calbiochem，cat#529577)和在大肠杆菌中表达的麦芽糖结合蛋白标记的rbp4用于该测定。使用cisbio的htrf cryptate标记试剂盒(cisbio，cat#62euspea，bedfored，ma)用eu
3+
cryptate来标记ttr。在含有10mm tris-hcl ph 7.5、1mm dtt、0.05％np-40、0.05％prionex、6％甘油和400mm kf的缓冲液中，以16μl的最终测定体积进行测定。反应混合物的其它组分包括60nm mbp-rbp4，5nm ttr-eu，26.7nm与d2(cisbio，cat#61mbpdaa)缀合的抗-mbp抗体，和1μm全反式视黄醇(sigma，cat#95144)。所有的反应在暗处暗红光下进行。在4℃培养过夜后，在spectramax m5e多模式平板阅读器(molecular devices，sunnyvale，ca)中阅读平板。在337nm激发荧光；在668和620nm测量发射，计数延迟为75μs。htrf信号表示为荧光强度的比率：flu
668
/flu
620 x 10,000。
[0351]
实施例36：荧光偏振ttr四聚体结合测定。
[0352]
在荧光偏振测定中评估化合物与ttr的结合。该测定测量了荧光探针fitc-双氯芬酸从人类血浆(clabiochem millipore，cat#52957)中分离的ttr的竞争性位移。fitc-双氯芬酸在leadgen labs，llc按照公开的程序(alhamadsheh，m.m.等，2011)合成。每个孔含有在fp缓冲液中(10mm tris-hcl ph 7.5，150mm nacl，0.01％chaps，0.01％prionex)的200nm ttr和100nm fitc-双氯芬酸以及测试化合物。在500μμ未标记双氯芬酸(sigma-aldrich)存在下测定非特异性结合。与测试化合物的反应在4℃下培养过夜，并在spectramaxm5e平板读取器(molecular devices)上测量fp。
[0353]
表1，所选化合物的rbp4 spa结合亲和力，rbp4-ttr htrf和ttr荧光偏振数据。
[0354][0355]
[0356]
在固定10nm浓度的3h-视黄醇存在下获得spa测定的aic
50
值。在1m浓度的视黄醇存在下获得的htrf测定的bic
50
值。在固定25μμ浓度的异硫氰酸荧光素(fitc)-偶联ttr fp探针存在下获得的荧光偏振(fp)测定的cic
50
值。d对于多次(两次以上)测试的化合物，ic
50
数据表示为平均值
±
标准偏差。对于那些只测试了两次次的化合物，ic
50
数据显示为两个独立实验的平均值，而不是平均值
±
标准偏差。nd＝未确定。
[0357]
实施例37：ttr聚集测定。
[0358]
在有利于ttr聚集和原纤维形成的酸性条件下评估测试化合物防止ttr聚集的能力。将167μμ人类ttr(acrobiosystems#h5223)的2μl溶液与ph 4.0的7μl 50mm乙酸钠(sigma#s7545)、100mm kc1(sigma#s5405)在存在或不存在1μl ttr抑制剂的情况下在37℃下培养72小时。在培养结束时，将ph＝8.0的3.5μl 500mm磷酸钠(sigma#s5136)缓冲液添加到每个样品中中和，并将0.6μl 5％chaps(sigma#c5070)作为洗涤剂以防止蛋白质再结合。通过添加1.5μl 5％戊二醛溶液(sigma#g6257)进行交联。4分钟后，加入2.5μl新鲜制备的5％nabh4停止反应。用前白蛋白抗体(1:500；dako#a0002)对样品进行ttr蛋白质印迹。ttr单体和ttr聚集体的带强度从印迹的扫描图像中定量。
[0359]
体外adme测定信息
[0360]
实施例38：动力学溶解度测定
[0361]
化合物(
±
)-44在pbs(ph 7.4)中的动力学水溶性测定通过eurofins使用uv检测(230nm)进行。通过比较含有有机溶剂(甲醇/水，60/40，v/v)的校准标准(200μμ)中主峰的峰面积与缓冲样品中相应峰的峰面积来测定水溶性(μμ)。此外，色谱纯度(％)被定义为主峰的峰面积相对于校准标准品的hplc色谱图中的总积分峰面积。生成了每种测试化合物的校准标准品的色谱图，以及具有标记吸光度最大值的uv/vis光谱。
[0362]
用于动力学溶解性研究的标准：
[0363]
