一种产壳聚糖酶的蜡样芽孢杆菌及其发酵工艺和应用

1.本发明涉及微生物发酵工程技术领域，尤其涉及一种产壳聚糖酶的蜡样芽孢杆菌及其发酵工艺和应用。


背景技术：

2.壳聚糖是仅次于纤维素的第二大天然高分子物质，广泛存在于海洋中的虾蟹壳、陆生昆虫，藻类细胞膜，真菌菌丝中。壳聚糖是β-(1,4)糖苷键连接的n-乙酰-2-氨基-2-脱氧-d-葡聚糖，是一种脱乙酰基物质，由乙酰胺基团转化为初级氨基基团形成甲壳素n-去乙酰化衍生物，壳聚糖中含有不稳定的糖苷键，可通过水解得到氨基寡糖素又称(壳寡糖)。壳寡糖水溶性、相容性、安全性较好，壳寡糖在较短的n-葡萄糖胺(n-glc)单元上暴露出阳离子基团，因此具有较高的细胞传导性，可通过肠上皮细胞进行吸收。医学上具有抗氧化、肝保护、抗糖尿病、抗肥胖、抗hiv-1、抗阿尔兹海默症、抗肿瘤、调节机体免疫活性等功能。化学上可制作抗菌敷料用于伤口愈合，可解决农药残留问题，具有螯合重金属的功能、可用于处理废水污染，在多方面具有广阔的应用前景。
3.目前壳寡糖的生产主要有化学酸解法、物理超声波法、物理降解法、生物酶解法。化学酸解壳聚糖过程中不仅残基之间o-糖苷水解，n-乙酰之间的连接也会被水解，存在条件控制较难等问题；物理降解法虽然操作简单，产物纯度高，但产量低，大规模生产受限制；生物酶解法无毒可控，对产物的化学结构无较大影响。是当前较为高效、环保、理想的降解方法，酶解反应条件温和、稳定性高、无环境污染、在经济上实现大规模可持续生产。因此对产壳聚糖酶菌株的探究成为当前的研究热点之一。
4.壳聚糖酶的概念于1973年monaghan等对细菌及真菌研究过程中首次提出，monaghan通过对200种微生物进行研究发现均能降解壳聚糖。产壳聚糖酶来源主要是细菌芽孢杆菌属(bacillus)、沙雷氏属菌(serratia)等，放线菌链霉菌属(streptomyces)、类诺卡氏菌属(nocardioides)等，真菌植物病原真菌fusarium solani。aktuganov gleb e等研究的昆虫致病菌b.thuringiensis var.dendrolimus b-387产壳聚糖酶体外抗真菌细菌活性强，产酶活性为3～12.5u/ml。wangyanxin等研究的水生菌a7-y产内切壳聚糖酶能够降解真菌细胞壁，对抗植物病原菌，在ph5.0和40℃下产酶活性为18u/mg。cahyaningtyas hilmi amanah aditya等研究的从印度尼西亚虾膏种分离出的蜡样芽孢杆菌hmrsc30在最佳条件下，产酶活性为4.85u/ml。现报道的菌株产酶活性大多数酶活较低。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种产壳聚糖酶的蜡样芽孢杆菌及其发酵工艺和应用，为工业中生产壳寡糖提供生物降解菌种，具有较好的应用价值。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
7.本发明提供了一株蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)gxmu-q5.3，于2022年10月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏号为gdmcc no：62890。
8.本发明提供了一种蜡样芽孢杆菌gxmu-q5.3在生产壳聚糖酶中的应用。
9.本发明还提供了一种利用蜡样芽孢杆菌gxmu-q5.3产壳聚糖酶的发酵工艺，包括如下步骤：
10.(1)将所述蜡样芽孢杆菌gxmu-q5.3接种至种子培养基中发酵得种子液；
11.(2)将步骤(1)得到的种子液接种至发酵培养基中培养，得含有壳聚糖酶的发酵菌液。
12.优选的，步骤(1)所述种子培养基以水为溶剂，包括如下浓度的成分：酵母粉2.0～4.0g/l，蛋白胨4.0～6.0g/l，葡萄糖2.0～4.0g/l，(nh4)2so
