PD-L1蛋白抗体、试剂盒和用途的制作方法

pd-l1蛋白抗体、试剂盒和用途
技术领域
1.本发明属于分子免疫学领域。具体地，涉及一种特异性靶向pd-l1蛋白的抗体，及包括该抗体试剂盒以及其用途。


背景技术：

2.pd-1是表达在活化的t细胞，b细胞，巨噬细胞，调节性t细胞(tregs)和自然杀伤性(nk)细胞上的抑制受体。它有两个结合配体
‑‑‑
正常细胞上表达的pd-l1和pdl-2(b7家族)，pd-1与任一配体的结合均会抑制t细胞活性，诱导t细胞耐受，抑制增殖，降低t细胞的免疫反应并诱导细胞死亡，从而阻止免疫细胞活化杀伤正常细胞。恶性肿瘤利用了这一机制，它在表面大量表达pd-l1/2，减少t细胞激活和抗原特异性t细胞免疫应答，从而绕过免疫监视。因此，阻断pd-1和pd-l1/2的结合，就能够激活t细胞的杀伤功能，从而杀伤肿瘤细胞。fda批准了首个抗pd-1单克隆抗体keytruda，紧接着批准nivolumab，成为恶性肿瘤当之无愧的明星产品。至2021年已有近10种抗-pd-1和抗pd-l1的抗体药物走向临床。与治疗癌症的其他方法相比，免疫治疗最大的优势就是它借助的是免疫系统的能力，除了比放射、化疗、手术等传统方法更加安全以外，它还能对特定的肿瘤形成适应性和特异性，形成类似抗原的持久记忆力，这对于防止肿瘤复发有重要的意义。
3.然而目前免疫治疗仍然面临难题，主要包括：(1)抗pd-1/l1治疗诱导的免疫相关不良事件(iraes)，例如脑膜神经根炎，多发性神经根炎，心律不齐等。有报道称pd-1抑制剂pembrolizumab引起心肌炎和急性心力衰竭。(2)非特异性生物标志物，pd-l1的表达是一种经过验证且重要的预测生物标志物。然而仅此是不够的，仅凭此不足以确定哪些患者可以接受pd-1/l1阻断治疗。肿瘤表达最高水平的pd-l1/2是对治疗最好的应答这一假说也尚未得到肯定。而目前临床普遍采用的是以pd-l1的表达水平作为筛选患者的生物学标志物，完全无法满足临床需求。研究证实，pd-l1表达水平作为预测抗pd-1/l1治疗敏感性的指标，预测效力不足60％，高pd-l1表达的患者部分对抗pd-1/l1治疗无效甚至促进肿瘤进展。此外，msi和dmmr被认为是抗pd-1/l1抗体反应的预测性生物标志物，然而，这也是不够的，因为它们在许多癌症中经常被观察到，缺乏特异性。(3)pd-1抑制剂的成本效益，从经济角度看，pd-1阻断单一疗法通常比其他免疫疗法和常规癌症疗法更昂贵，患者经济压力巨大。基于以上原因，筛选出可能对抗pd-1/l1治疗有效的人群尤为重要，可以减少患者不必要的治疗和承受副作用的风险，减轻患者经济负担。
4.因此，本领域需要一种产品，其能够作为一种新型的免疫检查点抑制剂，并且灵敏度高特异性好，为癌症的检测和/或治疗提供更多额外的选择。


技术实现要素：

5.有鉴于此，第一方面，本发明提供一种分离的pd-l1蛋白抗体或其抗原结合片段，其重链可变区的互补决定区cdr1具有如seq id no.1所示的氨基酸序列，cdr2具有如seq id no.2所示的氨基酸序列，cdr3具有如seq id no.3所示的氨基酸序列。轻链可变区的互
补决定区cdr1具有如seq id no.9所示的氨基酸序列，cdr2具有如seq id no.10所示的氨基酸序列，cdr3具有如seq id no.11所示的氨基酸序列。
6.本发明通过杂交瘤技术筛选到一株抗pd-l1蛋白特异性的杂交瘤，制备小鼠腹水并纯化抗体，得到能够特异性结合pd-l1蛋白的鼠源性单克隆抗体(mab)，该抗体对pd-l1蛋白具有较高的亲和力，同时具有靶向pd-l1蛋白的能力。其kd值为1.15*10-10
m。
7.优选地，所述抗pd-l1蛋白抗体或其抗原结合片段的重链可变区fr1-fr4具有如seq id no.4～7所示的氨基酸序列。轻链可变区fr1-fr4具有如seq id no.12～15所示的氨基酸序列。
8.优选地，所述抗pd-l1蛋白抗体或其抗原结合片段的重链可变区具有如seq id no.8所示的氨基酸序列。轻链可变区具有如seq id no.16所示的氨基酸序列。
9.进一步优选地，所述抗pd-l1蛋白抗体为鼠源单克隆抗体。
10.本发明中，所述抗原结合片段可选自fab、fab'、f(ab')2、fd、fv、dab、互补决定区片段、单链抗体、人源化抗体、嵌合抗体、双特异抗体或多特异抗体。