美托洛尔-192.6μm
[0364]
利福平-200μm
[0365]
酮康唑-152.8μm
[0366]
苯妥英-101.81μm
[0367]
辛伐他汀-14.2μm
[0368]
二乙基芪甾醇-7.0μm
[0369]
他莫昔芬-1.9μm
[0370]
实施例39:cyp450抑制试验
[0371]
化合物(
±
)-44对人类细胞色素p450(gyp)亚型2c9、2c19、2d6和3a4的抑制电位(ic50值)结果。每个重组人类gyp亚型都用标准阳性和阴性对照进行测试，使用荧光检测来测量gyp活性。各标准抑制剂的ic
50
测量值均在各亚型的预期范围内(见下文)。
[0372]
标准cyp抑制剂的ic
50
浓度：
[0373]
cyp抑制剂ic
50
(μm)：
[0374]
2c9磺胺吩唑ic
50
＝3.4μm
[0375]
2c19氨甲酰基环丙胺ic
50
＝2.8μm
[0376]
2d6奎宁定ic
50
＝0.058μm
[0377]
3a4酮康唑ic
50
＝0.0084μm
[0378]
预先配制的nadph再生溶液，重组cyp亚型2c19和3a4(批号分别为#3007790和2276593)、3-[2-(n，n-二乙基-n-甲胺基)乙基]-7-甲氧基-4-甲基香豆素(ammc)、3-氰基-7-乙氧基香豆素(cec)和7-苄氧基-4-三氟甲基香豆素(bfc)自corning life sciences(bedford,ma)获得。重组cyp亚型2d6(批号#49242)从invitrogen(carlsbad，ca)获得。cyp亚型2c9(批号#0446966-1)从cayman chemical(ann arbor,mi)获得。7-甲氧基-4-三氟甲基香豆素(mfc)，反式-2-苯环丙胺hc1(tcp)、磺胺唑(sfz)、酮康唑(ktz)和奎尼丁(qdn)从sigma(st.louis,mo)获得。所有溶剂和缓冲液都是从商业来源获得的，并且在没有进一步纯化的情况下使用。
[0379]
方法：
[0380]
将测试化合物制备为10mm乙腈储备溶液。使用基于荧光的测定测试昆虫细胞微粒体(cyp2c9、cyp2c19、cyp2d6和cyp3a4)中cdna-表达的四种人类p450亚型测试化合物的抑制作用。使用每种测试化合物储备溶液在黑色微量滴定板中制备九种系列稀释液(浓度0-100μμ)，一式两份。该稀释系列在37℃下与各个gyp亚型和每个亚型的标准荧光探针底物一起培养。所加入的探针底物的浓度为每种cyp亚型的km值或接近km值。反应混合物包含磷酸钾缓冲液，ph7.4和nadph-再生体系。最终的反应体积为0.20ml，在适当的培养时间(15-45分钟)后，用75μl终止溶液(0.5m在乙腈中的tris碱)终止反应。在适当的激发和发射波长下进行荧光测量。还进行了不含测试化合物的重复对照孔、添加亚型之前含有停止溶液的重复空白孔以及含有各亚型标准抑制剂的稀释系列。ic50值使用四参数逻辑模型(剂量响应方程)与idbs软件(emeryville，ga)的xlfit5.2拟合的数据的非线性回归来计算，由浓度数据点的线性内插来支持，表明抑制水平约为未抑制率的50％。
[0381]
实施例40：血浆蛋白结合测定
[0382]
血浆蛋白结合(ppb)通过eurofins用hplc-uv/vis检测平衡透析血浆来测定pbs(ph7.4)中的化合物(
±
)-44。
[0383]
对照普萘洛尔在人、大鼠(sprague-dawley)、小鼠(cd-i)和狗(beagle)血浆中的平均血浆蛋白结合
[0384]
缓冲液和测试样品中测试化合物的峰面积用于根据以下公式计算结合百分比和回收率：
[0385][0386][0387]
其中：
[0388]
区域
p
＝蛋白质基质中分析物的峰面积
[0389]
区域b＝缓冲液中分析物的峰面积
[0390]
区域c＝对照样品中分析物的峰面积
[0391]
实施例41：代谢稳定性
[0392]
微粒体中的代谢稳定性
[0393]
在人，大鼠，小鼠和猴肝微粒体存在下进行新化合物和睾酮(阳性对照)的代谢稳定性测定结果。所示值为培养30分钟后母体剩余的百分比。所有测量一式两份。睾酮的测定
结果在可接受的范围内。
[0394]
微粒体中的代谢清除
[0395]