4 9.0～11.0g/l，k2hpo
4 0.6～0.8g/l，nacl 4.0～6.0g/l，mgso4·
7h2o 0.4～0.6g/l，kh2po
4 0.2～0.4g/l。
13.优选的，步骤(1)中所述发酵是在35～37℃下培养至所述种子液的菌浓度为0.5
×
108cfu/ml～1.0
×
108cfu/ml。
14.优选的，步骤(2)中所述种子液接种至发酵培养基的接种量为1～3％(v/v)。
15.优选的，步骤(2)中所述发酵培养基以水为溶剂，包括如下浓度的成分：麦芽糖0～10g/l，酵母粉0～10g/l，壳聚糖10～20g/l，(nh4)2so49.0～11.0g/l，k2hpo4·
3h2o 1.1～1.7g/l，nacl 4.0～6.0g/l，mgso4·
7h2o 1.1～1.5g/l，kh2po40.1～0.5g/l，ph为7～8。
16.优选的，步骤(2)中所述培养的温度为32～38℃；所述培养的时间为2～4d；所述培养的摇床转速为190～210r/min。
17.本发明还提供了一种利用发酵工艺制备的壳聚糖酶，其中壳聚糖酶为内切型壳聚糖酶。
18.本发明通过单因素试验、plackett-burman试验、正交试验对产酶活性进行优化后得到最佳产酶条件为：麦芽糖浓度5.0g/l、酵母粉浓度5.0g/l、壳聚糖浓度15.0g/l、初始发酵培养基ph6.0、摇床培养发酵时间8h下：菌株gxmu-q5.3产酶活性提高为69.21u/ml与粗酶活39.873u/ml相比提高73.57％，证实菌株发酵条件的优化对产酶活性起到重要作用，优化后碳氮源仅为麦芽糖浓度5.0g/l、酵母粉浓度5.0g/l、壳聚糖浓度15.0g/l，发酵原材料成本低、粘度低，条件易控制，在工业上产上具有较好的应用价值。
附图说明
19.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
20.图1为实施例1中菌株gxmu-q5.3菌落透明圈及形态学鉴定(a：平板透明圈；b：菌落形态；c：革兰氏染色；d：电镜照片)
21.图2为实施例1中基于菌株gxmu-q5.3序列构建的系统发育树；
22.图3为实施例2中碳源的变化对菌株gxmu-q5.3产酶活性的影响；
23.图4为实施例2中麦芽糖浓度的变化对菌株gxmu-q5.3产酶活性的影响；
24.图5为实施例2中氮源的变化对菌株gxmu-q5.3产酶活性的影响；
25.图6为实施例2中酵母粉浓度的变化对菌株gxmu-q5.3产酶活性的影响；
26.图7为实施例2中无机盐的变化对菌株gxmu-q5.3产酶活性的影响；
27.图8为实施例2中ph的变化对菌株gxmu-q5.3产酶活性的影响；
28.图9为实施例2中壳聚糖浓度的变化对菌株gxmu-q5.3产酶活性的影响；
29.图10为实施例2中时间的变化对菌株gxmu-q5.3产酶活性的影响；
30.图11为实施例4中反应温度对酶活性的影响；
31.图12为实施例4中ph对酶活性的影响；
32.图13为实施例4中金属离子对酶活性的影响；
33.图14为实施例4中菌株gxmu-q5.3的底物特异性；
34.图15为实验例1中壳聚糖酶酶解产物薄层层析(a：盐酸氨基葡萄糖；b：壳寡糖；c：反应0min；d：反应5min；e：反应10min；f：反应15min；g：反应20min；g1：盐酸氨基葡萄糖；g2：壳二糖；g3：壳三糖；g4：壳四糖；g5：壳五糖)
35.保藏说明
36.蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)gxmu-q5.3，该菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；保藏时间为2022.10.14；保藏编号为gdmcc no：62890。