11.本发明提供含有所述抗pd-l1蛋白抗体或其抗原结合片段的双特异抗体或多特异抗体。
12.基于上述抗体，本发明提供一种核酸分子，其编码所述抗pd-l1蛋白抗体或其抗原结合片段。
13.根据上述提供的抗pd-l1蛋白抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列，本领域技术人员可以确定编码所述抗pd-l1蛋白抗体或其抗原结合片段的核酸分子的核苷酸序列，并根据宿主细胞的密码子偏好性选择不同的核酸分子的核苷酸序列。
14.本发明还提供一种生物材料，其含有编码所述抗pd-l1蛋白抗体或其抗原结合片段的核酸分子，所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
15.以上所述的表达盒是指将所述核酸分子的上游或下游连接用于转录、翻译的调控元件得到的重组核酸分子。
16.以上所述的载体是指可将核酸分子插入其中的一种核酸运载工具，包括但不限于质粒、人工染色体、噬菌体、动物病毒等，可以为表达载体，也可以为克隆载体或非复制型载体。
17.以上所述的宿主细胞可以为微生物细胞(如：大肠杆菌、酵母细胞等)或动物细胞(如：昆虫细胞、cho细胞、bhk细胞，hek293细胞等用于表达、制备抗体的细胞)，其中，动物细胞为不能够繁殖成为动物个体的细胞。
18.基于上述抗pd-l1蛋白抗体或其抗原结合片段的功能，本发明提供所述抗pd-l1蛋白抗体或其抗原结合片段、所述核酸分子或所述生物材料的如下任一种应用：
19.(1)在制备用于检测pd-l1蛋白的试剂或试剂盒中的应用；
20.(2)在制备用于预防或治疗癌症的药物中的应用；
21.以上(1)中所述的检测pd-l1蛋白包括检测pd-l1蛋白的存在或其水平。
22.以上(2)中所述的白血病包括急性骨髓性白血病。
23.基于上述抗pd-l1蛋白抗体或其抗原结合片段，本发明提供一种抗体偶联物，其为由所述抗pd-l1蛋白抗体或其抗原结合片段与载体或药物偶联得到，或者由所述抗pd-l1蛋白抗体或其抗原结合片段与经化学或生物标记得到。
24.以上所述的载体可为任意可与蛋白质偶联的载体或药物载体。
25.以上所述的化学标记包括同位素、胶体金、荧光素、生物素标记等。
26.以上所述的生物标记包括蛋白标记、酶标记等。
27.本发明提供一种检测试剂，其含有所述抗pd-l1蛋白抗体或其抗原结合片段或含有所述抗体偶联物。
28.以上所述的试剂盒还可包含免疫学检测、流式细胞检测等所需的其它试剂。
29.本发明提供一种药物组合物，其含有所述抗pd-l1蛋白抗体或其抗原结合片段或含有所述抗体偶联物。
30.以上所述的药物组合物还可包含药学上可接受的载体或赋形剂。所用载体或赋形剂的类型可根据药物组合物的剂型和给药方式进行选择。所述药物组合物还可包含具有其它功效的抗体或药物活性成分。
31.本发明的有益效果在于：本发明提供一种针对pd-l1蛋白的单克隆抗体，该抗体能够与pd-l1蛋白特异性结合，具有高度特异性和高结合能力，可用于抗d33的免疫荧光染色和流式细胞染色等检测，即使在较高稀释度时，仍然具有较好的检测效果。同时，该抗体还能为癌症治疗提供有效的潜在选择的工具。
附图说明
32.图1为本发明抗体筛选示意图；
33.图2为本发明抗体wb结果图；
34.图3为本发明抗体免疫组化结果图。
具体实施方式
35.在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
36.除非另有说明，术语“分离的分子”(其中所述分子是例如多肽、多核苷酸或抗体或其片段)是借助于其衍生的起源或来源(1)不与在其天然状态下伴随其的天然缔合的组分缔合、(2)基本上不含来自相同物种的其它分子、(3)由来自不同物种的细胞表达、或(4)不存在于自然界中的分子。因此，化学合成的或在与其天然来源的细胞不同的细胞系统中表达的分子将是与其天然缔合的组分“分离的”。还可使用本领域中公知的纯化技术，通过分离使分子基本上不含天然缔合的组分。分子纯度或均质性可通过本领域中公知的多种方法测定。例如，多肽样品的纯度可使用聚丙烯酰胺凝胶电泳和凝胶染色以使用本领域中公知的技术使多肽显现来进行测定。出于某些目的，可通过使用hplc或本领域中公知用于纯化的其它手段来提供较高的分辨率。
