大果桉醛I在制备肿瘤免疫治疗增效剂中的应用

大果桉醛i在制备肿瘤免疫治疗增效剂中的应用
技术领域
1.本发明涉及医药领域，特别是涉及大果桉醛i在制备肿瘤免疫治疗增效剂中的应用。


背景技术：

2.目前，对于实体肿瘤的治疗策略仍然是优先考虑行根治性手术治疗，放疗和化疗为辅，然而由于恶性实体肿瘤具有发展快、难发现以及手术根治不完全等因素，导致了扩散和转移，此时化疗将作为主要手段用于治疗。随着近年来靶向药物和免疫检查点治疗策略的开发，展示出了良好的疗效和安全性，因此靶向药物也被用于临床治疗。例如her2单抗被用于her2阳性的转移性胃癌患者以及乳腺癌患者，而在her2阴性pd-l1 cps≥5的患者中，pd-1单抗联合细胞毒性药物被用于一线治疗。尽管靶向药物的使用提高了一线治疗的效果和安全性，然而靶向治疗受限于靶标状态、个体遗传背景等因素导致适用人群并不广泛；传统细胞毒性化疗药物由于在杀伤肿瘤细胞的同时也能对正常细胞造成一定程度的损伤，会引起严重的毒副作用，因此在很大程度上限制了其使用；免疫检查点抑制剂在结直肠癌、胃癌、胰腺癌等实体瘤中疗效不佳，因此，寻找安全性佳、疗效好的免疫治疗增效药物，具有重要的意义。
3.大果桉醛i最初是从桉树叶中分离得到的一种天然产物，属于二甲酰间苯三酚类化合物。已有研究表明，大果桉醛类物质对龋齿、牙周病的各病原菌具有非常强的抗菌活性。有关大果桉醛i的抗肿瘤专利有cn108451937a，其公开了大果桉醛i在抑制结直肠癌中的应用。但是现有技术中未见有报道关于大果桉醛i在结直肠癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌治疗的应用，尤其是关于肿瘤免疫治疗增效的作用。