具体实施方式
37.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
38.实施例1
39.一种产壳聚糖酶的蜡样芽孢杆菌gxmu-q5.3菌株筛选及鉴定
40.本实施例通过对北海养殖场土样在富集培养基上进行富集培养、在筛选培养基上利用胶体壳聚糖筛选，分离得到4株壳聚糖分解菌，用接种环挑取4株菌的单菌落少许接种至含筛选培养基的平板中进行形态学观察，通过透明圈的大小筛选出透明圈最大的菌株gxmu-q5.3，如图1中a所示，菌株gxmu-q5.3透明圈大小为d/d＝6.96，均大于其他3株菌，测定粗酶液酶活力为：39.873u/ml，因此将gxmu-q5.3作为后续实验菌株。
41.其中，富集培养基(g/l)：壳聚糖5.0，kh2po
4 0.1，(nh4)2so
4 10.0，mgso4·
7h2o 0.007，k2hpo4·
3h2o 0.02，nacl 1.0，ph自然。
42.筛选培养基(g/l)：a：k2hpo
4 0.7，kh2po
4 0.3，mgso4·
7h2o 0.5，feso4·
7h2o 0.01，15～20琼脂，ph8.5。b：1％胶体壳聚糖：a液+b液121℃灭菌后1：1混合后进行倒板。
43.将蜡样芽孢杆菌gxmu-q5.3菌株平板划线于lb，35℃恒温培养24h后，如图1中b所示，观察发现其菌落形态呈现圆形，表面呈现蜡状，颜色为乳白色且不透明，菌落边缘不规则；对菌株进行染色，如图1中c所示，得到的菌落小、革兰氏染色呈阳性；电镜扫描结果显示菌株呈杆状(如图1中d所示)。
44.经进一步生理生化鉴定，如表1所示，菌株gxmu-q5.3甲基红试验、靛基质试验、β-半乳糖苷酶试验、明胶液化试验、吲哚试验鉴定结果为阳性，葡萄糖氧化发酵试验(of试验)、硫化氢实验、氨基酸脱羧酶试验鉴定结果为阴性，显示该菌株为芽孢杆菌属。
45.表1蜡样芽孢杆菌gxmu-q5.3的生理生化鉴定结果
46.项目item结果result革兰氏染色gram staining+
硫化氢试验hydrogen sulfide test-甲基红试验(mr试验)methyl red test+靛基质试验(吲哚试验)indigo test+β-半乳糖苷酶试验β-galactosidase test+葡萄糖氧化发酵试验(of试验)oxidative fermentation of glucose-明胶液化试验gelatin liquefaction test+吲哚试验indole test+氨基酸脱羧酶试验amino acid decarboxylase test-47.挑取lb培养基上的单菌落，置于100μl ep管中，加入35μl chelex-100，置于螺旋振荡仪中震荡30s，99℃恒温水浴20min，12000rpm离心5min取上清1μl作为pcr体系中的模板。使用通用引物(27f和1492r)进行pcr扩增，测序结果利用ezbiocloud数据库进行比对，菌株gxmu-q5.316s rrna比对结果与bacillus cereus 16s rrna的相似性最高，达到99％。
48.用mega7.0软件对菌株gxmu-q5.3的16s rrna序列进行比对分析并构建系统发育树，菌株gxmu-q5.3与bacillus cereus的亲缘关系最近(如图2所示)。
49.综合形态学鉴定、生理生化鉴定、16s rrna序列分析，鉴定菌株为bacillus cereus(蜡样芽孢杆菌)。该菌株已保藏广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏编号：gdmcc no：62890，分类命名为：bacillus cereus。
50.实施例2