混合性别的人肝脏微粒体(批号#1710084)，雄性sprague-dawley大鼠肝脏微粒体(批号#1610290)，雄性cd-1小鼠肝脏微粒体(批号#1710069)和雄性犬齿目肝脏微粒体(批号#1510193)购自xenotech。反应混合物，减去nadph，按如下所述制备。将测试品以1μμ的最终浓度加入反应混合物中。对照化合物、睾酮与测试品同时进行单独反应。将反应混合物的等分试样(无辅因子)在37℃的振荡水浴中平衡3分钟。通过添加辅因子引发反应，混合物在37℃的振荡水浴中培养。在0、10、20、30和60时取出等分试样(100pl)。立即将测试品和睾酮样品与400μl含0.1％甲酸和内标物的冰冷50/50乙腈(acn)/h2o混合来终止反应。然后将样品混合并离心以沉淀蛋白质。使用电喷雾电离通过lc-ms/ms分析所有样品。将峰面积响应比(parr)与时间0时的parr内标进行比较，以确定每个时间点的剩余百分比。使用graphpad软件计算半衰期，拟合单相指数衰减方程。
[0396]
表2。(
±
)-44的体外adm等图谱。
[0397][0398]
在pbs(ph＝7.4)中测定的a动态溶解度。b微粒体固有间隙(cl
int
)；h＝人类；r＝大鼠；m＝小鼠；cyno＝食蟹猴。c肝脏微粒体代谢稳定性，在微粒体存在下培养30分钟后母体药物残留％；hlm＝人类肝微粒体；rlm＝大鼠肝微粒体；mlm＝小鼠肝脏微粒体；cyno lm＝食蟹猴肝微粒体。dcipa herg qpatch测定；在五点浓度-反应研究中测试化合物(n＝2)。e％ppb＝血浆蛋白结合；h＝人类，r＝大鼠，m＝小鼠。
[0399]
实施例42：体内pk测定
[0400]
小鼠pk研究信息和数据
[0401]
未用药的成年雄性cd-i小鼠通过静脉(iv)或口服管饲(po)剂量途径单剂量给药受试品。
[0402]
测试设备和测试地点：absorption systems，llc，436creamery way，suite600，exton，pa 19341-2556
[0403]
测试制品和服用赋形剂信息：
[0404]
iv服用赋形剂：3％dma/45％peg300/12％乙醇/40％无菌水
[0405]
po服用赋形剂：在0.9％盐水中的2％吐温80
[0406]
剂量制剂：剂量制剂的制备方法是(按列出的顺序)将加药车的各个成分逐步添加到称量数量的试验化合物中，使其达到所需的最终浓度。通过将称量数量的测试化合物与适当体积的载体混合来制备每种制剂。
[0407]
给药溶液分析：给药溶液通过lc-ms/ms分析。将给药溶液稀释到小鼠血液中，一式
三份进行分析。所有浓度以mg/ml游离碱表示。在组1的所有计算中使用标称剂量水平。
[0408]
测试系统：
[0409]
物种和品系：小鼠；雄性cd-1
[0410]
平均重量：iv臂0.034kg；po臂0.027kg
[0411]
编号：共6只动物(每次研究每次给药组(组1(iv)和组2(po))3只动物)
[0412]
顺应性：该非临床研究遵循吸收系统的已建立的实践和标准操作程序作为研究方案。本研究属于探索性研究，未按照美国食品和药物管理局(fda)《良好实验室规范》(glp)，第21章《联邦法规》(cfr)第58部分规定的原则进行。该报告在经过验证的科学数据管理系统中存档。电子签名符合21cfr第11部分的规定。
[0413]
实验设计：
[0414]
在给药前和给药后5，15和30分钟以及1，2，4，8，24和48小时从小鼠中收集血液。用乙腈通过蛋白质沉淀提取溶血的血样。在用乙腈提取蛋白质之后，通过lc-ms/ms测量化合物水平。从血液浓度的时间过程计算药物动力学参数。药代动力学参数用phoenix winnonlin(v8.0)软件使用非房室模型测定。iv给药后的最大血液浓度(c0)通过将前两个时间点外推回到t＝0来估计。从数据观察po给药后的最大血药浓度(cmax)和达到最大血药浓度(tmax)的时间。使用线性梯形规则计算时间浓度曲线(auc)下的面积，计算到最后一个可量化的数据点，如果适用，外推到无穷远。血液半衰期(t 1/2)由终止消除阶段的0.693/斜率计算。平均停留时间mrt通过将力矩曲线(aumc)下的面积除以auc来计算。清除率(cl)由剂量/auc计算。稳态分布体积(vss)由cl*mrt计算。通过将个体剂量归一化po auc
∞
值除以平均剂量归一化iv auc
∞
值来确定生物利用度。任何低于定量极限(1.00ng/ml)的样品被处理为零,用于药代动力学数据分析。
[0415]
表3小鼠iv和po给药后类似物(
±
)-44的体内pk数据。