[0037]“抗体”是能够通过位于免疫球蛋白分子的可变区中的至少一个抗原识别位点特异性结合至靶标分析物诸如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等的免疫球蛋白分子。如本文中所使用，除非另有说明，否则该术语不仅包含完整多克隆或单克隆抗体，而且还包含与完整抗体竞争特异性结合的其任何抗原结合部分、包含抗原结合部分的融合蛋白和包含抗
原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其它经修饰的构型。抗原结合部分包括例如fab、fab’、f(ab’)2、fd、fv、结构域抗体(dab，例如鲨鱼和骆驼类抗体)、包含互补决定区(cdr)的片段、单链可变片段抗体(scfv)、maxibody、minibody、intrabody、diabody、triabody、tetrabody、v-nar和双-scfv，以及含有足以将抗原特异性结合赋予多肽的免疫球蛋白的至少一部分的多肽。抗体包括任何种类的抗体或其抗原结合片段，诸如igg、iga或igm(或其亚类)，并且抗体不需要是任何特定种类。取决于免疫球蛋白的重链恒定区的抗体氨基酸序列，该免疫球蛋白可归于不同种类。存在五种主要类型的免疫球蛋白：iga、igd、ige、igg和igm，并且这些免疫球蛋白中的几个可以进一步划分成亚类(同种型)，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2。对应于不同种类的免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同种类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是公知的。
[0038]
可互换使用的，术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”(或简言之“抗体部分”)是指保留特异性结合至抗原(例如心肌肌钙蛋白)的能力的抗体的一个或多个片段。已显示抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段来执行。涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的实例包括(i)fab片段，其是由vl、vh、cl和ch1结构域组成的单价片段；(ii)f(ab’)2片段，其是包含通过二硫桥键在铰链区连接的两个fab片段的二价片段；(iii)fd片段，其由vh和ch1结构域组成；(iv)fv片段，其由抗体单臂的vl和vh结构域组成，(v)dab片段(ward et al.等人,(1989)nature 341:544-546)，其由vh结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(cdr)、二硫键连接的fvs(dsfv)和抗独特型(抗-id)抗体和intrabody。此外，尽管fv片段的两个结构域(vl和vh)由单独的基因编码，但它们可使用重组方法通过合成接头连接，所述接头能够使其制备成其中vl和vh区配对以形成单价分子的单个蛋白链(称为单链fv(scfv))。这样的单链抗体还意欲涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内。还涵盖了其它形式的单链抗体，诸如diabody。diabody是二价的双特异性抗体，其中vh和vl结构域表达在单个多肽链上，但使用的接头太短而不允许相同链上的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。
[0039]
抗体可来源于任何哺乳动物，包括但不限于人、猴、猪、马、兔、狗、猫、小鼠等，或其它动物诸如鸟类(例如鸡)、鱼类(例如鲨鱼)和骆驼类(例如美洲驼)。
[0040]
抗体的“可变区”是指单独或组合形式的抗体轻链(vl)的可变区或抗体重链(vh)的可变区。如本领域中已知，重链和轻链的可变区各自由通过三个互补决定区(cdr)(也称为高变区)连接的四个构架区(fr)组成，并且促成抗体的抗原结合位点的形成。若需要对象可变区的变体，特别是具有cdr区外部(即在构架区中)的氨基酸残基的取代，则可通过将对象可变区与含有与对象可变区相同的典型种类中的cdr1和cdr2序列的其它抗体的可变区进行比较来鉴定适当的氨基酸取代，优选保守氨基酸取代。
[0041]