51.菌株gxmu-q5.3产酶条件的优化
52.在实施例1筛选培养基的基础上分析单因素的变化对菌株gxmu-q5.3产酶活性的影响，因素包含：碳源(分别添加10g/l的可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、木薯淀粉、麦芽糖、果糖)及对选出最优碳源进行浓度优化(2.0、5.0、10.0、15.0、20.0g/l)、氮源(分别添加10g/l的玉米浆、蛋白胨、大豆粉、尿素、氯化铵、酵母粉)及对选出最优氮源进行浓度(2.0、5.0、10.0、15.0、20.0g/l)、无机盐(分别添加1g/l的mnso4、kcl、mgso4、cacl2、feso4)、壳聚糖浓度(分别添加2.0、5.0、10.0、15.0、20.0g/l)、初始发酵ph(分别调整初始ph为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)、发酵时间(发酵时间分别为24、36、48、60、72、84、96h)。
53.具体实验方法为：
54.(1)以碳源种类为单因素时，分别添加10g/l的可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、木薯淀粉、麦芽糖、果糖，其他成分按照发酵培养基添加，ph7.0，将菌株gxmu-q5.3接种至筛选培养基中，接种量为1％(v/v)，培养温度35℃，发酵时间72h。培养结束后，取发酵液12000r/min离心5min，取上清测定酶活。
55.结果如图3所示，菌株gxmu-q5.3在碳源为麦芽糖时产酶活性较高，酶活为46.75u/ml。因此，选择麦芽糖为菌株产酶的最适碳源。
56.(2)在确定最佳碳源为麦芽糖的基础上，以麦芽糖添加量为实验单因素，将菌株gxmu-q5.3接种至含有不同麦芽糖的(2.0、5.0、10.0、15.0、20.0g/l)发酵培养基(壳聚糖10.0，(nh4)2so410.0，k2hpo4·
3h2o 1.4，nacl 5.0，mgso4·
7h2o 1.3，kh2po40.3，酵母粉3.0，ph自然)中，接种量为2％(v/v)，培养温度35℃，发酵时间72h。培养结束后，取发酵液12000r/min离心5min，取上清测定酶活。
57.结果如图4所示，随着麦芽糖浓度的增加，菌株gxmu-q5.3的产酶活性呈现先上升
后下降的趋势，其中麦芽糖浓度为2.0g/l时产酶活性最高，酶活为53.42u/ml。因此，将2.0g/l麦芽糖浓度定为最佳碳源及最适浓度。
58.(3)以氮源种类为单因素时，分别添加10g/l的玉米浆、蛋白胨、大豆粉、尿素、氯化铵、酵母粉，其他成分按照ph为7.0的发酵培养基添加，将菌株gxmu-q5.3接种至筛选培养基中，接种量为2％(v/v)，在35℃下发酵72h。培养结束后，取发酵液12000r/min离心5min，取上清，测定酶活。
59.结果如图5所示，菌株gxmu-q5.3在以酵母粉为单一氮源下产酶活性最高，酶活为52.37u/ml。因此，选取酵母粉作为最佳氮源。
60.(4)在确定最佳氮源的基础上，以酵母粉的添加浓度为实验单因素，将菌株gxmu-q5.3接种至含有不同浓度的酵母粉(2.0、5.0、10.0、15.0、20.0g/l)的发酵培养基(壳聚糖10.0，(nh4)2so410.0，k2hpo4·
3h2o 1.4，nacl 5.0，mgso4·
7h2o 1.3，kh2po40.3，酵母粉3.0，ph自然)中，接种量为2％(v/v)，在35℃下发酵72h，培养结束后取发酵液，12000r/min离心5min，取上清，测定酶活。
61.结果如图6所示，随着酵母粉浓度的增加，菌株gxmu-q5.3的产酶活性呈现先上升后下降的趋势，当酵母粉浓度为5.0g/l时菌株gxmu-q5.3产酶活性最高，酶活为54.84u/ml。因此，选择5.0g/l酵母粉定为最佳碳源及其最适浓度。