[0416][0417]
数据表示为括号中的平均值和标准偏差(平均值(sd))。给药组由三只未用药的成年雄性cd-1小鼠组成。iv给药：以2mg/kg剂量给药供试品；测试品赋形剂＝3％dma/45％peg300/12％乙醇/40％无菌水；po给药：以5mg/kg剂量给药测试品，赋形剂＝0.9％盐水中2％吐温80，a观察到零点时血液中化合物的初始浓度。b总清除率。从血液中消除化合物的最后阶段的c表观半衰期。稳态下的分布d体积。从0到化合物在血液中可量化的最后一个时间点的血液浓度-时间曲线下的e面积。从0到无穷大的血液浓度-时间曲线下的f面积。血液中化合物的g最大观察浓度。血液中化合物的最大观察浓度的i时间。f生物利用度；f＝(auc
infpo
×
剂量
iv
)
÷
auc
infiv
×
剂量
po
)。
[0418]
实施例43：血清rbp4测定分析
[0419]
从尾静脉收集血样。将全部血样抽入离心管，在室温下凝固30分钟，然后在48℃下以2000g离心15分钟以收集血清。按照制造商的说明，使用rbp4(小鼠/大鼠)双elisa试剂盒(adipogen，san diego，ga)分析小鼠药代动力学研究中采集的血浆样品的等分试样的rbp4浓度。在adi-hrbp4转基因小鼠实验中，从尾静脉采集血样。将全部血样抽入离心管，室温下凝血30分钟，然后在+4℃下2000g离心15分钟收集血清。使用rbp4(小鼠/大鼠)双重elisa试剂盒(adipogen，san diego，ca；目录号ag-45a-0012ytp-ki01)测量小鼠血清rbp4(主要在肝脏中产生)
[0420]
动物护理和使用说明：本方案中的所有步骤都符合美国农业部门(usda)动物福利法(9cfr第1，2和3部分)；实验动物护理和使用指南，实验动物资源研究所，国家学院出版社，华盛顿，1996年；和国家卫生研究所，实验动物福利局。只要可能，本研究中的方法设计成避免或最小化动物的不适，痛苦和疼痛。
[0421]
实施例44(
±
)-44对abca4-/-小鼠眼睛内n-亚视黄基-n-视黄基-乙醇胺(a2e)积聚的影响
[0422]
将(
±
)-44配制成picolab 5053食物，以确保每日剂量为25mg/kg(
±
)44。在abca4-/-小鼠中进行配制成食物的化合物的长期12周给药。野生型129sl/svlmj小鼠的年龄匹配对照组保持在标准picolab 5053食物上。年龄匹配的小鼠参考组用于确定在没有abca4切除的情况下小鼠a2e的基础水平。在给药前和给药12周后，从(
±
)-44治疗组和对照组食物-治疗的abca4-/-小鼠中采集血样，以评估rbp4的血清水平。给药12周后，收集治疗和未治疗的abca4-/-小鼠以及参考野生型小鼠的眼杯，用于定量a2e分析。
[0423]
实施例45(
±
)-44对双敲除abca4-/-/rdh8-/-小鼠眼睛内n-亚视黄基-n-视黄基-乙醇胺(a2e)积累的影响。
[0424]
将(
±
)-44配制成picolab5053食物，以确保每天剂量为25mg/kg的(
±
)-44。在abca4-/-/rdh8-/-小鼠中进行配制成食物的化合物长期10周给药。野生型c57bl/6j小鼠的年龄匹配对照组保持在标准的picolab 5053食物上。在没有abca4和rdh8切除的情况下，使用年龄匹配的对照组小鼠来确定小鼠中a2e的基础水平。在给药前和给药10周后，从(
±
)-44治疗组和对照组食物治疗的abca4-/-小鼠中采集血样，以评估rbp4的血清水平。给药10周后，收集治疗和未治疗的abca4-/-/rdh8-/-小鼠以及参考野生型小鼠的眼杯，用于定量a2e分析。
[0425]
实施例46在双敲除abca4-/-/rdh8-/-小鼠模型中(
±
)-44赋予感光细胞部分保存
[0426]
将(
±
)-44配制成picolab 5053食物，以确保每天剂量为25mg/kg的(
±
)-44。在abca4-/-/rdh8-/-小鼠中进行配制成的食物的化合物长期10周给药。野生型c57bl/6j小鼠的年龄匹配对照组保持在标准的picolab 5053食物上。给药10周后，收集整个眼睛并固定在2％戊二醛/4％多聚甲醛中。将眼睛嵌入石蜡中并以8μm的厚度进行切片。使用苏木精和伊红(h&e)对切片进行反染色。进行形态学观察和光学显微镜检查。使用数字成像系统，在视神经头沿垂直子午线的边缘上方和下方200μm的间隔处测量外核层(onl)厚度，并乘以测量间隔。视网膜上部的多个点处可见光感受器保护(图11)。