如本文中其它地方所概述的，抗体分子的某些位置可变化。如本文中所使用，“位置”意指在蛋白质的序列中的定位。位置可依次编号或根据已建立的格式编号，例如可使用eu索引和kabat索引对抗体的氨基酸残基进行编号。相应的位置一般通过与其它亲本序列的比对来确定。
[0042]
一般而言，术语“表位”是指与抗体特异性结合的抗原的区域或部位，例如包含与抗体相互作用的接触残基的区域或部位。因此，术语“表位”是指能够在一个或多个抗体抗原结合区上由抗体识别和结合的分子的部分。通常，在抗体或其抗原结合片段与其相对应
的抗原之间的分子相互作用的背景下定义表位。表位通常由分子诸如氨基酸或糖侧链的表面分组组成，且具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。
[0043]
术语“多肽”、“寡肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指任何长度的氨基酸链。所述链可以是直链或分支链，其可包含经修饰的氨基酸，和/或可间杂有非氨基酸。该术语还涵盖已被天然修饰或通过插入修饰的氨基酸链；例如，二硫键形成、甲基化、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操纵或修饰诸如与标记组分缀合。还包括在定义内的是例如含有氨基酸的一种或多种相似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域中已知的其它修饰的多肽。应理解，多肽可以以单链或缔合链形式存在。
[0044]
术语“解离常数”与“平衡解离常数”(kd)有时可互换使用，且是指在平衡下进行滴定测量或通过解离速率常数(koff)除以缔合速率常数(kon)所获得的值。缔合速率常数、解离速率常数和平衡解离常数用于表示抗体与抗原的结合亲和力。用于测定缔合和解离速率常数的方法是本领域中所熟知的。
[0045]
两个分子例如抗体或其片段与抗原之间通过单价相互作用的结合亲和力可通过测定解离常数(kd)来定量。进而，kd可通过使用例如表面等离子体共振(spr)方法(biacore)测量复合物形成和解离的动力学来测定。对应于单价复合物的缔合和解离的速率常数分别是指缔合速率常数ka(或kon)和解离速率常数kd(或koff)。kd与ka和kd通过方程式kd＝kd/ka相关联。解离常数的值可通过公知的方法直接测定，并且可通过诸如caceci等人(1984,byte9:340-362)中所示的那些方法计算出甚至复杂混合物的解离常数值。
[0046]
如本文中所使用，“载体”意指能够递送并优选在宿主细胞中表达一个或多个目标基因或序列的构建体。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸dna或rna表达载体、质粒、黏粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂缔合的dna或rna表达载体、封装于脂质体中的dna或rna表达载体和某些真核细胞诸如生产细胞。
[0047]
下文将结合具体实施方案和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方案和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
[0048]
实施例1、杂交瘤细胞和单克隆抗体的筛选和制备
[0049]
抗体制备具体如图1所示，具体的说，使用制备的pd-l1蛋白(抗原)对小鼠免疫，获得杂交瘤细胞并进行筛选，经过高通量测序和数据分析，筛选到5株pd-l1蛋白具有结合能力的单克隆抗体(克隆号分别为6c21～6c25)，对其序列进行合成，然后进行抗体表达和筛选。其中，pd-l1(克隆号6c23)的序列具体如表1所示。
[0050]
表1
[0051][0052]
实施例2、免疫印迹实验验证抗体效果
[0053]
试验步骤：
[0054]
1蛋白质样本的准备与保存
[0055]
1)预先将hek 293t细胞铺入6孔板内，分别转染vector,ha-pd-l1质粒，继续培养细胞24h；
[0056]
2)将100
×
的磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂加入到np-40裂解液中，混匀后备用；
[0057]