62.(5)以无机盐种类为单因素时，分别添加1g/l的mnso4、kcl、mgso4、cacl2、feso4其他成分按照ph为7.0的发酵培养基添加，将菌株gxmu-q5.3接种至筛选培养基中，接种量为2％(v/v)，在35℃下发酵72h。培养结束后，取发酵液，12000r/min离心5min，取上清，测定酶活。
63.结果如图7所示，菌株gxmu-q5.3在添加无机盐后的酶活水平相差不大，酶活在57u/ml左右。因此可认为无机盐对菌株gxmu-q5.3产酶活性无较大影响。
64.(6)在培养基成分为发酵培养基时以培养基ph为单因素进行试验，分别调整发酵培养基初始ph为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，接种量为2％(v/v)，在35℃下发酵72h。培养结束后，取发酵液，12000r/min离心5min，取上清，测定酶活。
65.结果如图8所示，菌株gxmu-q5.3发酵培养基初始ph《7.0时酶活大幅度减小，酸性条件下对菌株产酶活性影响较大，ph》8.0时酶活骤降，在中性偏碱环境ph7.0～8.0时酶活较高，因此菌株适宜发酵条件中性为偏碱，强酸强碱条件下对其产酶活性影响较大，其中ph7.0时产酶活性最高，酶活为53.74u/ml。因此，将ph7.0作为最佳发酵ph。
66.(7)以壳聚糖浓度为单因素时，分别添加2.0、5.0、10.0、15.0、20.0g/l壳聚糖，其他成分按照ph为7.0的发酵培养基添加，将菌株gxmu-q5.3接种至发酵培养基中，接种量为2％(v/v)，在35℃下发酵72h。培养结束后，取发酵液，12000r/min离心5min，取上清，测定酶活。
67.结果如图9所示，菌株以壳聚糖为底物时，壳聚糖浓度低时产酶活性较低，壳聚糖浓度在15.0～20.0g/l时产酶活性较好。壳聚糖浓度为15.0g/l时产酶活性最高，酶活为57.88u/ml。因此，将壳聚糖浓度15.0g/l定为最佳发酵壳聚糖浓度。
68.(8)在培养基成分为壳聚糖15.0g/l，(nh4)2so410.0g/l，k2hpo4·
3h2o1.4g/l，nacl 5.0g/l，mgso4·
7h2o 1.3g/l，kh2po40.3g/l，酵母粉3.0g/l时，ph为7.0的情况下，以培养时间为单因素，在35℃下进行发酵，分别发酵24、36、48、60、72、84、96h后，取发酵液，12000r/
min离心5min，取上清，测定酶活。。
69.结果如图10所示，菌株gxmu-q5.3产酶活性随着时间的增加而增加，在一定的时间达到最高产酶活后逐渐下降，酶活随着时间的增加而逐渐上升达到最大酶活后下降，84h酶活性最高，酶活为68.45u/ml因此选择84h定为最佳发酵时间。
70.上述酶活测定方法为：3，5二硝基水杨酸(dns)法测定粗酶液的酶活，取1000μl发酵液，12000r/min离心5min，取上清液400μl与等体积1％壳聚糖胶体50℃反应15min，取反应液200μl与300μl dns混合，沸水浴10min离心，取200μl于520nm测量吸光度，规定上述反应条件下1min产生的1μmol还原糖所需的酶量为一个酶活力单位。根据公式进行酶活的计算，单位为u/ml。
71.实施例3
72.在实施例2单因素优化结果的基础上设计plackett-burman试验，对影响gxmu-q5.3菌株产酶活性的7个因素进行设计分别为：碳源浓度(a)、氮源浓度(b)、初始发酵ph(c)、壳聚糖浓度(d)、发酵温度(e)、nacl(f)、发酵时间(g)，挑选置信度≥95％的显著性影响因素，pb试验设计如表2。得到的pb实验结果(如表3所示)。
73.表2pb实验设计因素与水平
[0074][0075]