[0427]
讨论
[0428]
我们在此描述了一类能够显示双重rbp4拮抗剂和ttr四聚体动力学稳定活性的新
型非类视黄醇双特异性化合物。在三种试验中对化合物进行了评估，这三种试验旨在测量(1)化合物对非ttr相关rbp4的结合亲和力(闪烁邻近试验，spa)，(2)化合物对未配体ttr四聚体的结合亲和力(荧光偏振试验，fp)，和(3)化合物功能拮抗剂对破坏结合型-视黄醇类结合蛋白4-甲状腺素运载蛋白复合物的效力(同质时间分辨荧光试验，htrf)。结果列于表1。化合物(
±
)-44在rbp4-spa结合亲和力和rbp4-ttr htrf功能性拮抗剂活性方面不如基准8((
±
)-44rbp4-sspa ic
50
＝80.0nm；rbp4-ttr htrf ic
50
＝0.25μμ)，然而，(
±
)-44确实对两个靶((
±
)-144ttr fp ic
50
＝2.85μμ)表现出有吸引力的双重活性平衡。对于(
±
)-44((r)-50rbp4 spa ic
50
＝65.0nm；(s)-56rbp4spa ic
50
＝150.0nm))的r-对映体，观察到rbp4 spa结合亲和力的对映体参考值约为2倍，但关于rbp4-ttr htrf或ttr fp活性，对映体之间没有区别。
[0429]
化合物(
±
)-44在磷酸盐缓冲盐水(pbs)(ph7.4)中表现出优异的动力学溶解性，并且观察到微粒体稳定性和cl
int
数值表明很低的预测的肝脏清除率(表2)。血浆蛋白结合百分比％(ppb)数据表明未结合的低部分(表2)。另外，(
±
)-44在标准cyp组中缺乏限制性抑制活性(表2)。重要的是，与先前报道的类似物8显示辅助ppary激动剂活性不同，发现(
±
)-44没有ppary激动活性(表2)。
[0430]
化合物(
±
)-44在给予cd-1雄性小鼠单剂量(2mg/kg iv和5mg/kg po)后，显示出非常低的血浆清除率(0.0499l/小时/kg)和9.9小时的半衰期(表3)。该化合物被很好地吸收并在口服给药后缓慢地从血浆中除去，观察到c
max
为3033ng/ml和相应的t
max
为0.83h(表3)。观察到非常高的暴露(auc
inf
为52439小时
˙
ng/ml)和估计的％f为52％。
[0431]
在单次25mg/kg口服剂量(
±
)-44后，在给药后6小时观察到血清rbp4最大降低81％(图5，a)。化合物给药对血清ttr水平没有影响(数据未示出)。体内血清rbp4减少的动力学表明，口服给药后循环中(
±
)-44的存在(图5，b)与血清rbp4的减少(图5,a)之间存在一般相关性。rbp4最大降低幅度(81％)和rbp4降低作用持续时间(24小时时降低64％)与化合物的药代动力学特性密切相关，如c
max
高、暴露时间长和清除速度慢(表3)。
[0432]
先前已经在不同类别的rbp4拮抗剂诱导血清rbp4降低的能力与abca4-/-小鼠视网膜脂褐素生成增强模型的临床前疗效之间建立了非常好的相关性(radu，r.a.等,2005；dobri，n.等,2013；racz，b.等,2018)。基于其非常好的rbp4降低活性，似乎有理由期望(
±
)-44能够有效减少视网膜中细胞毒性脂褐素类维甲酸的形成。
[0433]
体外抑制酸诱导的ttr聚集是一种用于表征ttr动力学稳定剂的已知方法(petrassi，h.m.等，2005；green，n.s.等，2005)。ttr在37℃和酸性条件下的长期72小时培养导致四聚体失稳和解离，随后部分单体变性并误组装成淀粉样原纤维和其它高分子量聚集体(hurshman，a.r.等，2004)。使用先前公布的方案改性和使用他法米迪和苯溴马隆作为阳性对照，通过其防止酸介导的ttr聚集体形成的能力评价化合物(
±
)-44作为动力学ttr稳定剂(klabund，t.等，2000；niemietz，c.等，2018)。他法米迪是一种有效的ttr动力学稳定剂，被批准用于治疗家族性淀粉样多发性神经病；而苯溴马隆，一种促尿酸药物，在我们之前的研究中发现在fp ttr结合试验中，实验证明其是一种有效的ttr配体，ic
50
为293nm，与本试验中报告的他法米迪的效力相当(penchala，s.c.等，2013)。与dmso在ph4.0下培养72小时后，ttr的高分子形式显著增加，而在中性ph下相似的培养期后没有观察到这种形式(图6，a)。类似于两种有效的ttr配体他法米迪和苯溴马隆(结构未示出)的活性，(