3)将预先处理的细胞使用预冷的pbs溶液洗涤3次。加预先配制好的np-40裂解液500μl，冰上裂解30min，收集细胞裂解液，在4℃、12 000rpm离心10min。收集上清液于1.5ml ep管内，放于冰上备用；
[0058]
4)bca法测蛋白质浓度：
[0059]
(1)配制bca反应液：将4μl bca反应液a液加入到196μl bca反应液b液(1份，具体配制份数为：样本数目+2)；
[0060]
(2)按照说明书稀释标准品(具体稀释浓度为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、
0.5μg/μl)，将5μl蛋白质样品或者标准稀释液加入到96孔板内，随后加入20μl双蒸水，最后加入200μl bca反应液，注意每个样本设置三个对照孔，盖上盖子，使用密封条密封96孔板，将96孔板放置于37℃培养箱中孵育30min；
[0061]
(3)待孵育时间结束后，将其放置于全光谱酶标仪中，设置波长为562nm，待其检测结束后，记下每个标准稀释液以及样品的od值，利用不同浓度的标准稀释液及其od值绘制标准曲线，根据标准曲线及每个样本中的od值计算出每个样本中的蛋白质浓度。
[0062]
5)将5
×
sds loading buffer加入上清液中，混匀后，将所有样品蛋白使用1
×
sds loading buffer稀释成相同浓度，并将蛋白质浓度记录在各样本ep管上，将其放于95～100℃水浴锅内，变性蛋白10min，将变性后的蛋白放置于冰上或者于-80℃保存待用，注意避免反复冻融样本。
[0063]
2蛋白质样本电泳
[0064]
1)根据目标蛋白分子量选择所使用分离胶的浓度，将提前准备好的胶板放置在电泳架中，向电泳架中加电泳液至将玻璃板孔浸没。将准备好的蛋白质样品点入对应的样品孔中。点样顺序为vector,ha-pd-l1。注意每组样品孔左右各空1个样品孔，将2μl蛋白marker加入其中，其余体积使用1
×
sds loading buffer补齐；
[0065]
2)将上述电泳架置入到电泳槽中，加满电泳液，按照正负极指示将电泳槽盖子盖好，并接入电源，设置恒定电压为60v，注意正负极是否接反，每隔10min观察蛋白质marker的移动情况；
[0066]
3)待蛋白marker出现红色指示带，此时蛋白质样品已经进入分离胶内，可以将电压设置为恒定电压120～140v，继续观察底部溴酚蓝条带以及蛋白marker的位置，可根据目标蛋白的分子量决定电泳时间。
[0067]
3胶板转膜
[0068]
1)根据胶板数目提前配制好转膜液，裁剪大小为6cm
×
9cm的聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，pvdf)膜(孔径为0.45μm)，也可根据所需目标蛋白情况裁剪不同大小的pvdf膜，将pvdf膜放置在无水甲醇中激活，注意标记好pvdf膜所转蛋白的信息，防止遗忘；
[0069]
2)将提前配制好的转膜液倒入转膜盘中，将转膜夹打开放入其中，使用滚轮将转膜夹中海绵以及滤纸中的气体赶出；
[0070]
3)使用双蒸水将胶板冲洗干净，使用剪胶板沿着玻璃板间隙将其拆开，同时使用剪胶板将浓缩胶及其他多余胶去除，将胶条沿着玻璃板轻轻放入转膜盘中，并将其置于转膜夹黑面一侧的滤纸上，取预先激活的pvdf膜覆盖于胶体上，注意两者之间不能留有气泡，再将转膜夹白色一面的滤纸覆盖在pvdf膜上，注意检查其中是否有气泡，并使用滚轮将其赶出，将转膜夹夹紧，注意胶条和pvdf膜的位置不能放反；
[0071]
4)将转膜夹置入转膜槽中，将预先冷却好的低温冰盒放置于转膜槽中，并将转膜槽放置于较大的铁盒中，并将其中加满碎冰，接通电源，转膜时间为90min，以恒定电流350ma开始转膜。
[0072]
4封闭
[0073]
1)5％封闭液配制比例如下：
[0074]
试剂剂量
[0075]
脱脂奶粉5g
[0076]
步骤1.2.1.3配制好的tbst溶液100ml
[0077]
混匀后，于4℃保存备用；
[0078]
2)将步骤3转膜完成后的pvdf膜放置于上述的封闭液中，置于摇床上封闭1.5h。
[0079]
5一抗孵育
[0080]
1)按照说明书将pd-l1一抗(即本发明的pd-l1抗体)配制成工作浓度，于-20℃保存；
[0081]
2)将封闭好的pvdf膜放入tbst溶液中反复摇晃10min去除残留在pvdf膜上的脱脂奶粉封闭液，反复洗涤pvdf膜3次；
[0082]