表3 pb试验回归分析结果
[0076]
方差来源平方和自由度平方和均f值p值显著性model2489.387355.6353.750.0009**a227.171227.1734.330.0042**
b891.381891.38134.720.0003**c804.641804.64121.580.0004**d235.43123.4335.580.0004**e166.131166.1325.110.0074 f80.76180.7612.210.2500 g84.05184.0512.700.0235 [0077]
根据表3中的pb实验结果选取a(碳源)、b(氮源)、c(初始发酵液ph)进行下一步l9(33)正交试验。试验因素水平设计如表4。
[0078]
表4 l9(33)正交实验因素水平设计表
[0079][0080]
表5 l9(33)正交实验结果
[0081][0082]
[0083]
表6 l9(33)正交实验方差分析
[0084]
变异来源ssofmsfp碳源浓度1165.3712582.68551.2040.000氮源浓度325.77729.774.8590.439ph19.5482162.88814.3140.000
[0085]
结果如表5和表6所示。由表6可知，方差分析结果p值越小影响程度越大，综合表5正交实验结果，r表明其中的主次关系，r表示各因素对菌株gxmu-q5.3产酶活性的影响程度，r越大影响越显著，因此在碳源、氮源、初始发酵液ph三个因素中对菌株gxmu-q5.3产酶活性影响的主次关系为a2》b3》c1。优化后最佳发酵组合为5.0g/l酵母粉(氮源)、5.0g/l麦芽糖(碳源)、初始发酵ph6.0。最佳发酵培养基配方为：麦芽糖5.0g/l，酵母粉5.0g/l，壳聚糖15.0g/l，(nh4)2so
4 10.0g/l，k2hpo4·
3h2o 1.4g/l，nacl 5.0g/l，mgso4·
7h2o 1.3g/l，kh2po
4 0.3g/l，发酵初始ph为6.0，在此条件下，菌株gxmu-q5.3在35℃、180r/min条件下发酵72h，酶活可达69.21u/ml。
[0086]
实施例4
[0087]
菌株gxmu-q5.3壳聚糖酶酶学性质研究
[0088]
1、研究温度、ph、金属离子对gxmu-q5.3壳聚糖酶酶活性及稳定性的影响。
[0089]
将菌株gxmu-q5.3的种子液接种至实施例3优化的最佳发酵培养基中，接种量为2％(v/v)，35℃、200r/min下培养84h，得到发酵液。取1ml发酵液12000r/min离心5min，取上清得到粗酶液，粗酶液酶活为69.21u/ml。
[0090]
取粗酶液400μl与等体积1％壳聚糖胶体在不同温度(30、40、50、60、70、80℃)下反应15min，取反应液200μl与300μl dns混合，沸水浴10min离心，取200μl于520nm测量吸光度，测定壳聚糖酶酶活力，确定最佳反应温度。结果如图11所示，最佳反应物温度为60℃。取粗酶液400μl与等体积1％壳聚糖胶体将反应体系ph分别设置为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，在反应温度为60℃条件下反应15min，测定gxmu-q5.3壳聚糖酶在不同ph缓冲液的酶活性，确定最佳反应ph值。结果如图12所示，ph5.0～6.0的相对酶活较高，超过70％，酶的最适反应ph为5.0，此时，酶活最高达96.34u/ml，说明该菌株分泌的为酸性壳聚糖酶。
[0091]
在反应温度为60℃，反应的ph为6.0的条件下，先将壳聚糖粗酶液置于终浓度为1％(m/v)不同金属离子(mg
2+
、na
+
、fe
2+
、ca
2+
、zn
2+
、k
+
、cu
2+
、al
3+