±
)-44显
著减少了高分子量ttr物质的形成(图6，a)，表明它可以作为ttr动力学稳定剂。与dmso相比，用他法米迪、苯溴马隆和(
±
)-44治疗的样品中ttr单体带的强度更高，反映了他法米迪和苯溴马隆以及(
±
)-44赋予ttr聚集的相应降低。对带强度的定量分析显示，分别由他法米迪，苯溴马隆和(
±
)-44诱导的高分子量聚集体的形成减少了3.6倍，5.6倍和4.7倍(图6，b)。与聚集体形成减少相关的ttr单体谱带强度的显著增加在用他法米迪，苯溴马隆和(
±
)-44治疗的样品中明显可见(图6，c)。总之，聚集实验的结果证实双特异性类似物(
±
)-44可用作ttr动力学稳定剂。
[0434]
abca4-/-小鼠模型用作评估抑制类类视色素二聚体形成速率的化合物的临床前功效的已建立模型(petrukhin，k.2013)。与基线野生型小鼠相比，abca44-/-小鼠长期(12周)每日给药25mg/kg(
±
)-44，导致12周时间点血清rbp4降低79％，与未经治疗的abca44-/-小鼠相比，血清rbp4减少82％(图7)。给药12周后，收集治疗和未治疗的abca4-/-小鼠以及参考野生型小鼠的眼杯，用于定量a2e分析。该分析显示，与对照食物治疗的abca4-/-小鼠相比，(
±
)-44治疗的abca4-/-鼠的a2e统计学上显著降低了约50％(p《0.0001)(图8)。缺乏abca4转运体和视黄醇脱氢酶8(rdh8)的小鼠将类视色素二聚体的增强积累引起的损伤与对视黄醛的增加暴露相结合(maeda，a.等，2008)。与基线相比，abca4-/-/rdh8-/-小鼠长期(10周)每日给药25mg/kg(
±
)-44导致10周时间点血清rbp4降低了76％(图9)。与未经治疗的abca4-/-/rdh8-/-小鼠相比，(
±
)-44治疗的abca4-/-/rdh8-/-小鼠在10周时的血清含量rbp4降低了84％。给药10周后，对经治疗和未经治疗的abca4-/-/rdh8-/-小鼠以及参考野生型小鼠的眼杯进行的分析表明，与对照食物治疗的abca4-/-/rdh8-/-小鼠相比，经(
±
)-44治疗的abca4-/-/rdh8-/-小鼠的a2e统计学上显著降低了77％(p《0.0001)(图10)。
[0435]
abca4-/-小鼠模型不能模拟眼底黄色斑点症病和干性amd，如感光细胞退化的某些重要方面。相比之下，缺乏abca4转运体和视黄醇脱氢酶8(rdh8)酶的小鼠，除了增加脂褐素类视色素二聚体的积累外，还会发生严重的光感受器退化。在abca4-/-/rdh8-/-小鼠模型中，(
±
)-44具有减少光感受器退化的能力。abca4-/-/rdh8-/-小鼠长期(10周)每日给药25mg/kg(
±
)-44，可在上视网膜的多个点产生光感受器保护(图11)。
[0436]
本文所述化合物显示具有可用于治疗上述适应症的性质。
[0437]
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技术特征：
1.一种具有以下结构的化合物：其中x是cr6或n；r1、r2、r3、r4、和r6各自独立地为-h、-f、-cl、-br、-i、-no2、-cn、-cf3、-cf2h、-ocf3、-(烷基)、-(卤代烷基)、-(烯基)、-(炔基)、-(芳基)、-(杂芳基)、-(环烷基)、-(环烷基烷基)、-(杂烷基)、杂环、杂环烷基、-(烷基杂烷基)、-(烷芳基)、-oh、oac、-o-(烷基)、-o-(烯基)、-o-(炔基)、-o-(芳基)、-o-(杂芳基)、-sh、-s(烷基)、-s(烯基)、-s-(炔基)、s-(芳基)、-s-(杂芳基)、-nh2、-nh-(烷基)、-nh-(烯基)、-n-(炔基)、-nh-(芳基)、-nh-(杂芳基)、-c(o)r7、-s(o)r6、so2r7、-nhso2r7、-oc(o)r7、-sc(o)r7、-nhc(o)r8或-nhc(s)r8，其中r7是h、-(烷基)、-oh、-o(烷基)，-nh2、-nh(烷基)或-n(烷基)2，和其中r8是-(烷基)、-0-(烷基)，-nh2，-nh(烷基)或n(烷基)2；y是0、s、n、nh或键；z是0、s、n、nh、(ch2)0或键；r
s
为h、oh、卤素、烷基，或r
s
为(ch2)
p