3)根据蛋白marker以及pd-l1蛋白的分子量裁剪pvdf膜，注意标注好每条膜的蛋白质名称以处理方式，将条带放入预先配置好的一抗溶液中，室温孵育2～4h或4℃孵育过夜。
[0083]
6二抗孵育
[0084]
1)用镊子将5中的pvdf膜从一抗中取出，放置于预先配置好的tbst溶液中，将pvdf膜放置于摇床上洗涤10分钟，倒出tbst溶液后，再次向其中加入适量的tbst溶液，反复洗涤pvdf膜3次。注意使用镊子取pvdf膜后，要用双蒸水清洗镊子，避免一抗交叉污染；不同抗性的一抗可放置于不同的tbst溶液中，以方便二抗孵育，
[0085]
2)按照1:5 000稀释比例，使用5％脱脂奶粉稀释山羊抗小鼠igg，混匀后，于4℃保存备用；
[0086]
3)将洗涤干净的pvdf膜放置二抗液体中，置于摇床上摇晃1.5h。
[0087]
7ecl化学发光成像
[0088]
1)将pvdf膜从二抗中取出，放入tbst中，在摇床上摇晃10min，洗去pvdf膜残留的二抗，反复洗涤3次；
[0089]
2)根据膜的数目及说明书配制一定量的ecl化学发光显示液(a液与b液按照1：1配制)，配制完成后注意避光，并及时使用；
[0090]
3)打开曝光机，将pvdf膜放置于曝光机背景板中心并加入适量ecl化学发光显示液，注意将显示液均匀分布在pvdf膜上，调整曝光时间，采集图像并保存结果；
[0091]
4)将采集的图片进行裁剪整理，并标注好蛋白质名称以及处理方式。具体如图2所示，从图2中可以看出，本发明的抗体能够靶向pd-l1，从而检测pd-l1。
[0092]
实施例3、本发明抗体的免疫组织化学检测
[0093]
实验仪器与试剂耗材：bond max(leica)全自动免疫组织化学染色机；倒置生物显微镜；pd-l1抗体试剂；无水乙醇；bond
tm
polymer refine detection；bond
tm
wash solution 10x concentrate；bond
tm
dewax solution；bond
tm
epitope retrieval solution 1；bond
tm
epitope retrieval solution 2；bond universal covertiles；bond aspirating probe cleaning；bond
tm
mixing stations；bond printer ribbon&labels cxi(6pack)；bond
tm
titration kit:(the bond titration kit contains bond titration container inserts and bond titration containers)；bond
tm
open container；环保透明脱蜡液；95％酒精；75％酒精；pbs磷酸盐缓冲液；tween-20；免疫组化油笔；中性树胶。
[0094]
实验步骤：
[0095]
选择需检验的组织切片和pd-l1抗体试剂，通过染色机进入染色程序，程序如下：
[0096]
1 bake and dewax protocol
[0097]
1.1玻片加热至70℃，烤片30min。
[0098]
1.2玻片温度升至72℃，加入150μl bond dewax solution，孵育30s后除去bond dewax solution。
[0099]
1.3玻片温度维持在72℃，再加入150μl bond dewax solution洗涤一次，除去bond dewax solution。
[0100]
1.4玻片温度降至室温，加入150μl bond dewax solution洗涤一次，除去bond dewax solution。
[0101]
1.5室温下，加入150μl无水乙醇冲洗并除去酒精，共洗涤3次。
[0102]
1.6室温下，加入150μl bond wash solution冲洗并除去bond wash solution，共洗涤2次。
[0103]
1.7室温下，加入150μl bond wash solution，孵育5min后除去bond wash solution。
[0104]
2hier 20min with er1/er2 protocol
[0105]
2.1室温下，加入150μl er1或er2冲洗玻片2次。
[0106]
2.2室温下，加入150μl er1或er2,玻片加热至100℃，孵育20min。
[0107]