技术实现要素：

4.基于此，本发明的提供大果桉醛i在制备肿瘤免疫治疗增效剂中的应用。大果桉醛i可作为免疫治疗增效剂诱导多瘤种癌细胞免疫源性死亡，增强免疫检查点阻断疗法的治疗效果。
5.大果桉醛i在制备肿瘤免疫治疗增效剂中的应用。
6.进一步地，所述肿瘤包括结直肠癌、胃癌、胰腺癌或乳腺癌中任一种。
7.进一步地，所述大果桉醛i的起效浓度不低于170μm。
8.进一步地，所述大果桉醛i包括以下的任一种：a)结构式为式ⅰ所示的化合物；
式ⅰb) 与a化合物具有相同或相近药学活性或在体内水解得到的与a化合物具有相同或相近药学活性的药学上可接受的衍生物。
9.进一步地，所述药学上可接受的衍生物选自其药用盐、药用酯、药用醚、药用酰胺或糖基化物中的任一种。
10.大果桉醛i在制备pd-1抑制剂的增效药物中的应用。
11.大果桉醛i在制备抗肿瘤药物中的应用，所述肿瘤包括胃癌、胰腺癌或乳腺癌中任一种。
12.进一步地，所述大果桉醛i的浓度为100
ꢀ‑
300μm。
13.一种肿瘤免疫治疗药物，包括pd-1抑制剂和大果桉醛i。
14.进一步地，所述肿瘤免疫治疗药物的剂型为栓剂或灌肠剂。
15.相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：1）大果桉醛i可作为免疫治疗增效剂诱导多瘤种癌细胞免疫源性死亡，增强免疫检查点治疗效果。大果桉醛i与pd-1抑制剂联合用药能显著抑制肿瘤的生长。
16.2）大果桉醛i可以有效抑制胃癌、胰腺癌、乳腺癌细胞增殖和侵袭，可作为天然抗肿瘤小分子药物应用于对胃癌、胰腺癌、乳腺癌的治疗。
附图说明
17.图1是本发明的实施例1中胃癌细胞在不同大果桉醛i剂量下的抑制效果图。
18.图2是本发明的实施例1中胰腺癌细胞在不同大果桉醛i剂量下的抑制效果图。
19.图3是本发明的实施例1中乳腺癌细胞在不同大果桉醛i剂量下的抑制效果图。
20.图4是本发明的实施例2中结直肠癌细胞在大果桉醛处理后的calreticulin表达图。
21.图5是本发明的实施例2中胃癌细胞在大果桉醛处理后的calreticulin表达图。
22.图6是本发明的实施例2中胰腺癌细胞在大果桉醛处理后的calreticulin表达图。
23.图7是本发明的实施例2中乳腺癌细胞在大果桉醛处理后的calreticulin表达图。
24.图8是本发明的实施例3中大果桉醛i和pd-1抗体联合治疗中肿瘤生长率对比图。
25.图9是本发明的实施例3中大果桉醛i和pd-1抗体联合治疗后的流式检测图。
具体实施方式
26.在本说明书中提到或者可能提到的上、下、左、右、前、后、正面、背面、顶部、底部等方位用语是相对于其构造进行定义的，它们是相对的概念。因此，有可能会根据其所处不同位置、不同使用状态而进行相应地变化。所以，也不应当将这些或者其他的方位用语解释为
限制性用语。
27.以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本公开相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与本公开的一些方面相一致的实施方式的例子。
28.以下实施例中大果桉醛i指式ⅰ所示的化合物；式ⅰ实施例1大果桉醛对胃癌、胰腺癌、乳腺癌细胞株的抑制1、细胞培养胃癌、胰腺癌、乳腺癌细胞株来源于本实验室已有的细胞株。培养细胞所用的培养基购买自gibco公司，胎牛血清购自excell bio公司。细胞株是通过含10%胎牛血清的rpmi-1640培养基进行培养，培养环境为37℃、5% co2的培养箱，取生长状态良好的细胞进行后续实验。
29.2、细胞增殖实验-浓度梯度将大果桉醛i溶解于dmso配制为20 mm母液。待细胞株生长至80%汇合度，使用0.05%胰蛋白酶消化，rpmi-1640完全培养基重悬，计数，接种于96孔板中，每孔7000个细胞，使用100 μl培养基培养。待细胞单层贴壁后，加入大果桉醛i，使其终浓度分别为20，50，80，100，200，300μm。同时设空白孔和100％细胞培养基孔作对照，每个药物浓度设3个复孔，将培养板放回37℃、5％ co2培养箱。培养24h后加入10 μl的mtt溶液，继续在培养箱中孵育4h，吸掉上清，加入150 μl dmso，培养箱孵育10 min，用全自动酶标仪在490 nm测定吸光度(od值)。
30.根据各孔的od值，采用以下公式计算大果桉醛i对细胞的抑制率：抑制率％＝[(对照孔吸光度-实验孔吸光度)/(对照孔吸光度-空白孔吸光度)]
×
100％，细胞存活率％＝1-抑制率％。
[0031]
实验结果如图1-图3、表1所示。
[0032]
表1
从图1-3可以看出，大果桉醛对胃癌、胰腺癌、乳腺癌细胞株的杀伤具有剂量依赖性，并且其对癌细胞的抑制作用具有阈值效应。剂量处于20μm-100μm之间时，大果桉醛对肿瘤细胞没有抑制效果，而剂量处于100μm-300μm时，大果桉醛表现出了明显的细胞抑制作用。
[0033]
从表1看出，大果桉醛i对不同肿瘤细胞的ic50值在88-182μm，抑制较强，其中对乳腺癌的skbr3为88.3μm，其诱导细胞凋亡所需的药物剂量最小，肿瘤细胞抑制效果显著。
[0034]
因此，大果桉醛i可以有效抑制胃癌、胰腺癌、乳腺癌细胞增殖，可作为天然抗肿瘤小分子药物应用于对胃癌、胰腺癌、乳腺癌的治疗。
[0035]
实施例2大果桉醛i诱导肿瘤细胞表面的calreticulin表达使用化学药物治疗肿瘤时，肿瘤细胞可发生免疫原性细胞死亡，即肿瘤细胞在发生凋亡的同时，由非免疫原性的细胞转变为具有免疫原性的细胞，并在机体内激发抗肿瘤免疫效应。肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡的同时，会产生一系列的信号分子，主要包括细胞表面的钙网蛋白（calreticulin）暴露增加、atp释放。
[0036]