并与当y为n时与y结合与z一起形成环；o和p独立地为0、1、2或3；m和n独立地为0、1、2、3或4；a、c和d各自独立地为n或cr9；r9是h、卤素、-oh、烷基、环烷基、环烷基烷基、-o-(烷基)、-s-(烷基)，-nh2，-nh(烷基)-，nh(烷基)2，-co2h，-co(o-烷基)；b和e是n、cr9或cfg，其中b或e中的至少一个是cfg；e不存在或存在，当存在时为或g为h、取代或未取代的单环、双环、杂单环、杂双环、芳基、杂芳基、烷基、环烷基、环烷基烷基、co2h、coor
10
、oh、or
10
、nh2、nhr
10
、nr
10
r
11
、so2(烷基)、so2(环烷基)、so2(环烷基烷基)、ch2nhr
10
、ch2nr
10
r
11
或ch2coor
10
，
其中每个r
10
和r11各自独立地为h、烷基、环烷基、-c(o)-烷基、-c(o)-环烷基、-c(o)oh、-c(o)-o-烷基、-c(o)-o-环烷基、-c(o)nh2，-c(ο)nh(烷基)，-c(ο)nh(环烷基)，-c(ο)n(烷基)2，-ch2nh(烷基)，-ch2cooh，-so2ch3，-oh，-o(烷基)，-nh2，-nh(烷基)，-n(烷基)2，或其药学上可接受的盐。2.权利要求1的化合物，其中m是1或2，且n是0，1或2。3.权利要求1或2的化合物，其中m是1且n是1。4.权利要求1、2或3的化合物，其中y和z各自为独立地为ch2、0、s或nh。5.权利要求1-4中任一项的化合物，其中y是o且z是ch2。6.权利要求1-5中任一项的化合物，其中a和b是n，c和d是cr9，e是cfg；或其中a、b、c和d是cr9，且e是cfg；或其中a是n，b是cfg，c，d和e各自是cr9；或其中a是n，b、c和d各自是cr9，且e是cfg；或其中a、c和d各自为cr9，b为n，e为cfg。7.权利要求1-6中任一项的化合物，其中x是cr6或n；r1、r2、r3、r4和r6各自独立地为h、叔丁基、环戊基、环己基、cf3、f、cl、cn或-och3。8.权利要求1-7中任一项的化合物，其中r1或r4是cf3。9.权利要求1-8中任一项的化合物，其中x是cr6；r1为cf3，且r2、r3、r4和r6各自独立地为h、叔丁基、环戊基、环己基、cf3、f、cl、cn或-och3。10.权利要求1或2的化合物，具有以下结构：
其中c为cr9；r9为h、卤素、-oh、烷基、环烷基、环烷基烷基和-o-(烷基)、-s-(烷基)、-nh2、-nh(烷基)、-nh(烷基)2，-co2h，-co(o-烷基)；f不存在或存在，当存在时为或g是h、取代或未取代的单环、双环、杂单环、杂双环、芳基、杂芳基、烷基、环烷基、环烷基烷基、co2h、coor
10
、oh、or
10
、nh2、nhr
10
、nr
10
r
11
，so2(烷基)、so2(环烷基)、so2(环烷基烷基)、ch2nhr
10
、ch2nr
10
r
11
或ch2coor
10
，其中每个r
10
和r
11
各自独立地为h、烷基、环烷基、-c(o)-烷基、-c(0)-环烷基、-c(o)oh、-c(o)-o烷基、-c(o)-o环烷基、-c(o)nh2、-c(0)nh(烷基)、-c(0)nh(环烷基)、-c(o)n(烷基)2、-ch2nh(烷基)、-ch2cooh-、so2ch3、-oh、-o(烷基)、-nh2、-nh(烷基)、-n(烷基)2，或其药学上可接受的盐。11.权利要求10的化合物，其中c是cr9且r9是h、-烷基、-o(烷基)或-nh(烷基)。12.权利要求10或11中任一项的化合物，其中r9为-烷基。13.权利要求10-12中任一项的化合物，具有以下结构：
其中f是取代或未取代的杂芳基。14.根据权利要求13的化合物，其中f具有以下结构：且r
12
是h、-(烷基)、-(烯基)或-(炔基)。15.根据权利要求1所述的化合物，其具有以下结构：
其中c为cr9；r
s
为h、卤素、-oh、烷基、环烷基、环烷基烷基和-o-(烷基)，-s-(烷基)、-nh2、-nh(烷基)、-nh(烷基)2，-co2h，-co(o-烷基)；f不存在或存在，当存在时为：g是h、取代或未取代的单环、双环、杂单环、杂双环、芳基、杂芳基、烷基、环烷基、环烷基烷基、co2h、coor
10
、oh、or
10
、nh2、nhr
10
、nr
10
r
11
，so2(烷基)，so2(环烷基)，so2(环烷基烷基)、ch2nhr
10
、ch2nr
10
r
11