2.3玻片温度降至室温，继续孵育12min。
[0108]
2.4玻片加热至35℃，加入150μl bond wash solution冲洗并除去bond wash solution，共洗涤3次。
[0109]
2.5玻片温度降至室温，加入150μl bond wash solution，孵育3min后除去bond wash solution。
[0110]
3ihc protocol f protocol
[0111]
3.1室温下，加入150μl peroxide block,孵育5min。
[0112]
3.2室温下，加入150μl bond wash solution冲洗玻片并除去bond wash solution,洗涤4次，并室温下晾干1min。
[0113]
3.3室温下，加入150μlpd-l1抗体(即本发明的pd-l1抗体)，孵育30min。
[0114]
3.4室温下，加入150μl bond wash solution冲洗玻片并除去bond wash solution，洗涤3次，并室温下晾干1min。
[0115]
3.5室温下，加入150μl post primary，孵育8min。
[0116]
3.6室温下，加入150μl bond wash solution，冲洗2min，重复3次。
[0117]
3.7室温下，加入150μl polymer，孵育8min。
[0118]
3.8室温下，加入150μl bond wash solution，冲洗2min，重复2次，并晾干。
[0119]
3.9室温下，加入150μl deionized water，洗涤2次，除去deionized water,1min。
[0120]
3.10室温下，加入150μl mixed dab refine，室温孵育10min，吸去mixed dab refine。
[0121]
3.11室温下，加入150μl deionized water冲洗玻片及除去deionized water，重复4次，并室温下晾干1min。
[0122]
3.12室温下，加入150μl hematoxylin，室温孵育10min后除去hematoxylin。
[0123]
3.13室温下，加入150μl deionized water冲洗玻片1次。
[0124]
3.14室温下，加入150μl bond wash solution冲洗玻片1次。
[0125]
3.15室温下，再加入150μl deionized water冲洗玻片1次。
[0126]
仪器就绪后，点击系统状态界面下开始按钮，待染色完成。轻轻抽出玻片架，手执covertile柄部保持水平并向上提起，取下的covertile收集在固定地方等待消毒、清洗。将玻片取下进行后续操作。
[0127]
4.脱水透明
[0128]
4.1染色程序结束后，取出玻片，甩去多余的deionized water。
[0129]
4.2 75％的酒精中浸泡脱水30s/次，共2次。
[0130]
4.3 95％的酒精中浸泡脱水30s/次，共2次。
[0131]
4.4无水乙醇中浸泡脱水30s/次，共2次。
[0132]
4.5环保透明脱蜡液中浸泡透明5min。
[0133]
注：每次换缸时都需沥干(约5s)，再放入下一缸。
[0134]
5.封片
[0135]
5.1取出切片沥干(约5s)，用吹风机冷风吹干切片；
[0136]
5.2滴加1～2滴中性树胶于切片组织上(视切片组织数量和大小而定)，盖上盖玻片；
[0137]
5.3检查切片，确保切片组织完全被中性树胶覆盖住，且组织中没有较大气泡(若有较大气泡，通过挤压盖玻片排出)；
[0138]
5.4将切片放置于通风橱中晾干。
[0139]
镜下观察切片，判定结果，如图3所示，从图3中可以看出，显色良好，表明本发明的抗体能够用作检测试剂用于检测pd-l1。
[0140]
实施例4、本发明抗体的亲和力
[0141]
使用elisa测量本发明抗体的亲和力。
[0142]
1.包被抗原板，然后用30％的mpbs室温封闭2h，pbs洗涤。
[0143]
2.在一排试管中，利用有限稀释法建立从0.1nmo/l～1μmol/l浓度梯度的抗原pbs溶液，加入pd-l1抗体溶液(浓度≤0.5μmol/l)使总体积为100μl。
[0144]
3.室温孵育30min后，加90μl反应混合物到前述已包被抗原的微孔中，微孔中预先加人30％的mpbs 30μl后孵育，时间不超过10min。充分洗涤抗原板。