为了探讨大果桉醛i促进机体抗肿瘤免疫反应是否由免疫原性细胞死亡引起的，我们检测了肿瘤细胞表面的calreticulin表达。在六孔板中分别铺1x106个结直肠癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌细胞，分别接受0、10、100μm 大果桉醛i药物处理24h。收集细胞，pbs清洗2次，4%多聚甲醛室温固定10min，1000 rpm/min离心4min，pbs清洗2次，5%胎牛血清室温封闭30min，离心细胞，直接加入100ul anti-calreticulin抗体（1:100）室温孵育30min。随后pbs清洗2次，加入山羊抗兔dylight 488荧光标记二抗，避光孵育至少半小时后流式细胞仪检测，flow jo软件分析。
[0037]
实验结果如图4-图7所示。
[0038]
从图4-7可以看出，结直肠癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌细胞在接受10μm 、100μm 大果桉醛i药物处理24h后经流式细胞仪检测发现calreticulin胞膜表达的细胞占比增加，尤其是100μm 大果桉醛i药物处理后阳性细胞占比显著增加；证明大果桉醛i诱导肿瘤细胞表面的calreticulin表达，大果桉醛i可作为免疫增效剂诱导瘤种癌细胞免疫源性死亡。
[0039]
实施例3大果桉醛i和pd-1抗体联合治疗实验选取3-4周龄的雌性c57鼠28只，在每只c57鼠双侧腋下皮下接种1
×
106个结直肠癌细胞mc38k细胞，约7天后可见c57鼠皮下肿瘤形成，待28只c57鼠均成瘤后，将c57鼠随机分为4组，分别为对照组、pd-1抗体单药组、大果桉醛i单药组、联合用药组，每组7只c57鼠。
[0040]
由于大果桉醛i是通过dmso来溶解的，因此对照组按裸鼠体重每天给予腹腔注射60mg/kg的dmso，大果桉醛i按c57鼠体重每天给予腹腔注射60mg/kg的大果桉醛i；pd-1抗体的使用量为200ug/只，3天/次进行腹腔注射，同时对照组给予相应量的igg。由于28只c57鼠成瘤的时间顺序有先后，我们以c57鼠全部出现皮下瘤为起始点开始给药， 以任何一只c57鼠皮下瘤长到1500mm3为终止点，共历时十二天。每隔一天用游标卡尺测量瘤体大小，分别测量瘤体长(l)和宽(w)后根据公式volume(mm3 )＝lw2 /2来计算肿瘤的体积，每隔一天用电子天平称量c57鼠的体重，累计测量7次。各组c57鼠肿瘤体积取均值后以第一次测量为对照组，腹腔注射后的各次测量为实验组，按照公式(实验组-对照组)/对照组
×
100％计算肿瘤生长率，绘制生长率曲线。实验结束时每组各取两只小鼠的肿瘤进行流式检测，分析肿瘤内免疫细胞浸润情况。
[0041]
实验结果如图8-9所示。
[0042]
通过12天的给药发现c57鼠的生活状态未受影响，饮食活动正常。参照图8，通过计算各组的瘤体增长率可以发现，大果桉醛i用药组的肿瘤生长速度低于对照组，尤其是联合用药组的肿瘤被显著抑制。这说明了大果桉醛i能够抑制c57鼠皮下瘤的生长并增强pd-1抑制剂在肿瘤治疗中的功效。又通过对各组裸鼠平均体重的检测发现随着给药时间的增加裸鼠体重并没有明显变化，这也进一步说明了天然产物大果桉醛i对裸鼠并没有明显的毒副作用。同时参照图9，流式分析显示大果桉醛i治疗后肿瘤内cd4、cd8细胞浸润增加，表明大果桉醛i能够促进机体的抗肿瘤免疫反应。
[0043]
综上，一方面，大果桉醛i对胃癌、胰腺癌、乳腺癌具有明显的抑制作用，另一方面，大果桉醛i可作为免疫增效剂诱导多瘤种癌细胞免疫源性死亡，增强免疫检查点治疗效果，有望作为天然抗肿瘤小分子药物应用于对胃癌、胰腺癌、乳腺癌等实体瘤的治疗。
[0044]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.大果桉醛i在制备肿瘤免疫治疗增效剂中的应用。2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述肿瘤包括结直肠癌、胃癌、胰腺癌或乳腺癌中任一种。3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述大果桉醛i的起效浓度不低于170μm。4.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述大果桉醛i包括以下的任一种：a)结构式为式ⅰ所示的化合物；式ⅰb) 与a化合物具有相同或相近药学活性或在体内水解得到的与a化合物具有相同或相近药学活性的药学上可接受的衍生物。5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述药学上可接受的衍生物选自其药用盐、药用酯、药用醚、药用酰胺或糖基化物中的任一种。6.大果桉醛i在制备pd-1抑制剂的增效药物中的应用。7.大果桉醛i在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤包括胃癌、胰腺癌或乳腺癌中任一种。8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述大果桉醛i的浓度为100
ꢀ‑
300μm。9.一种肿瘤免疫治疗药物，其特征在于，包括pd-1抑制剂和大果桉醛i。10.根据权利要求9所述肿瘤免疫治疗药物，其特征在于，所述肿瘤免疫治疗药物的剂型为栓剂或灌肠剂。

技术总结
大果桉醛I在制备肿瘤免疫治疗增效剂中的应用，涉及医药领域。大果桉醛I可作为免疫治疗增效剂诱导多瘤种癌细胞免疫源性死亡，增强免疫检查点治疗效果。大果桉醛I与PD1抑制剂联合用药能显著抑制肿瘤的生长。此外，大果桉醛I可以有效抑制胃癌、胰腺癌、乳腺癌细胞增殖和侵袭，可作为天然抗肿瘤小分子药物应用于对结直肠癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌的治疗。乳腺癌的治疗。乳腺癌的治疗。


技术研发人员：廖雯婷 丁彦青 张亚欣 齐鲁
受保护的技术使用者：南方医科大学
技术研发日：2023.06.27
技术公布日：2023/8/1