或ch2coor
10
，其中每个r
10
和r
11
各自独立地为h、烷基、环烷基、-c(o)-烷基、-c(o)-环烷基、-c(o)oh、-c(o)-o-烷基、-c-(o)-(环烷基)，-c(o)nh2，-c(o)nh(烷基)，-c(o)nh(环烷基),-c(ο)n(烷基)2,-ch2nh(烷基)，-ch2cooh-、so2ch3、-oh、-o(烷基)、-nh2、-nh(烷基)和-n(烷基)2、或其药学上可接受的盐。16.根据权利要求15的化合物，其中c为cr9且r9为h、-烷基、-o(烷基)或-nh(烷基)；或其中r9为-烷基。17.根据权利要求1所述的化合物，具有以下结构：
或该化合物的药学上可接受的盐。18.根据权利要求1的化合物，具有以下结构：或该化合物的药学上可接受的盐。19.权利要求1的化合物，其具有以下结构：
或该化合物的药学上可接受的盐。20.权利要求1的化合物，具有以下结构：或该化合物的药学上可接受的盐。21.权利要求1的化合物，具有以下结构：或该化合物的药学上可接受的盐。22.权利要求1的化合物，具有以下结构：
或该化合物的药学上可接受的盐。23.一种药物组合物，包含权利要求1-22中任一项的化合物和药学上可接受的载体。24.一种在哺乳动物中稳定ttr四聚体的方法，包括向所述哺乳动物施用对稳定ttr四聚体有效的一定量的权利要求1-22中任一项的化合物或权利要求23的组合物。25.一种以视网膜中过多脂褐素积聚、或ttr淀粉样变(attr)疾病，或以过多脂褐素和ttr淀粉状变(attt)疾病为特征的疾病的治疗方法，包括向哺乳动物施用有效量的权利要求1-22中任一项的化合物或权利要求23的组合物。26.权利要求25的方法，其中所述疾病是进一步以类视色素二聚体介导的黄斑变性为特征。27.权利要求24-26中任一项的方法，其中所述化合物的量有效地降低哺乳动物中rbp4的血清浓度，或者其中所述组合物的量有效降低哺乳动物中脂褐素中类视色素二聚体的视网膜浓度。28.权利要求24-27中任一项的方法，其中所述化合物的量有效地稳定哺乳动物中的ttr四聚体。29.权利要求26-28中任一项的方法，其中所述类视色素二聚体是a2e。30.根据权利要求26-28中任一项所述的方法，其中所述类视色素二聚体是异a2e。31.权利要求26-28中任一项的方法，其中所述类视色素二聚体是a2-dhp-pe。32.根据权利要求26-28中任一项所述的方法，其中所述类视色素二聚体为atraldi-pe。33.权利要求25-32中任一项的方法，其中特征在于视网膜中过多脂褐素积聚的疾病是年龄相关的黄斑变性。34.根据权利要求25-32中任一项所述的方法，其中特征在于视网膜中过多脂褐素积聚的疾病是干燥(萎缩)的年龄相关黄斑变性。35.权利要求25-32中任一项的方法，其中特征在于视网膜中过多脂褐素积聚的疾病是眼底黄色斑点症病。36.权利要求25-32中任一项的方法，其中特征在于视网膜中过多脂褐素过度积聚的疾病是best疾病。37.根据权利要求25-32中任一项所述的方法，其中特征在于视网膜中过多脂褐素积聚的疾病是成人卵黄状黄斑病变。38.权利要求25-32中任一项的方法，其中特征在于视网膜中过多脂褐素积聚的疾病是眼底黄色斑点症样黄斑营养不良。39.权利要求24-38中任一项的方法，其中所述施用有效地减少光感受器退化。
40.权利要求24-39中任一项的方法，其中所述方法进一步有效地稳定哺乳动物中的ttr四聚体。41.根据权利要求24-40中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物进一步患有ttr淀粉样变(attr)疾病，并且所述方法对治疗所述哺乳动物中的ttr淀粉状变(attt)疾病有效。42.权利要求41的方法，其中所述ttr淀粉样变(attr)疾病是老年性系统性淀粉样变性(ssa)。43.权利要求41的方法，其中所述ttr淀粉样变(attr)疾病是外周多发性神经病(attr-pn)。44.权利要求41的方法，其中所述ttr淀粉样变(attr)疾病是心肌病(attr-cm)。45.权利要求41的方法，其中所述ttr淀粉样变性(attr)疾病的特征在于淀粉样蛋白聚集体的沉积。

技术总结
视黄醇结合蛋白4的双特异性拮抗剂，及其制备，以及在治疗常见年龄相关合并症中的用途。途。途。


技术研发人员：康斯坦丁
受保护的技术使用者：奥尔巴尼医药与健康科学学院
技术研发日：2021.07.20
技术公布日：2023/8/1