[0145]
4.加入酶标二抗，孵育1h，pbs洗涤。
[0146]
5.加入显色底物显色，显色30min后加入终止液停止反应，进行od值读数。
[0147]
将测得的od值记录，结合梯度稀释的抗原浓度绘制拟合曲线，最终找到最强信号一半的点，对应的抗原浓度即解离常数kd，结果如表2所示。
[0148]
表2
[0149]
浓度0.46mg/ml内毒素《1000eu/mgkd值1.156*10-10m
技术特征：
1.一种分离的pd-l1蛋白抗体或其抗原结合片段，其重链可变区的互补决定区cdr1具有如seq id no.1所示的氨基酸序列，cdr2具有如seq id no.2所示的氨基酸序列，cdr3具有如seq id no.3所示的氨基酸序列；轻链可变区的互补决定区cdr1具有如seq id no.9所示的氨基酸序列，cdr2具有如seq id no.10所示的氨基酸序列，cdr3具有如seq id no.11所示的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的分离的pd-l1蛋白抗体或其抗原结合片段，其特征在于，其重链可变区fr1-fr4具有如seq id no.4～7所示的氨基酸序列，轻链可变区fr1-fr4具有如seq id no.12～15所示的氨基酸序列。3.根据权利要求1所述的分离的pd-l1蛋白抗体或其抗原结合片段，其特征在于，重链可变区具有如seq id no.8所示的氨基酸序列，轻链可变区具有如seq id no.16所示的氨基酸序列。4.一种分离的核酸分子，其特征在于，其编码权利要求1～3中任一项所述的分离的pd-l1蛋白抗体或其抗原结合片段。5.生物材料，其特征在于，其包括权利要求4所述的核酸分子，所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。6.权利要求1～3中任一项所述的分离的pd-l1蛋白抗体或其抗原结合片段或权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的生物材料的如下任一种应用：(1)在制备用于检测pd-l1蛋白的试剂或试剂盒中的应用；(2)在制备用于预防或治疗癌症的药物中的应用。7.一种抗体偶联物，其特征在于，其为由权利要求1～3中任一项所述的分离的pd-l1蛋白抗体或其抗原结合片段与载体或药物偶联得到，或者由权利要求1～3中任一项所述的分离的pd-l1蛋白抗体或其抗原结合片段与经化学或生物标记得到。8.根据权利要求7所述的偶联物，其特征在于，所述化学标记包括同位素、胶体金、荧光素、生物素标记；所述生物标记包括蛋白标记、酶标记。9.一种检测试剂，其特征在于，其包括权利要求1～3中任一项所述的分离的pd-l1蛋白抗体或其抗原结合片段或权利要求7或8所述的抗体偶联物。10.一种药物组合物，其特征在于，其包括权利要求1～3中任一项所述的分离的pd-l1蛋白抗体或其抗原结合片段或权利要求7或8所述的抗体偶联物，以及药学上可接受的载剂。

技术总结
本发明属于分子免疫学领域。具体地，涉及一种特异性靶向PD-L1蛋白的抗体，及包括该抗体试剂盒以及其用途。提供一种分离的PD-L1蛋白抗体或其抗原结合片段，其重链可变区的互补决定区CDR1具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，CDR2具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，CDR3具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。轻链可变区的互补决定区CDR1具有如SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列，CDR2具有如SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列，CDR3具有如SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列。的氨基酸序列。的氨基酸序列。


技术研发人员：王桂华 黄昌胜 李润清 华紫秀 李娜 王学齐
受保护的技术使用者：武汉百英诺生物科技有限公司
技术研发日：2023.05.30
技术公布日：2023/8/1