)放置2h后，再测定酶活，以最高酶活为100％，计算不同金属离子处理的相对酶活，。结果如图13所示，发现fe
3+
对酶活有限制促进作用；mn
2+
存在时相对酶活高于60％，对酶反应起到一定的促进作用而al
3+
、cu
2+
存在时相对酶活较低，因此，对酶具有明显的抑制作用。
[0092]
2、菌株gxmu-q5.3产壳聚糖酶的底物特异性
[0093]
将菌株gxmu-q5.3产的壳聚糖酶与不同的反应底物1％胶体壳聚糖、1％羧甲基纤维素钠、可溶性淀粉、不可溶性壳聚糖、葡萄糖按照体积比1：1混合放置2h，取上清液400μl与等体积ph为6.0的1％壳聚糖胶体，60℃反应15min，取反应液200μl与300μl dns混合，沸水浴10min离心，取200μl于520nm测量吸光度，2h，测定相对酶活，以最高酶活为100％。结果如图14所示，以1％的胶体壳聚糖为底物时相对酶活最高，酶活达到59.87u/ml；而在1％羧甲基纤维素钠、可溶性淀粉、葡萄糖、不可溶性壳聚糖中的相对酶活都较低，酶解能力较差。因此菌株gxmu-q5.3产壳聚糖酶具有专一性水解壳聚糖能力。
[0094]
实施例5
[0095]
一种利用蜡样芽孢杆菌gxmu-q5.3产壳聚糖酶的发酵工艺，包括以下步骤：
[0096]
将实施例1得到的蜡样芽孢杆菌gxmu-q5.3以接种至种子培养基在37℃下培养至种子液的菌浓度为1.0
×
108cfu/ml，得到种子液备用；
[0097]
其中种子培养基以水为溶剂，包括以下浓度的组分：酵母粉3.0g/l，蛋白胨5.0g/l，葡萄糖3.0g/l，(nh4)2so410.0g/l，k2hpo40.7g/l，nacl 5.0g/l，mgso4·
7h2o 0.5g/l，kh2po40.3g/l，ph自然。
[0098]
将种子液以2％(v/v)的接种量接种至发酵培养基中，在35℃下以200r/min发酵84h，得到发酵菌液。
[0099]
其中发酵培养基以水为溶剂，包括以下浓度的组分：麦芽糖5.0g/l，酵母粉5.0g/l，壳聚糖15.0g/l，(nh4)2so410.0g/l，k2hpo4·
3h2o 1.4g/l，nacl 5.0g/l，mgso4·
7h2o 1.3g/l，kh2po40.3g/l，发酵初始ph为6.0。。
[0100]
将发酵菌液在12000r/min离心5min，取上清得到粗酶液，取2ml粗酶液，按70％饱和度加入硫酸铵粉末，于4℃过夜，10000r/min、4℃离心30min，收集沉淀，加入等体积0.02mol/l、ph6.0的磷酸盐缓冲液放入4℃保存。
[0101]
3，5二硝基水杨酸(dns)法测定酶液的酶活，分别取两组600μl发酵菌液，作为实验组、对照组。其中对照组直接沸水浴10min，8000r/min离心5min，取上清液400μl与等体积1％壳聚糖胶体50℃反应15min后，取反应液200μl与300μl dns混合，沸水浴10min离心，取200μl于520nm测量吸光度，(实验组不进行第一步的沸水浴处理，直接8000r/min离心5min，其他步骤与对照组一致)，规定上述反应条件下1min产生的1μmol还原糖所需的酶量为一个酶活力单位。根据公式进行酶活的计算，单位为u/ml。
[0102]
实验例1
[0103]
tlc法测定菌株gxmu-q5.3壳聚糖酶产物
[0104]
以1％胶体壳聚糖为底物，与实施例5中制备得到的硫酸铵沉淀纯化后的酶液按照体积比1：1混合，分别反应0、5、10、15、20min后，进行沸水浴5min，8000r/min离心10min，取上清。
[0105]
用毛细管于硅胶板上点样(多次少量点样，待上一次点样干后方可进行下一次点样)，点样结束后，将硅胶板置于层析杠中，加入展层剂(异丙醇:氨水＝2:1,v/v)缓慢展开。层析液离硅胶板上边缘1cm处时层析结束，将硅胶板从层析杠中取出吹干，均匀喷涂1％茚三酮溶液，110℃烘干5min后显色处理。结果如图15所示，通过tlc(薄层层析)对酶降解壳聚糖酶的产物进行分析，随着反应时间增加，酶解产物大多为三糖、四糖，少数为二糖，随着时间的增加逐渐被水解为二糖，但多数为三糖、四糖，表明菌株gxmu-q5.3产壳聚糖为一种内切型壳聚糖酶。
[0106]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一株蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)gxmu-q5.3，于2022年10月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏号为gdmccno：62890。2.权利要求1所述蜡样芽孢杆菌gxmu-q5.3在生产壳聚糖酶中的应用。3.一种利用权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌gxmu-q5.3产壳聚糖酶的发酵工艺，其特征在于，包括如下步骤：(1)将所述蜡样芽孢杆菌gxmu-q5.3接种至种子培养基中发酵得种子液；(2)将步骤(1)得到的种子液接种至发酵培养基中培养，得含有壳聚糖酶的发酵菌液。4.如权利要求3所述的发酵工艺，其特征在于，步骤(1)所述种子培养基以水为溶剂，包括如下浓度的成分：酵母粉2.0～4.0g/l，蛋白胨4.0～6.0g/l，葡萄糖2.0～4.0g/l，(nh4)2so49.0～11.0g/l，k2hpo40.6～0.8g/l，nacl4.0～6.0g/l，mgso4·
7h2o0.4～0.6g/l，kh2po40.2～0.4g/l。5.如权利要求4所述的发酵工艺，其特征在于，步骤(1)中所述发酵是在35～37℃下培养至所述种子液的菌浓度为0.5
×
108cfu/ml～1.0
×
108cfu/ml。6.如权利要求5所述的发酵工艺，其特征在于，步骤(2)中所述种子液接种至发酵培养基的接种量为1～3％(v/v)。7.如权利要求6所述的发酵工艺，其特征在于，步骤(2)中所述发酵培养基以水为溶剂，包括如下浓度的成分：麦芽糖0～10g/l，酵母粉0～10g/l，壳聚糖10～20g/l，(nh4)2so49.0～11.0g/l，k2hpo4·
3h2o1.1～1.7g/l，nacl4.0～6.0g/l，mgso4·
7h2o1.1～1.5g/l，kh2po40.1～0.5g/l，ph为7～8。8.如权利要求7所述的发酵工艺，其特征在于，步骤(2)中所述培养的温度为32～38℃；所述培养的时间为2～4d；所述培养的摇床转速为190～210r/min。9.一种按照权利要求3～8任一项所述的发酵工艺制备的壳聚糖酶，其特征在于，所述壳聚糖酶为内切型壳聚糖酶。

技术总结
本发明涉及微生物发酵工程技术领域，尤其涉及一种产壳聚糖酶的蜡样芽孢杆菌及其发酵工艺和应用。一株蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)GXMU-Q5.3，于2022年10月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏号为GDMCCNO：62890。本发明还涉及蜡样芽孢杆菌GXMU-Q5.3在生产壳聚糖酶中的应用。本发明为工业中生产壳寡糖提供生物降解菌种，菌株产酶活性高达69.21U/mL，高于目前的产壳聚糖酶菌株的酶活，产酶优势强，在工业生产壳寡糖上有较好的应用潜力。糖上有较好的应用潜力。糖上有较好的应用潜力。


技术研发人员：申乃坤 梁颖 张红岩 刘睿 谢俊杰 殷豆豆 姜明国 杨可欣 许霞 张重庆
受保护的技术使用者：广西民族大学
技术研发日：2023.05.24
技术公布日：2023/8/2